氧合血體外持續(xù)灌注保存對(duì)豬供肺移植后功能的影響

黃愛(ài)蘭，韋慧君，龍小毛，胡彥艷，江曉歡

(1廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院，南寧 530021；2廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院；3玉林市第一人民醫(yī)院)

氧合血體外持續(xù)灌注保存對(duì)豬供肺移植后功能的影響

黃愛(ài)蘭1，韋慧君2，龍小毛1，胡彥艷1，江曉歡3

(1廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院，南寧 530021；2廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院；3玉林市第一人民醫(yī)院)

目的 觀察氧合血體外持續(xù)灌注保存對(duì)豬供肺移植后功能的影響。方法 將24只廣西巴馬小型香豬隨機(jī)分為觀察組與對(duì)照組各12只，每組供體、受體各6只。手術(shù)切除觀察組與對(duì)照組供體雙側(cè)肺，分別經(jīng)氧合血體外持續(xù)灌注保存、低溫靜態(tài)保存各8 h，后將供體左肺分別移植入兩組切除左肺的受體。比較兩組再灌注0.5、2、4、6 h時(shí)左下肺靜脈氧合指數(shù)(PaO2/FiO2)，HE染色觀察兩組供肺保存前(T0)、供肺保存8 h(T1)、再灌注3 h(T2)和再灌注6 h(T3)左下肺肺組織病理。結(jié)果 觀察組再灌注0.5、2、4、6 h時(shí)左下肺靜脈PaO2/FiO2分別為(482.50±30.72)、(467.17±31.06)、(441.17±17.86)、(422.33±46.45)mmHg，對(duì)照組分別為(413.83±18.53)、(389.67±7.28)、(313.67±24.53)、(308.50±50.45)mmHg，觀察組再灌注6 h與本組再灌注0.5 h時(shí)相比，對(duì)照組再灌注4、6 h與本組再灌注0.5 h時(shí)相比，兩組再灌注各時(shí)點(diǎn)相比，P均﹤0.05。兩組隨再灌注時(shí)間延長(zhǎng)，肺間質(zhì)逐漸增寬，肺泡組織結(jié)構(gòu)逐漸塌陷，肺泡水腫逐漸明顯，肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)滲出物，且對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)損傷在同一時(shí)間點(diǎn)比觀察組重，T3時(shí)對(duì)照組肺組織水腫分級(jí)比觀察組高(P﹤0.05)。結(jié)論 氧合血體外持續(xù)灌注保存豬供肺移植后肺氧合功能穩(wěn)定、組織結(jié)構(gòu)較完整。

肺移植；供體保存；氧合血；體外持續(xù)灌注保存；低溫靜態(tài)保存；缺血再灌注損傷；肺功能；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

肺移植是終末期肺疾病患者挽救生命的有效手段[1]。隨著肺移植手術(shù)技術(shù)和圍術(shù)期管理水平的不斷改進(jìn)，肺移植患者的存活率明顯提高[2]，但缺血再灌注損傷仍是導(dǎo)致肺移植患者術(shù)后早期出現(xiàn)嚴(yán)重肺功能障礙甚至早期死亡的主要原因[3]。有研究表明減輕肺缺血再灌注損傷與供肺保存效果呈正相關(guān)[4]，供肺保存質(zhì)量是關(guān)乎移植后肺功能好壞的一個(gè)重要因素[5,6]。目前離體肺保護(hù)方式有經(jīng)典肺保護(hù)方法“深低溫肺保護(hù)液靜態(tài)保存法”、深低溫靜態(tài)保存結(jié)合離體肺體外灌注技術(shù)(EVLP)、經(jīng)肺動(dòng)脈體外持續(xù)灌注氧合血保存并運(yùn)輸離體供肺。目前傳統(tǒng)的低溫離體肺保護(hù)方式仍然存在嚴(yán)重的缺血再灌注損傷，氧合血體外持續(xù)灌注保存離體肺是否可減輕這種損傷尚無(wú)定論。前期研究[7]已成功建立氧合血體外持續(xù)灌注裝置模型，但體外評(píng)估仍不能完全模擬肺移植后體內(nèi)復(fù)雜的炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)[8]，其所得到的體外評(píng)估結(jié)果并不能完全反映移植后的情況。2015年1月～2016年5月，本實(shí)驗(yàn)擬在前期研究的基礎(chǔ)上，觀察氧合血體外持續(xù)灌注保存對(duì)豬供肺移植后功能的影響，并與低溫靜態(tài)保存進(jìn)行比較?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑、儀器 24只健康廣西巴馬小型香豬(廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)研究院提供)，麻醉機(jī)(Ohmeda，美國(guó))，多功能監(jiān)護(hù)儀(Dash4000，GE)，i-START手持式血液血?dú)夥治鰞x(廣州Biotec)，體外循環(huán)機(jī)(STOCERT-SCⅡ型，德國(guó))，膜肺(Dideco-901兒童型，德國(guó))，Celsior液(Sigma公司)，白細(xì)胞過(guò)濾器(H20044758，中國(guó)威高高分子制品公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及處理 將24只豬隨機(jī)分為觀察組與對(duì)照組各12只，每組供體、受體各6只，豬齡2～4月，雌雄不限，體質(zhì)量11～13 kg。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)由同一組胸外科醫(yī)生和麻醉科醫(yī)生共同完成。

1.2.1 供肺獲取 所有供體豬術(shù)前禁飲禁食8 h。在麻醉誘導(dǎo)(氯胺酮10 mg/kg、咪達(dá)唑侖0.5 mg/kg、阿托品0.05 mg/kg肌注)生效后，仰臥位固定于動(dòng)物手術(shù)臺(tái)上。開(kāi)放耳緣靜脈，插管前靜脈注射咪達(dá)唑侖0.1 mg/kg、枸櫞酸舒芬太尼注射液0.5 μg/kg，氣管插管后連接呼吸機(jī)(參數(shù)：吸入氧濃度50%，潮氣量8～10 mL/kg，頻率20～22次/min，呼氣末正壓通氣5 cmH2O)，維持呼氣末二氧化碳為35～45 mmHg。同時(shí)靜脈復(fù)合鎮(zhèn)靜止痛藥進(jìn)行術(shù)中維持[舒芬太尼0.6 μg/(kg·h)、丙泊酚5～6 mL/(kg·h)、順苯磺酸阿曲庫(kù)銨0.1 mg/(kg·h)]。胸骨正中切口，于主動(dòng)脈前壁插入內(nèi)徑3 mm灌注管肝素化后放血保存，供體外循環(huán)預(yù)充用。將左心房切開(kāi)，經(jīng)肺總動(dòng)脈注入冷肺保護(hù)液Celsior液60 mL/kg，在保持正常機(jī)械通氣的條件下，于肺膨脹50%時(shí)，鉗夾隆突上氣管并斷離，完整切除氣管及雙側(cè)肺備供體肺。

1.2.2 供肺保存 對(duì)照組將已修剪好的雙肺置于4 ℃ Celsior肺保護(hù)液中保存，靜態(tài)保存8 h。觀察組供肺氧合血體外持續(xù)灌注保存。供體肺取出后用5-0滑線將12 F動(dòng)脈灌注管固定于左右肺動(dòng)脈內(nèi)，將肺置于漏斗狀容器中，灌注流出的靜脈血通過(guò)漏斗引流入回流管道。體外循環(huán)預(yù)充液由自體血(已使用白細(xì)胞過(guò)濾器去除白細(xì)胞)和林格液組成，預(yù)充后紅細(xì)胞壓積>20%，灌注壓力15～20 mmHg，膜肺供氧氣體配比參照N286%、O28%、CO26%[9]進(jìn)行調(diào)整，血?dú)庋醴謮罕３衷?0 mmHg，二氧化碳分壓保持在35～45 mmHg，36 ℃常溫體外持續(xù)灌注8 h。

1.2.3 受體左肺切除與肺植入 取受體豬，麻醉方法同供體豬。受體豬取右半臥位，左側(cè)第4/5肋間進(jìn)胸，肝素化后分別在左肺上、下肺靜脈根部、左肺總動(dòng)脈根部及左總支氣管根部上阻斷鉗，在遠(yuǎn)端斷離切除左肺。將已修整好的兩組供體左肺移植入受體豬，吻合順序如下[10]：吻合供受體左總支氣管，用4-0 Prolene線連續(xù)吻合膜部，間斷縫合軟骨部，5-0 Prolene線連續(xù)縫合供受體左肺總動(dòng)脈；4-0 Prolene線連續(xù)縫合供受體左肺靜脈前庭；吻合完成后開(kāi)放血管，將6 F的T管置入左肺靜脈前庭吻合口內(nèi)，供抽左肺靜脈血查血?dú)庥?。術(shù)后縫合切口，全麻機(jī)械通氣，密切監(jiān)測(cè)生命體征，保存呼吸道清潔通暢。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按照《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》進(jìn)行妥善處理[10]。手術(shù)過(guò)程實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生命體征平穩(wěn)，全部受體豬在移植肺恢復(fù)灌注后均在機(jī)械通氣輔助下存活至6 h后。

1.3 觀察指標(biāo) ①比較兩組氣管吻合時(shí)間、肺動(dòng)脈阻斷時(shí)間和術(shù)中出血量。②分別在再灌注0.5、2、4、6 h取0.5 mL左下肺靜脈血行血?dú)夥治?，比較兩組左下肺靜脈氧合指數(shù)(PaO2/FiO2)。③在供肺保存前(T0)、供肺保存8 h(T1)、再灌注3 h(T2)和再灌注6 h(T3)分別拆除胸部手術(shù)切口縫線暴露肺組織，切取0.1 g移植左下肺肺組織留病理，然后5-0 Prolene線縫合肺至不漏氣，用10%甲醛固定24 h，石蠟包埋，HE染色觀察組織結(jié)構(gòu)。由兩位資深病理科醫(yī)師根據(jù)獨(dú)立、雙盲的原則進(jìn)行病理閱片，觀察肺組織結(jié)構(gòu)的變化及肺泡腔、毛細(xì)血管的改變。用普通光學(xué)顯微鏡在一張玻片上連續(xù)看10個(gè)高倍(20×10倍)視野，對(duì)每個(gè)視野肺水腫面積進(jìn)行估計(jì)，取其平均值。瀏覽整個(gè)切片，根據(jù)肺泡腔滲出情況進(jìn)行肺水腫分級(jí)[7]，0級(jí)：無(wú)滲出；Ⅰ級(jí)：散在肺泡腔出現(xiàn)少量水腫液及紅細(xì)胞；Ⅱ級(jí)：肺泡內(nèi)充滿水腫液的單一病灶或大量未充滿水腫液的病灶；Ⅲ級(jí)：大量充滿水腫液或紅細(xì)胞的肺泡病灶；Ⅳ級(jí)：彌漫性肺泡水腫出血，大片出血或?qū)嵸|(zhì)、血管壞死。

2 結(jié)果

2.1 兩組氣管吻合時(shí)間、肺動(dòng)脈阻斷時(shí)間、術(shù)中出血量比較 兩組氣管吻合時(shí)間、肺動(dòng)脈阻斷時(shí)間、術(shù)中出血量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

表1 兩組氣管吻合時(shí)間、肺動(dòng)脈阻斷時(shí)間、術(shù)中出血量比較

2.2 兩組再灌注不同時(shí)點(diǎn)左下肺PaO2/FiO2比較 見(jiàn)表2。

表2 兩組再灌注不同時(shí)點(diǎn)左下肺PaO2/FiO2比較

注：與對(duì)照組比較，aP﹤0.01；與同組再灌注0.5 h時(shí)比較，bP﹤0.05。

2.3 兩組左下肺組織病理觀察結(jié)果 豬供肺T0時(shí)肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺間質(zhì)無(wú)增寬，肺泡腔內(nèi)無(wú)出血，肺組織無(wú)水腫。T1時(shí)，觀察組、對(duì)照組肺泡結(jié)構(gòu)基本完整，少部分肺間質(zhì)稍增寬，肺泡腔內(nèi)無(wú)水腫液。T2時(shí)，觀察組肺間質(zhì)均勻增厚，約10%肺組織肺泡腔內(nèi)有水腫液；對(duì)照組肺組織病變較觀察組更為明顯，10%～20%肺組織肺泡腔內(nèi)有水腫液。T3時(shí)，觀察組肺間質(zhì)進(jìn)一步增寬，部分肺泡融合，20%～30%肺組織肺泡腔內(nèi)有水腫液；對(duì)照組肺組織病變嚴(yán)重且彌漫，肺泡腔內(nèi)滲出明顯，可見(jiàn)肺泡腔完全閉塞甚至實(shí)變，30%～40%肺組織肺泡腔內(nèi)有明顯水腫液。兩組肺組織水腫分級(jí)見(jiàn)表3。

表3 兩組肺組織水腫分級(jí)(只)

注：兩組T3時(shí)肺組織水腫分級(jí)比較，P﹤0.05。

3 討論

肺移植是治療晚期肺實(shí)質(zhì)及肺血管疾病的惟一有效治療方法。隨著外科移植技術(shù)、圍術(shù)期管理水平和免疫抑制劑的快速發(fā)展，臨床上對(duì)供肺保存質(zhì)量和時(shí)間的要求越來(lái)越高，供肺保存質(zhì)量對(duì)肺移植是否成功起著關(guān)鍵性的作用。低溫靜態(tài)保存為傳統(tǒng)供肺保存方法，但存在以下不足：①器官缺血使內(nèi)皮細(xì)胞被激活而產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，形成氧化物最終導(dǎo)致細(xì)胞通透性增加；②低溫使鈉、鉀泵失活，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹；③形成微血栓，阻礙再灌注后血流微循環(huán)的恢復(fù)；④激活炎癥細(xì)胞釋放IL-1β、IL-8等因子，促發(fā)再灌注受體強(qiáng)烈的炎性反應(yīng)；⑤低溫對(duì)細(xì)胞代謝的抑制，使供體在保存過(guò)程中喪失了自我修復(fù)能力[12]。

為減輕供體時(shí)間依賴性缺血再灌注損傷、延長(zhǎng)供體器官保存時(shí)間并提高供肺保存質(zhì)量，學(xué)者們?cè)谄鞴俦４娣矫娌粩鄤?chuàng)新[13]，提出了體外持續(xù)灌注保存供體這一新理念。體外持續(xù)灌注氧合血保存克服了低溫靜態(tài)保存缺血、缺氧和低溫對(duì)供肺造成損傷的不足，避免長(zhǎng)時(shí)間的冷缺血損傷，恢復(fù)了離體肺循環(huán)。離體肺體外灌注技術(shù)EVLP在2001年第一次使用于臨床，并獲得良好的肺移植效果，目前在全世界許多肺移植中心得到有效應(yīng)用[14]。該系統(tǒng)主要用于修復(fù)邊緣肺、擴(kuò)大肺源，其灌注液成分復(fù)雜，過(guò)程中需要呼吸機(jī)進(jìn)行機(jī)械通氣，目前只能在一些較大的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行操作[15]。作為呼吸器官，肺臟能直接從肺泡內(nèi)獲得氧氣。同時(shí)，肺組織有兩套血液循環(huán)系統(tǒng)，分別是功能血管(肺動(dòng)、靜脈)和營(yíng)養(yǎng)血管(支氣管動(dòng)、靜脈)，兩者之間有毛細(xì)血管網(wǎng)互相吻合。單純使用氧合血經(jīng)肺動(dòng)、靜脈體外連續(xù)灌注離體供肺，理論上氧合血也會(huì)通過(guò)毛細(xì)血管網(wǎng)維持肺組織和支氣管氧供及營(yíng)養(yǎng)，減輕供肺時(shí)間依賴性缺血再灌注損傷。臨床上肺缺血再灌注損傷的主要表現(xiàn)為肺水腫及急性呼吸衰竭。肺缺血和再灌注過(guò)程必然導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷，繼而肺血管通透性增加，正常的肺血屏障遭到破壞，最終導(dǎo)致血管內(nèi)滲出增多伴大量蛋白漏出血管外形成肺水腫。肺泡水腫的直接后果是導(dǎo)致肺氣體交換功能下降、氧合指數(shù)降低[16]。有學(xué)者指出，肺水腫的程度與供肺保存質(zhì)量呈反比[17]。

本研究結(jié)果表明隨再灌注時(shí)間延長(zhǎng)，兩組移植肺左下肺PaO2/FiO2均逐漸下降，觀察組各時(shí)點(diǎn)PaO2/FiO2高于對(duì)照組。本研究病理結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的肺缺血再灌注損傷早期形態(tài)改變一致[10]，且同一時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)損傷比觀察組重、T3時(shí)點(diǎn)對(duì)照組肺組織水腫分級(jí)比觀察組高。說(shuō)明供肺分別經(jīng)過(guò)不同的保存方法保存后移植入受體，均經(jīng)歷缺血和再灌注損傷的過(guò)程，氧合能力均受到影響，但氧合血體外持續(xù)灌注保存與低溫靜態(tài)保存相比，前者保護(hù)了氣血屏障，內(nèi)皮損傷更輕，能使供肺移植后保持更為穩(wěn)定的氣血交換功能。氧合血體外持續(xù)灌注保存在體外灌注期間能帶走聚集在肺內(nèi)的氧自由基、激活的炎性因子和微栓等，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞起到保護(hù)作用。同時(shí)，已去除白細(xì)胞的氧合血提供器官所需代謝底物，維持了正常的酸堿平衡及滲透壓。紅細(xì)胞能供給供肺所需要的氧氣，攜帶組織內(nèi)所產(chǎn)生的二氧化碳，改善細(xì)胞有氧代謝，保護(hù)上皮功能，減少對(duì)肺泡表面活性物質(zhì)的損傷，進(jìn)而有利于肺移植手術(shù)。

綜上可見(jiàn)，氧合血體外持續(xù)灌注保存豬供肺移植后肺氧合功能穩(wěn)定、組織結(jié)構(gòu)較完整。但本實(shí)驗(yàn)樣本量少且觀察時(shí)間較短，后期需進(jìn)一步證實(shí)。

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Effect of ex vivo oxygenated blood continuous perfusion on pulmonary function in pigs after lung transplantation

HUANGAilan1,WEIHuijun,LONGXiaomao,HUYanyan,JIANGXiaohuan

(1ThePeople′sHospitalofGuangxiZhuangAutonomousRegion,Nanning530021,China)

Objective To observe the effect of ex vivo oxygenated blood continuous perfusion on lung function in pigs after lung transplantation.Methods Twenty-four Guangxi miniature pigs were randomly divided into the observation group and the control group, and each group had 6 donors and 6 receptors. After being completely resected, bilateral lungs of the donors were preserved by ex vivo oxygenated blood continuous perfusion and static cold storage for eight hours, respectively, and then the left lungs were transplanted into the receptors. We compared the PaO2/FiO2of the left lower pulmonary vein between the observation group and the control group at 0.5, 2, 4, 6 h after reperfusion. Using HE staining to observe the pulmonary tissues, which were collected at the time of before preserving (T0), after eight hours saved (T1), three (T2) and six (T3) hours after reperfusion.Results The PaO2/FiO2of the left lower pulmonary vein were (482.50±30.72), (467.17±31.06), (441.17±17.86), and (422.33±46.45) mmHg in the observation group, versus (413.83±18.53), (389.67±7.28), (313.67±24.53), and (308.50±50.45) mmHg in the control group, at 0.5, 2, 4, 6 h after reperfusion, respectively. There were significant differences between 6 h and 0.5 h in observation group, between 4 h, 6 h and 0.5 h in the control group as well as between these two groups at each time point (allP<0.05). Pathological examination showed that, as the time went by, alveolar interval became wider gradually, alveolar structure gradually collapsed, alveolar edema got obvious, and exudation was seen in the alveolar cavity. The organization structure of pulmonary tissue in the control group changed worse than that in the observation group, and the pulmonary edema grading of the control group was higher than that of the observation group at T3(P<0.05).Conclusion The donor lungs after being protected with ex vivo oxygenated blood continuous perfusion can obtain a better oxygenation and maintain a relatively complete structure of lung tissues.

lung transplantation; donor preservation; oxygenated blood; ex vivo continuous lung perfusion storage; cold static storage; ischemia-reperfusion injury; lung function; animal experiment

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81360020)。

黃愛(ài)蘭(1967 -)，女，碩士，主任醫(yī)師，主要從事體外循環(huán)血液保護(hù)的研究。E-mail: 1724835526@qq.com

韋慧君(1990-)，女，碩士，住院醫(yī)師，主要從事體外循環(huán)血液保護(hù)的研究。E-mail: 469645078@qq.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.22.002

R617

A

1002-266X(2017)22-0005-04

2017-04-23)