飛行時間質譜技術及其在植物多酚鑒定中的應用

李葦舟 - 明 建,2 ,2 肖星凝 - 石 芳 李 謠

(1. 西南大學食品科學學院，重慶 400715；2. 重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶 400715)

飛行時間質譜技術及其在植物多酚鑒定中的應用

李葦舟1LIWei-zhou1明 建1,2MINGJian1,2肖星凝1XIAOXing-ning1石 芳1SHIFang1李 謠1LIYao1

(1. 西南大學食品科學學院，重慶 400715；2. 重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶 400715)

飛行時間質譜技術因具有檢測精度高、使用范圍廣、分析速度快等優點，被廣泛應用于食品、生物醫藥、環境檢測等領域，飛行時間質譜與多種技術串聯使用在多酚結構鑒定中發揮著重要作用。文章綜述了飛行時間質譜技術在植物多酚結構鑒定中的應用，以期為植物多酚研究提供一定參考。

飛行時間質譜；多酚；結構鑒定

植物多酚是一類廣泛存在于植物中，具有一個或多個酚羥基結構的次生代謝產物[1-3]。多酚由于能有效地清除體內過多自由基，從而表現出較強抗氧化活性[2-4]。但各植物多酚結構組成不同，導致其抗氧化能力不同，因此，研究植物多酚成分及結構對于研究其生理功能和作用機制具有重要意義。

常用鑒定多酚組分及結構的方法有高效液相色譜、核磁共振、質譜等，高效液相色譜(High performance liquid chromatography，HPLC)因靈敏度和檢測限的限制而只能用于分析低分子量的多酚，對高分子量、結構復雜的多酚分析效果不理想；核磁共振(Nuclear magnetic resonance，NMR)雖具有鑒定分離出單寧聚合物的強大結構解析能力，但由于成本高、樣品處理復雜、測定結果會被糖配體干擾，且靈敏度低，導致其使用受到限制[5]。質譜(Mass spectrum，MS)技術作為一種主要分析分子化學結構的技術，具有分辨率高、分析速度快、檢測范圍廣等優點，被認為是分析植物多酚的理想工具和手段，飛行時間質譜(Time of flight mass spectrometry，TOF-MS)作為其中重要的一類，在多酚研究中有不可替代的作用。

本文概述了飛行時間質譜工作原理及其串聯技術應用的必要性，從酚酸、黃酮、原花色素3個方面綜述了飛行時間質譜及其串聯技術在植物多酚結構鑒定中的應用。

1 飛行時間質譜及其串聯技術

1.1 飛行時間質譜工作原理

飛行時間質譜(Time of flight mass spectrometry，TOF-MS)是利用動能相同而質荷比不同的離子在恒定電場中運動，經過恒定距離所需時間不同，對物質成分或結構進行解析的一種分析方法。其在理論上對分析對象沒有質量范圍限制，有較高分辨能力(55 000 FWHM)和微秒級采集速度(4 GHz/s)[6]，能夠獲得樣品的全掃描質譜圖和精確質量數(精度達5～10 mg/kg)[7]，并能通過精確質量數推測獲得化合物分子式[5]。

常見的飛行時間質譜儀有線性式和反射式兩種[8]。線性式飛行時間質譜的工作原理[見圖1(a)]：被測樣品離子化后經過電場加速，不同質量的離子獲得相同的動能E[式(1)]，然后憑慣性穿越長為L的無場區到達檢測器，根據式(2)，質荷比m/q大的飛行時間比m/q小飛行時間長，從而將不同質量數的離子分離并檢測[9]15-16。

圖1 飛行時間質譜工作原理圖Figure 1 Working principle of TOF-MS

(1)

(2)

式中：

E——離子在加速電場中獲得的動能，J；

m——離子質量，g；

v——進入無場區時離子速度，m/s；

q——離子電荷量，C；

U——加速電場電壓，V；

T——離子在無場區中的飛行時間，s；

L——離子在無場區中的飛行距離，m。

然而，由于線性式飛行時間質譜分辨率不高，不易得到精確分子量，為了改善線性式的不足，人們運用反射式飛行時間質譜對樣品進行檢測，提高了分辨率和分子量測定的精度。其原理[見圖1(b)]：高動能離子比低動能離子穿入反射器更深一些，適當的反射器電壓，可使相同質量數動能不同的離子經反射后同時到達檢測器，從而使其分辨率和分子量測定的精度都得到了提高。許多儀器同時具備線性式和反射式兩種工作方式。

1.2 飛行時間質譜串聯技術

飛行時間質譜技術首先需要離子源使樣品離子化再進入電場中加速。早期飛行時間質譜由于分辨率較低，離子化時如何使粒子分流與霧化、如何盡可能去除溶劑等問題未得到解決，導致其發展受到限制[9]16-18。20世紀90年代以來，新型軟電離技術電噴霧離子化電離(Electrospray ionization ionization，ESI)、大氣壓下碰撞電離或大氣壓化學電離(Atmospheric pressure chmical iosziaa-lion，APCI)和基質(體)輔助激光解吸電離(Matrix assisted laser desorption ionization，MALDI)技術的產生促進了飛行時間質譜儀的發展[10]。其中，電噴霧離子源(ESI)在快速無損分析方面具有獨特的優勢[11]，不僅可以產生多電荷離子，而且可以產生多電荷母離子的子離子，從而獲得更多結構信息。

飛行時間質譜與離子源結合后，再與氣相色譜(Gas chromatography，GC)、超高效液相色譜(Ultra performance liquid chromatography，UPLC)、四極桿(Quadrupole，Q)等儀器技術串聯，提高了檢測的準確性，從而更全面地鑒定樣品成分，飛行時間質譜的多級聯用技術已成為基因及基因組學、蛋白質及蛋白質組學、病毒學等研究領域中的重要分析手段[12]。其串聯方式及相關應用見表1。

表1 飛行時間質譜與其他檢測儀器串聯方式及應用Table 1 Modes and applications of TOF-MS with other testing instruments in tandem

2 飛行時間質譜技術在植物多酚類化合物鑒定中的應用

目前，各種分離技術(高效液相色譜法、氣相色譜法、毛細管電泳法)同飛行時間質譜技術串聯作為一種有效的識別方法，被越來越廣泛地應用于多酚結構鑒定中[26]。研究[27-28]表明，液相色譜與飛行時間質譜聯用(LC—TOF-MS)技術已成為多酚成分分析的強大解析工具，通過液相初步得出多酚的成分組成，然后對于出現的特殊峰利用飛行時間質譜進行檢測，根據得到的離子碎片信息鑒定多酚的結構。如利用液相色譜電噴霧電離飛行時間質譜(HPLC—ESI—TOF-MS)技術在杏仁皮的提取物中共檢測到23種多酚類化合物[29]；利用超高效液相色譜—四級桿—飛行時間質譜(UPLC—Q—TOF-MS/MS)技術在印度綠葉蔬菜Merremiaemarginata中檢測到29種已知和19種未知的多酚類化合物[30]；通過液相色譜混合動力飛行時間質譜(HPLC—IT—TOF-MS)技術在桑白皮葉中檢測到22種酚類化合物，其中11種酚類化合物在桑白皮葉中為首次報道[31]。

2.1 酚酸類化合物的鑒定

植物中富含酚酸類物質，在對其成分進行分析鑒定時，最常用到的方法是HPLC(UPLC)—TOF—MS，通過與標準品保留時間比較及分析質譜圖給出的一級結構和二級結構等，最終得到成分具體類別。

在全谷物中，酚酸是最具代表性的多酚類物質，尤其是阿魏酸，在小麥中約占總酚酸含量的70%～90%[32-35]。利用HPLC—ESI—TOF-MS技術在意大利22種小麥中共鑒定出34類(共104種異構體)多酚類物質，其中阿魏酸的同分異構體共有9種，二氫阿魏酸的同分異構體8種，丁香酸的同分異構體有2種且大部分存在于結合酚的部分[26]。在Carosello小麥中發現了分子質量為224.061 2(C11H12O5)的物質，并初步鑒定為芥子酸[26]。

通過Q—TOF-MS提供的質荷比和離子碎片信息并結合相應的文獻資料，在西瓜果肉里發現30種酚酸類物質，并含有間苯三酚-葡萄糖醛酸[36]。同樣，利用該技術從朝鮮淫羊藿中共鑒定出18種酚酸類物質，其中有7種酚酸是首次發現，均為咖啡酰己酸的同分異構體[37]。

松蘿具有清熱解毒、止咳化痰等功效，多酚類物質是其中的主要藥效成分。通過超高效液相色譜串聯三重四極桿飛行時間質譜法(UPLC—Triple-TOF-MS)在松蘿中鑒定出17種酚酸類物質，主要為二苯并呋喃類化合物、多取代單苯環類化合物、縮酚酸類及其衍生物等[38]。

2.2 黃酮類化合物的鑒定

黃酮類化合物是通過兩個苯環和一個吡喃環相互連接而形成的一系列化合物。串聯質譜技術能給出圖譜中記錄的物質精確的分子質量，甚至能夠給出黃酮類物質裂解途徑的信息，大多數記錄的A型和B型離子碎片為這些化合物的取代模式提供了極為重要的信息[27,39-40]，因此，對研究未知黃酮類化合物的結構提供了依據。

利用反向高效液相色譜電噴霧電離飛行時間質譜(RP-HPLC-ESI-TOF-MS)技術在苦蕎中檢測到28種黃酮類物質，其中2-羥基-3-O-β-D-吡喃葡糖基-苯甲酸、1-O-咖啡酰-6-α-吡喃鼠李糖基-β-葡萄糖苷、表兒茶素-3-(3''-O-甲基)是首次在苦蕎中被發現[41]。在南美亞馬遜雨林棕櫚樹葉中利用UPLC—ESI-MS/MS串聯技術鑒定出的黃酮類化合物主要有槲皮素、柚皮素、兒茶素和表兒茶素、蘆丁、矢車菊素-3-蕓香糖苷和矢車菊素-3-葡萄糖苷[42]。

通過ESI-IT-TOF/MSn多級質譜聯用技術對21種黃酮類化合物的裂解規律進行研究時發現，異黃酮和黃酮丟失C2H2O2碎片的先決條件是5,7-二羥基或5-羥基-7-甲氧基取代，異黃酮、黃酮和黃酮醇失去C3O2的結構特點是A環具有5,7-二羥基取代，若A環含有其他取代基，則不會失去C3O2[43]。葛根素-4’-O-β-D-葡萄糖苷在質譜中給出的離子峰的測定值為577.156 2，可推斷其分子式為C27H30O14，以m/z577.15 62為母離子，進行二級質譜分析，其可能的裂解途徑見圖2，與2-苯基色原酮8號碳位鏈接的官能團(C6H11O5)中，環上相間的C—O鍵、C—O鍵斷裂脫落C4H8O4部分(Mv=120)，留下的C2H3O形成一個新C—C雙鍵，并以該離子形式(m/z457)保持穩定[44]。

圖2 葛根素-4’-O-β-D-葡萄糖苷可能的裂解途徑Figure 2 Possible fragmentation mechanism of puerain- 4’-O-β-D-glucoside

2.3 原花色素類化合物的鑒定

原花色素，又稱縮合單寧，是一類結構與花青素相似，味澀而無色的高聚物，其基本結構單元是黃烷-3-醇，因結構中起始單元或延伸單元黃烷-3-醇組成單元的連接位置、羥化部分以及聚合度的不同使原花色素結構具有多樣性和復雜性，導致對其進行定性和定量分析比較困難[45]，運用親核試劑(如間苯三酚或甲苯α-硫醇)催化的酸降解原花色素，其延伸和末端結構單元可被檢測，從而測定其聚合度[46]。

輔助激光電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)技術是一種靈敏且有效的不揮發性物質檢測技術，能對同一樣品進行重復分析且具有最佳兼容性[47]，被認為是對多酚聚合物和原花青素分析的有效方法[48-52]。Mané等[53]分別在MALDI-TOF-MS中使用[M+Na]+和[M+K]+兩種陽離子模式，測得蘋果中原花色素的聚合度分別為DP15和DP13；Takahata等[54]利用[M+K]+在線模式檢測出棕色大豆種皮中的原花色素最高聚合度為DP30。

陳小鑫[55]運用MALDI-TOF-MS檢測發現構成黃葛樹葉、樹皮和果實原花色素，魚尾葵果皮原花色素和印度塔樹葉原花色素的黃烷-3-醇結構單元(U288)的質量數與原花青素結構單元C/EC(兒茶素/表兒茶素)的相對分子質量恰好相等，并能分別檢測到黃葛樹葉、樹皮和果實原花色素，魚尾葵果皮和果肉原花色素，印度塔樹葉原花色素存在從三聚體到六聚體、十五聚體、十二聚體和十四聚體的聚物。相似的，在木欖花萼原花色素的MALDI-TOF質譜圖中，主要離子峰系列的相鄰離子峰間距均為m/z288，顯示了構成花萼原花色素的黃烷-3-醇結構單元(U288)的質量數，通過計算結構單元U288個數得知其中從三聚體到十六聚體的均聚物都存在[56]。

3 結語

植物多酚因成分與結構的不同而具有多種生理功能，在疾病控制和保健方面發揮著重要作用。因此，分析植物多酚的結構對研究植物多酚生理功能具有重要的意義，飛行時間質譜技術在分析多酚成分及結構鑒定方面發揮著巨大作用。但由于飛行時間質譜是通過質譜圖提供的離子碎片信息對多酚類物質做初步的鑒定，所以單一使用具有一定的局限性。將多種電離技術與多級質譜連用，能使飛行時間質譜在全面鑒定和分析多酚類化合物成分中發揮重要作用。

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The time of flight mass spectrometry technology and its application in plant polyphenols identification

(1.CollegeofFoodScience,SouthwestUniversity,Chongqing400715,China;2.ChongqingEngineeringResearchCenterforSpecialFoods,Chongqing400715,China)

Time of flight mass spectrometry (TOF-MS) has been widely applied in food, biological medicine, environmental monitoring for its great precision, wide range of detection and high speed of analysis. TOF-MS with various techniques in tandem plays an important role in the structure identification of polyphenols. In this review, it was outlined the application of time of flight mass spectrometry in the structure identification of plant polyphenols to provide some references for the study of plant polyphenol.

time of flight mass spectrometry; polyphenols; structure identification

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.04.039

國家自然科學基金項目(編號：41601573)；安徽省公益性技術應用研究聯動計劃項目(編號：1604f0704050)；滁州學院實驗室開放課題(編號：SWSP201507KF)

張磊(1983—)，男，滁州學院講師，博士。 E-mail：leizhang2014@163.com

2017—01—20