龍膽中黃酮化合物含量測定的方法學研究

朱丹 楊菁 李林龍 楊航 黎燕

摘要[目的]建立紫外可見分光光度法測定龍膽中總黃酮含量的方法。[方法]通過微波輔助雙水相提取龍膽中總黃酮類化合物，采用紫外可見分光光度法，以蘆丁作為對照品，測定其含量。[結果]黃酮類化合物濃度在10.4～73.0 μg/mL，其吸光度與濃度有良好的線性關系；該方法的精密度、重復性和加樣回收率的RSD值分別為0.30%、1.31%、2.27%。[結論]該方法準確、快速、重復性好，可以用于測定龍膽中總黃酮類化合物。

關鍵詞龍膽；黃酮化合物；紫外可見分光光度法；含量測定；方法學

中圖分類號S567.23文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）14-0113-02

Abstract[Objective] The research aimed to establish a method for determination of the total flavonoids from Radix Gentianae.[Method]The total flavonoids in Radix Gentianae were extracted by microwaveassisted aqueous twophase. The contents of total flavonoids were determined by UV-visible spectrophotometry with rutin as the reference substance. [Result]The method was a good linear at the range of 10.4-73.0 μg/mL of the total flavonoids. The RSD values of the precision test， reproducibility experiment and the recovery rate test were 0.30%，1.31%，2.27%，respectively.[Conclusion]The method is accurate， rapid and reproducible，and can be used to determine the total flavonoids from Radix Gentianae.

Key wordsRadix Gentianae；Flavonoids；UVvisible spectrophotometry；Determination of content；Methodology

龍膽（Radix Gentianae）為龍膽科植物條葉龍膽（Gentiana manshurica Kitag.）、龍膽（G.scabra Bge.）、三花龍膽（G. triflora Pall.）、堅龍膽（G.rigescens Franch）的干燥根及根莖，味苦、寒，具有清熱燥濕、瀉肝膽火的功效[1]。近年來研究表明，龍膽的地上部分含有黃酮類化合物[2-3]，具有抗炎、抗菌、降血糖等藥理活性[4]。該試驗采用紫外可見分光光度法對龍膽中的總黃酮進行含量測定，并對其方法學進行考察[5-6]。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1試驗儀器。UV-500紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司），M1-211A微波爐（美的公司），AR2140電子分析天平（上海奧豪斯有限公司），DRHH數顯恒溫水浴鍋（上海雙捷實驗設備有限公司）。

1.1.2試驗試劑。龍膽藥材（產地：廣西）；蘆丁對照品（上海永恒生物科技有限公司，純度>98%）；無水乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、硫酸銨等試劑均為分析純。

1.2試驗方法

1.2.1供試品溶液的制備。準確稱取干燥至恒重的藥材0.25 g 于圓底燒瓶中，加入20 mL 35%乙醇-20%硫酸銨雙水相提取劑，搖勻，置于微波爐中。在功率420 W下萃取25 min。靜置，待溶液分相后，取出上相在60 ℃下水浴揮干，殘渣用甲醇溶解，定容至10 mL，作為供試品溶液。

1.2.2蘆丁對照品溶液的制備。精密稱取蘆丁對照品20.85 mg置于100 mL容量瓶中，加入無水乙醇溶液、搖勻，稀釋至刻度，配制成0.208 5 mg/mL對照品溶液。

1.2.3測定波長的選擇。精密吸取一定量的蘆丁對照品溶液和供試品溶液于2個10 mL的容量瓶中，分別加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，再加10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，再加入4%氫氧化鈉溶液4 mL，后用無水乙醇定容至刻度，搖勻，以相應試劑作為空白對照，在200～800 nm波長進行掃描，選擇最佳測定波長。

1.2.4方法學考察。

1.2.4.1線性關系考察。精密吸取“1.2.2”的蘆丁對照品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL，置于10 mL容量瓶中，按照“1.2.3”方法，自“分別加入5%亞硝酸鈉溶液”起依法測定其吸光度，以標準溶液濃度（C）為橫坐標、吸光度（A）為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.4.2穩定性試驗。精密吸取“1.2.2”的蘆丁對照品溶液和“1.2.1”的供試品溶液各1.0 mL，按照“1.2.3”方法，自“分別加入5%亞硝酸鈉溶液”起，分別在0、5、10、15、20、25、30 min測定其吸光度，計算相對標準偏差（RSD）值。

1.2.4.3精密度試驗。精密吸取“1.2.1”的供試品溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中，按照“1.2.3”方法，自“分別加入5%亞硝酸鈉溶液”起依法測定吸光度，連續測定6次，計算RSD值。

1.2.4.4重復性試驗。準確稱取干燥的龍膽藥材0.25 g各6份，按“1.2.1”方法進行提取制備。精密吸取1.0 mL提取液，按“1.2.3”方法進行測定，并計算RSD值。

1.2.4.5加樣回收率試驗。準確稱取干燥的龍膽藥材0.25 g各6份，分別加入一定量的蘆丁對照品，按“1.2.1”方法進行提取，精密吸取1.0 mL提取液，按“1.2.3”方法進行測定，計算總黃酮的回收率。

2結果與分析

2.1測定波長的選擇按照“1.2.3”操作，結果表明，對照品與樣品溶液在505 nm處有最大吸收，故選擇505 nm為最佳測定波長。

2.2線性關系考察按照“1.2.4.1”操作，以標準溶液濃度（C）為橫坐標、吸光度（A）為縱坐標繪制標準曲線，得出標準曲線方程為A=10.68C-0.002（R2=0.999），表明蘆丁對照品在10.4～73.0 μg/mL其吸光度與濃度呈良好的線性關系。

2.3穩定性按照“1.2.4.2”操作，發現蘆丁對照品和藥材提取液顯色后在30 min內穩定，其RSD值分別為0.22%和0.30%，表明蘆丁對照品和提取液中的黃酮類化合物在30 min內保持穩定。

2.4精密度按照“1.2.4.3”操作，計算得RSD值為0.30%，表明儀器精密度良好。

2.5重復性按照“1.2.4.4”操作，計算RSD值為1.31%，表明該方法的重復性好。

2.6加樣回收率由表1可知，平均回收率為99.6%，RSD值為2.27%，說明該方法回收率高，滿足分析測定的要求。

3結論與討論

紫外可見分光光度法具有靈敏度高、準確度高、操作簡單、應用廣泛等特點。該試驗采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色劑與龍膽中總黃酮發生絡合反應，生成穩定的吸光物質，通過紫外可見分光光度法對龍膽中的總黃酮含量進行測定，考察了方法的精密度、重現性及加樣回收率，測定結果的RSD值均在要求的范圍之內，表明該方法穩定、準確、操作簡便，可以用于龍膽中總黃酮含量的測定。

參考文獻

[1] 張敬瑩.糙龍膽地上部分的化學成分研究[D].大連：大連理工大學，2008.

[2] 江蔚新，安勝利，郭立萍，等.龍膽地上、地下部分藥理作用的比較分析[J].哈爾濱商業大學學報（自然科學版），2003，19（1）：14-16.

[3] 趙磊，李智敏，白艷婷，等.滇龍膽地上部分的化學成分研究[J].云南中醫學院學報，2009，32（2）：27-31.

[4] 劉濤，才謙，付玉芹，等.中藥龍膽的研究進展[J].遼寧中醫雜志，2004，31（1）：85-86.

[5] 劉春雨，王集會.發酵蜈蚣粉中總黃酮類含量測定的方法學研究[J].安徽農業科學，2016，44（17）：154-155.

[6] 倪曉霞，王慶芬，魏浩澤，等.紫外分光光度法測定蒲地灌腸液中總黃酮含量[J].中醫藥導報，2017，23（2）：57-59.