響應(yīng)面優(yōu)化葛根黃酮提取工藝研究

慕苗　高娟　高晶晶　白艷霞　高平強(qiáng)

摘 要：驗(yàn)以葛根粉為原料、乙醇為溶劑，研究了不同提取時(shí)間、不同提取溫度、不同乙醇濃度對(duì)葛根黃酮提取率的影響，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上用紫外分光光度計(jì)法進(jìn)行含量測(cè)定，并進(jìn)行了3因素 3水平的 Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化了葛根黃酮的有關(guān)提取參數(shù)，最優(yōu)工藝條件為：提取時(shí)間60min、提取溫度80℃、乙醇濃度60%。在最佳優(yōu)化條件下葛根黃酮提取率達(dá)到極大值，葛根黃酮提取率為36.64%。該方法快速簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于葛根素提取。

關(guān) 鍵 詞：葛根黃酮；響應(yīng)曲面；提取工藝

中圖分類(lèi)號(hào)：TQ 028 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 1671-0460（2017）07-1299-04

Optimization of Pueraria Flavones Extraction Process

by Response Surface Method

MU Miao1，GAO Juan2， GAO Jing-jing1， BAI Yan-xia1，GAO Ping-qiang1

（1. Chemistry and Chemical Engineering Department， Yulin College， ShaanxiYulin719000， China

2. Yulin Institute for Drug Control， Shaanxi Yulin719000， China）

Abstract： Using puerarin powder as raw material and ethanol as solvent， effect of the extraction time， extraction temperature， ethanol concentration on the pueraria flavones extraction yield was studied by single factor experiment using method of ultraviolet spectrophotometer for content determination， and related parameters were optimized by 3-factor 3-level Behnken design. The best extraction conditions were obtained. The results show that the optimal technological conditions are as follows： the extraction time 60 min， the extraction temperature 80 ℃， the ethanol concentration 60%；Under above conditions，pueraria flavones extraction yield can reach to the maximal value， 34.87%. This method is quick and easy， accurate and can be used for extraction of pueraria flavones.

Key words： Pueraria flavones；The response surface；Extraction process

葛根黃酮是從豆科植物野葛或甘葛藤根中提出的一種黃酮苷，無(wú)毒無(wú)害。它富含抗自由基，抗氧化，適用于冠心病、心絞痛、心肌梗死、視網(wǎng)膜動(dòng)靜脈阻塞、突發(fā)性耳聾，增強(qiáng)肌體的免疫力，改善微循環(huán)和抗血小板聚集的作用，對(duì)人類(lèi)的腫瘤治療和預(yù)防具有重要意義[1]。葛根屬于天然野生植物資源，價(jià)格低廉，其提取物中有大量藥用的有效成分，故在保健品應(yīng)用研究開(kāi)發(fā)中有較大的空間。因此，改進(jìn)葛根黃酮提取工藝成為研究的熱點(diǎn)[2-5]。

目前，文獻(xiàn)報(bào)道的提取葛根黃酮的方法有很多，如水提取法、乙醇回流提取法、滲濾法、超聲波法、微波萃取法、超臨界萃取等[6-9]。大多數(shù)提取工藝采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)。由于正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)次數(shù)少，但分析不及響應(yīng)面全面。響應(yīng)曲面分析法能夠準(zhǔn)確求出各因素水平的響應(yīng)值，并能分析兩兩因素之間的交互影響，預(yù)測(cè)最優(yōu)理論值[10-14]。本文擬采用乙醇水浴回流提取中藥葛根中的葛根黃酮，并用單因素Box-Behnken分析研究相關(guān)工藝條件，為葛根深加工和綜合利用提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器

紫外分光光度計(jì)（日本島津公司），SHB-Ⅲ 型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；FA2004型分析天平（上海良平儀器儀表有限公司）數(shù)顯超級(jí)恒溫水浴HH-501。

1.2 試藥

葛根黃酮對(duì)照品，購(gòu)于KAYOU公司（批號(hào)：20140704），純度>98.0%。葛根粉，陜西省榆林市廣濟(jì)堂。無(wú)水乙醇，亞硝酸鈉，硝酸鋁，氫氧化鈉：均為分析純，購(gòu)于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

2 方法

2.1 乙醇水浴回流提取

準(zhǔn)確稱(chēng)取葛根粉1.0 g置于圓底燒瓶中，分別用不同提取時(shí)間15，30，60，120 min，不同提取溫度40℃，50℃，60℃，70℃，80℃、不同乙醇濃度20%，30%，40%，50%，60%，水浴回流提取3次，抽濾，合并3次濾液，加入1mL 50 g·L-1 NaNO2溶液搖勻，靜置；加入1mL100 g·L-1Al（NO3）3溶液搖勻，靜置；加入1mol·L-1NaOH溶液10mL，加去離子水定容至25mL容量瓶中待測(cè)。

2.2 提取率的計(jì)算

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確稱(chēng)取蘆丁用乙醇定容制得質(zhì)量濃度為100μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)液。依次吸取2、4、6、8、10mL標(biāo)準(zhǔn)液分別用乙醇稀釋至6mL定容至10mL，然后分別加入1mL 50 g·L-1 NaNO2溶液搖勻，放置6 min；加入1mL100 g·L-1Al（NO3）3溶液，放置6 min；加入10mL 1mol·L-1的NaOH，加水定容到25mL，靜置備用。在波長(zhǎng)508nm處，依次測(cè)定各溶液的吸光度值，以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），其線性關(guān)系y=0.1563+0.0784x，R2=0.9918，x為蘆丁濃度，y為吸光度。

精密稱(chēng)取上述葛根黃酮粗提溶液1mL定容到25 mL容量瓶，按標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定方法，在508nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度計(jì)算濃度及葛根黃酮的提取率：

式中：c—測(cè)定樣品溶液中的葛根黃酮的濃度；

v—樣品溶液的最終體積；

m—樣品質(zhì)量。

2.3 單因素

用紫外分光光度計(jì)在250 nm波長(zhǎng)下對(duì)樣品中葛根黃酮進(jìn)行單因素測(cè)定，測(cè)定不同時(shí)間，不同溫度，不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)葛根黃酮含量的影響。

提取時(shí)間的影響：準(zhǔn)確稱(chēng)取葛根粉1.0 g置于圓底燒瓶中，向燒瓶中加入濃度為60%的乙醇40 mL，水浴加熱，溫度為80 ℃，提取時(shí)間分別為15，30，60，120 min，提取3次，抽濾，合并3次濾液，加入1 mL 50 g·L-1 NaNO2溶液搖勻，靜置；加入1 mL100 g·L-1Al（NO3）3溶液搖勻，靜置；加入1 mol·L-1 NaOH溶液10 mL，加去離子水定容至25 mL容量瓶中待測(cè)。

提取溫度的影響：準(zhǔn)確稱(chēng)取葛根粉1.0 g置于圓底燒瓶中，向燒瓶中加入濃度為60%的乙醇40 mL，加熱溫度分別為40，50，60，70，80 ℃，加熱回流提取3次，提取時(shí)間分別為1 h，抽濾后合并3次濾液，加入1mL 50 g·L-1 NaNO2溶液搖勻，靜置；加入1 mL100 g·L-1 Al（NO3）3溶液搖勻，靜置；加入1 mol·L-1 NaOH溶液10 mL，加去水定容至25 mL容量瓶中待測(cè)。

乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響：準(zhǔn)確稱(chēng)取葛根粉1.0 g置于圓底燒瓶中，向燒瓶中分別加入濃度為20，30，40， 50，60%的乙醇40 mL，加熱回流提取3次，提取時(shí)間分別為1 h，抽濾后合并3次濾液，加入1 mL 50 g·L-1 NaNO2溶液搖勻，靜置；加入1 mL100 g·L-1Al（NO3）3溶液搖勻，靜置；加入1 mol·L-1NaOH溶液10 mL，加去離子水定容至25mL容量瓶中待測(cè)。

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素優(yōu)化結(jié)果：最佳提取時(shí)間為60 min，最佳乙醇濃度為60%，最佳提取溫度為70℃。設(shè)提取時(shí)間，提取溫度，乙醇體積分?jǐn)?shù)為自變量，紫外吸光度為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平的試驗(yàn)，如表1。

3.1.1 提取時(shí)間的影響

從圖2中可知，在20～60 min范圍內(nèi)，葛根黃酮提取液吸光度隨時(shí)間增大而增大，提取時(shí)間大于60 min后，黃酮提取液吸光度有所下降。因此，實(shí)驗(yàn)選定提取時(shí)間為60 min。

3.1.2 提取溫度的影響

從圖3中可知，提取溫度在40～70 ℃范圍內(nèi)，葛根黃酮提取液吸光度逐漸增大，提取溫度高于70℃后，黃酮提取液吸光度開(kāi)始下降。因此，實(shí)驗(yàn)選定提取溫度為70 ℃。

3.1.3 乙醇濃度的影響

從圖4中可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)在30%～60%范圍內(nèi)，葛根黃酮提取液吸光度逐漸增大，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于60%后，黃酮提取液吸光度開(kāi)始下降。因此，實(shí)驗(yàn)選定乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%。

綜合圖1、2、3得出：最佳提取時(shí)間為60 min，最佳乙醇濃度為60%，最佳提取溫度為80 ℃。

3.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

3.2.1 Box-Behnken設(shè)計(jì)與結(jié)果

根據(jù)表1的因素和水平進(jìn)行設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。包括17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中12個(gè)析因點(diǎn)、5個(gè)零點(diǎn)。

3.2.2 回歸模型的建立與顯著性分析

用Design Expert 8.0軟件對(duì)表3中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析其中A-時(shí)間，B-溫度，C-乙醇體積分?jǐn)?shù)，得出3因素與葛根黃酮浸出量之間的二次回歸方程Y=0.91+0.010A+0.013B+0.010C-7.500E-004AB-7.500E-004AC+0.011BC-0.061A?-0.061B?-0.053C?。

由表3可知，R? =0.9890，AdjR? =0.9762一次項(xiàng)各因素中，提取時(shí)間（A），提取溫度（B），乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）都為顯著（P<0.05），二次項(xiàng)中的三個(gè)因素都極其顯著（P<0.001），而交互項(xiàng)中只有提取溫度（B）和乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）有極顯著的影響，而提取時(shí)間（A）與提取溫度（B），提取時(shí)間（A）與乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）顯著性不太明顯，顯著性程度依次為：提取溫度（B），提取時(shí)間（A），乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）。表明模型擬合度良好，P=0.0005﹤0.05，模型顯著，失擬項(xiàng)（Lack of Fit ）=0.268>0.05，為不顯著，說(shuō)明響應(yīng)面擬合回歸方程具有顯著意義，所以該模型可以預(yù)測(cè)葛根黃酮的提取。

3.2.3響應(yīng)面分析

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制出優(yōu)化各因素的響應(yīng)曲面。由圖5（a）可以看出提取溫度比提取時(shí)間對(duì)吸光度的影響顯著，隨著提取溫度和提取時(shí)間的增加，吸光度在增加而后稍有下降，等高圖5（b）接近橢圓形說(shuō)明提取時(shí)間和提取溫度對(duì)葛根黃酮吸光度的交互影響較顯著。

由圖6（c）可以看出提取時(shí)間比乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)吸光度的影響較明顯，但提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)對(duì)吸光度影響不大甚至略有降低，說(shuō)明合適的提取時(shí)間對(duì)吸光度的影響很重要，由等高線圖6（d）接近橢圓，說(shuō)明提取時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)吸光度的交互影響較顯著。

由圖7（e）可以看出，提取溫度比乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)吸光度曲面陡峭，說(shuō)明提取溫度比乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)吸光度顯著，由圖7（f）等高線為橢圓，說(shuō)明提取溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)吸光度的交互影響相當(dāng)明顯。響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果顯示：最佳提取時(shí)間為60 min，最佳乙醇濃度為60%，最佳提取溫度為80 ℃。

3.2.4 平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為檢驗(yàn)響應(yīng)曲面法所得結(jié)果的可靠性，采用上述最佳提取條件，提取時(shí)間為60 min，乙醇濃度為60%，提取溫度為80 ℃。對(duì)葛根進(jìn)行預(yù)處理經(jīng)過(guò)3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4，葛根黃酮的平均提取率可以達(dá)到35.27%，模型預(yù)測(cè)葛根素提取率為36.64%，與理論值相比，降低了3.73%，可見(jiàn)該模型較好的預(yù)測(cè)了實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表明基于響應(yīng)曲面法所得優(yōu)化工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

4 總 結(jié)

本實(shí)驗(yàn)采用乙醇水浴回流提取法提取葛根中藥材中的葛根黃酮，用紫外分光光度法檢測(cè)其含量，以乙醇為溶劑，研究了不同提取時(shí)間、不同提取溫度、不同乙醇濃度對(duì)葛根黃酮提取液吸光度的影響，先后采用單因素實(shí)驗(yàn)以及 Box-Behnken 設(shè)計(jì)優(yōu)化了提取葛根黃酮的有關(guān)參數(shù)，推測(cè)其提取最優(yōu)條件為：提取時(shí)間為60 min，乙醇濃度為60%，提取溫度為80 ℃。這種方法簡(jiǎn)便快速，可用于葛根黃酮的提取。

參考文獻(xiàn)：

[1]容林，楊旭東，陳理軍，等. 葛根素藥理作用及其作用機(jī)制研究新進(jìn)展[J]. 廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 2014， 16 （178）： 138-140.

[2]李杏元， 陳國(guó)安. 微波輔助提取葛根黃酮工藝的優(yōu)化[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2012， 51（16）： 3572-3574.

[3]王 辰，高 玲. 超聲波輔助提取葛根黃酮的工藝研究[J]. 長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2009， 6（4）： 61-66.

[4]李婷， 鄭彩美， 張 彤，等. 均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)選葛根總黃酮提取工藝[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥， 2010， 21（5）： 1088-1089.

（下轉(zhuǎn)第1306頁(yè)）