費菜總黃酮分離純化方法研究

薛志忠 楊雅華 張國新

摘要 [目的]開發高純度費菜總黃酮的分離純化工藝。[方法]以大孔樹脂為載體，對上樣量及層析條件進行優化，再進一步采用結晶的方法進行純化。[結果]選用聚合物納米微球PS RPC-300作為最佳層析填料，洗脫速度為5 mL/min，洗脫劑為70%乙醇，上樣量為5.0 g/kg填料，結晶溶劑為丙酮；在此優化條件下所得產品的純度為95.1%。[結論]此分離純化方法簡便可靠，分離效果好。

關鍵詞 費菜；總黃酮；聚合物納米微球；分離純化

中圖分類號 R284.2 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）18-0113-02

Abstract [Objective] The research aimed to develop the separation and purification processes of highpurity total flavonoids from Sedum aizoon L.[Method]With the macroporous resin as the carrier，the loading volume and the chromatographic conditions were optimized，and then further purified by crystallization method.[Result]Type of PS RPC-300 nanoscale polymer particles was selected as the best chromatography filler.The optimal conditions were as follows：the elution speed was 5.0 mL/min，70% ethanol was used as the eluant，the amount of sample was 5 g/kg filter，and acetone was used as the crystallization solvent.The purity of the final product was 95.1% under the optimal conditions.[Conclusion]The separation and purification method is simple and reliable，and the separation effect is good.

Key words Sedum aizoon L.；Total flavonoids；Polymer nanospheres；Separation and purification

費菜（Sedum aizoon L.）為景天科景天屬多年生草本植物，適應性強，分布廣泛，在我國陜西、四川、江蘇、湖北、山東、寧夏、甘肅、河北等地均有分布[1]。它是一種藥食兼用植物，嫩莖葉富含各種營養物質，無任何異味，即可鮮食又可烹調；其根及全草富含生物堿、谷甾醇、齊墩果酸、景慶庚糖、馬栗樹皮素、楊梅樹皮苷、金絲桃苷、槲皮素、山奈酚、楊梅黃素、3-葡萄糖苷等[2]，對于提高人體免疫力、預防和治療心腦血管疾病具有較好的效果。

目前，費菜提取物已在食品行業、醫藥及化妝品行業得到廣泛應用[3-4]。但關于高純度的費菜總黃酮提取物純化分離的文獻報道較少，而且已有的制備提取方法存在收率不高、純度偏低的缺點[5-6]。因此，筆者以費菜總黃酮粗提物為試材，采用聚合物納米微球作為層析填料，對其進行層析純化[7]，得到了純度較高的總黃酮，以期為費菜提取物的進一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試材

費菜總黃酮粗提物（自制）；蘆丁對照品（中國生物制品檢定所）。聚合物納米微球（蘇州納微科技公司）；AB-8大孔樹脂（安徽三星科技公司）；201大孔樹脂（昆山嘉之美）；去離子水（自制）；乙腈（色譜純，Thermo公司）；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器 中壓層析系統（瑞士Buchi公司）；高效液相色譜儀（996檢測器，515泵，Waters公司）；旋轉蒸發器（Loborata 4000，Heidolph公司）。

1.3 方法

1.3.1 高效液相檢測條件。

色譜柱為Hypersil C18（4.6 mm×250 mm，10 μm）；流動相為甲醇-水-醋酸體積比（48∶50∶2）；流速1.0 mL/min；檢測波長275 nm；進樣量10 μL。

1.3.2 蘆丁標準品制備。

精密稱取蘆丁對照品12.6 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇溫熱溶解，并稀釋至刻度搖勻備用。

1.3.3 吸附樹脂的篩選。分別用型號為PS RPC-300聚合物納米微球、AB-8、201大孔樹脂裝柱，取100 g備選樹脂用0.1 mol/L的NaOH溶液浸泡2 h，水洗至中性，濕法裝柱，用去離子水平衡系統。取0.5 g費菜總黃酮粗提物（純度為30%），用乙醇完全溶解，然后均勻地加樣于層析柱，用一倍柱體積的去離子水進行洗滌處理，洗滌后再用不同濃度的乙醇以5 mL/min的速度進行洗脫處理，中壓監控收集洗脫液，每管10 mL。高效液相色譜儀檢測分離效果，每組試驗做3次平行試驗，數據取平均值，以備選大孔樹脂對總黃酮的洗脫收率進行篩選。

1.3.4 解吸液乙醇濃度的確定。

取0.5 g費菜總黃酮粗提物，用乙醇完全溶解，然后均勻地加樣于100 g聚合物納米微球PS RPC-300樹脂柱上，用一倍柱體積去離子水進行洗滌處理，然后分別采用50%、60%、70%、80%乙醇以5 mL/min的速度進行洗脫，分管收集乙醇洗脫液，通過中壓層析色譜檢測器在線監測，以觀察總黃酮解吸狀況。

1.3.5 解吸液流速的選擇。

取0.5 g費菜總黃酮粗提物，用乙醇完全溶解，然后均勻地加樣于100 g聚合物納米微球PS RPC-300樹脂柱上，用一倍柱體積去離子水進行洗滌處理，用70%乙醇作為洗脫劑，然后分別以3、4、5、6、7 mL/min的洗脫速度進行洗脫，收集洗脫液，每管10 mL。高效液相色譜儀檢測分離效果，將總黃酮單組分接收液合并，計算洗脫收率。

1.3.6 上樣量的確定。

分別按照1 kg聚合物納米微球PS RPC-300加載2、3、5、8、10 g費菜總黃酮粗提物，用一倍柱體積去離子水進行洗滌處理，然后70%乙醇作為洗脫劑，以5 mL/min的洗脫速度進行洗脫，收集洗脫液，每管10 mL。高效液相色譜儀檢測分離效果，將總黃酮單組分接收液合并，計算洗脫收率。

1.3.7 結晶。

將費菜總黃酮單組分的洗脫液合并，減壓濃縮處理，再加入適量的丙酮、乙酸乙酯、異丙醇等不同溶劑，抽濾，干燥，得到費菜總黃酮結晶粉，高效液相色譜儀檢測各結晶粉含量。

2 結果與分析

2.1 線性關系考察

精密量取對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置10 mL容量瓶中加甲醇定容至刻度，搖勻，進樣量為10 μL，用液相色譜儀測定，得出回歸方程為Y=17 714X-89.686（r=0.999 4），表明總黃酮在0.005 04～0.050 40 mg/mL線性關系良好。

2.2 大孔樹脂型號的確定

由圖1可知，PS RPC-300聚合物納米微球在乙醇濃度為50%、60%、70%、80%時對費菜總黃酮的洗脫收率均高于AB-8、201這2種樹脂；并且通過高效液相色譜儀檢測，費菜總黃酮單組分的分離效果也高于AB-8、201 這2種樹脂，因此該試驗層析填料選擇PS RPC-300聚合物納米微球。

2.3 解吸液乙醇濃度的確定

由表1可知，用50%乙醇以5 mL/min的速度進行洗脫，洗脫率最低，僅有50.6%；用60%乙醇以5 mL/min的速度進行洗脫，解吸拖尾較為嚴重且解吸率偏低；用80%乙醇以5 mL/min的速度進行洗脫，洗脫速度過快，總黃酮單組分不能有效分離；用70%乙醇以5 mL/min的速度進行洗脫，分離費菜總黃酮效果好，單組分可以有效洗脫，色譜純度最高，為91.2%。因此，最佳洗脫條件為：用70%乙醇以5 mL/min的速度進行洗脫，中壓監測分段收集洗脫液。

2.4 解吸液流速的選擇 由圖2可知，70%乙醇洗脫速度逐步增加時洗脫收率也隨之增加，但當超過5 mL/min時，費菜總黃酮洗脫過快，單組分夾雜雜質。因此，選擇洗脫速度為5 mL/min。

2.5 上樣量的確定

由圖3可知，樣品上樣量直接影響著層析收率。當費菜總黃酮粗提物上樣量在2～10 g/kg時，總黃酮層析收率出現先升高再降低的趨勢。當費菜總黃酮上樣量為2 g/kg時，樣品在解吸過程中分散較為嚴重，層析收率最低，僅為40.0%左右；隨著總黃酮上樣量的增加，層析收率有所提高，當達到5 g/kg時，層析收率達到最大值，為78.7%；當上樣量再加大時，出現過載現象，費菜總黃酮單組分重疊，層析效果減弱，洗脫收率出現顯著下降。因此，篩選出適宜上樣量是保證最佳層析收率的基礎，在保證分離度的情況下，上樣量為5 g/kg時，層析收率最高。

2.6 結晶

由表2可知，丙酮、乙酸乙酯、異丙醇3種結晶溶劑對費菜總黃酮單組分精粉收率、純度的影響差異較大，其中丙酮的結晶收率偏低，為57.6%，但其能去除部分雜質提高純度，純度高達95.1%。因此，綜合考慮選用丙酮作為結晶溶劑。

3 結論

以費菜總黃酮粗提物為試材，采用聚合物納米微球作為層析填料，對其進行層析純化，結果發現，最優分離純化方法是：選用聚合物納米微球PS RPC-300作為最佳層析填料，70%乙醇作為洗脫劑分離純化，洗脫速度為5 mL/min，上樣量為5 g/kg填料，結晶溶劑為丙酮；在此優化條件下能夠得到含量為95.1%的總黃酮，總收率為57.6%。該分離純化方法簡便可靠，不但簡化了提取工藝，而且提高了成品收率，為費菜提取物的進一步研究提供參考。

參考文獻

[1] 中國科學院中國植物志編委會.中國植物志 [M].北京：科學出版社，1984：72-74.

[2] 陳華珍，陳建偉.費菜不同器官中總黃酮的含量比較及其薄層鑒別[J].中醫藥學刊，2003，21（11）：1867，1917.

[3] 王耀輝，強毅，魯秀蘭，等.費菜不同部位原花色素含量分析[J].光譜實驗室，2013，30（5）：2529-2534.

[4] 強毅，李江林，王晟昱，等.費菜不同部位氨基酸組成及含量分析[J].光譜實驗室，2013，30（2）：1000-1003.

[5] 王鴻飛，劉飛，徐超，等.費菜總黃酮堿法提取工藝及抗氧化活性[J].農業工程學報，2012，28（S1）：317-321.

[6] 劉飛，王鴻飛，林燕，等.費菜總黃酮提取工藝的研究[J].食品工業科技，2011（4）：252-254，257.

[7] 林毅，張雪霞，李寧，等.聚合物納米微球分離純化達托霉素方法研究[J].中國抗生素雜志，2013，38（8）：588-591.