基于斑馬魚行為變化的苯酚監(jiān)測(cè)研究

周紹輝 杜娟娟 孫中訓(xùn) 李梅 逯南南 宋武昌

摘要 [目的]探究一種可行的水體苯酚監(jiān)測(cè)預(yù)警技術(shù)。[方法]以斑馬魚作為模式生物，采用半靜態(tài)試驗(yàn)法，考察了苯酚對(duì)斑馬魚的急性毒性及行為強(qiáng)度影響。[結(jié)果]苯酚對(duì)斑馬魚毒性為中毒物質(zhì)；與對(duì)照組相比，苯酚試驗(yàn)組斑馬魚行為強(qiáng)度變化極顯著，苯酚對(duì)斑馬魚的毒性呈明顯的時(shí)間-效應(yīng)和劑量-效應(yīng)關(guān)系。苯酚脅迫下，斑馬魚行為變化符合環(huán)境壓力模型。苯酚濃度越高，斑馬魚行為強(qiáng)度變化越顯著。[結(jié)論]基于斑馬魚行為變化的生物在線監(jiān)測(cè)技術(shù)是實(shí)現(xiàn)水體苯酚預(yù)警的有效手段。

關(guān)鍵詞 斑馬魚；苯酚；急性毒性；行為變化

中圖分類號(hào) S912 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）01-0083-03

Research of Phenol Monitoring Based on the Behavior Changes of Brachydanio rerio

ZHOU Shaohui， DU Juanjuan， SUN Zhongxun， LI Mei* et al

（School of Municipal and Environmental Engineering， Shandong Jianzhu University， Jinan， Shandong 250101）

Abstract [Objective]To explore a feasible technology for phenol early warning in water body. [Method]Acute toxicity and behavioral changes of Brachydanio rerio （as a model organism） were studied under phenol stress using semistatic test methods. [Result] The results showed that phenol is mildly toxic to Brachydanio rerio；compared with the control group， behavioral changes of Brachydanio rerio in the phenol test group were extremely significant. Phenol toxicity tests on Brachydanio rerio showed an obvious timeeffect and doseeffect relationship. Under phenol stress， behavior changes of Brachydanio rerio fit with the environmental stress model. Behavior changes of Brachydanio rerio were more significant under higher concentration of phenol. [Conclusion] Online monitoring technology based on the behavior changes of Brachydanio rerio is an effective way to realize phenol early warning in water body.

Key words Brachydanio rerio；Phenol；Acute toxicity；Behavior changes

苯酚是一類中等毒性的有機(jī)化學(xué)污染物，進(jìn)入生物體后會(huì)發(fā)生一些列生物反應(yīng)[1]，并通過(guò)生物鏈積累對(duì)人體和水生生物產(chǎn)生不同程度的急性或慢性毒性效應(yīng)[2-4]，嚴(yán)重威脅著人體健康及水生生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定。苯酚被多個(gè)國(guó)家列為優(yōu)先監(jiān)測(cè)污染物，我國(guó)明確規(guī)定飲用水中揮發(fā)酚（以苯酚計(jì)）含量不得超過(guò)0.002 mg/L[5]。因此，開(kāi)展水中突發(fā)性苯酚污染在線預(yù)警技術(shù)研究，對(duì)于實(shí)現(xiàn)突發(fā)污染事件的早期預(yù)報(bào)和及時(shí)應(yīng)對(duì)意義重大。

目前，基于斑馬魚行為變化的生物在線監(jiān)測(cè)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于水質(zhì)安全在線監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，借助計(jì)算機(jī)和生物傳感器等技術(shù)將斑馬魚行為學(xué)指標(biāo)變化轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的信息和數(shù)據(jù)可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)水質(zhì)安全。筆者通過(guò)苯酚對(duì)斑馬魚的急性毒性及行為強(qiáng)度影響試驗(yàn)，分析苯酚與斑馬魚行為強(qiáng)度的效應(yīng)關(guān)系，以期為在線監(jiān)測(cè)苯酚污染提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和分析方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)生物：斑馬魚（購(gòu)自國(guó)家斑馬魚資源中心），在實(shí)驗(yàn)室（25 ℃）水族箱內(nèi)馴養(yǎng)14 d；定期更換水族箱的水，保證水體含氧量≥4 mg/L，pH為7～8，硬度為6～8 mg/L[6]；每天喂食并清理缸底糞便和殘余餌料，試驗(yàn)前24 h停止喂食；規(guī)律照明，光照黑暗比為10 h ∶14 h。

供試藥劑：苯酚，用蒸餾水配成1 g/L的母液，纏好封口膜，保存于4 ℃冰箱，母液每月更換1次，試驗(yàn)溶液均用標(biāo)準(zhǔn)稀釋水稀釋母液；標(biāo)準(zhǔn)稀釋水，參照《水質(zhì)-物質(zhì)對(duì)淡水魚（斑馬魚）急性毒性測(cè)定方法》配置要求配制，pH為7.8±02，硬度為250 mg/L左右（以碳酸鈣計(jì)）。

供試儀器：

中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心開(kāi)發(fā)研制的水質(zhì)安全在線生物預(yù)警系統(tǒng)BEWs，LA系實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)，溶解氧測(cè)定儀（JYD-IA），QY系列移液槍，水族箱曝氣頭，燒杯（2 L）、玻璃棒、容量瓶等玻璃器皿，JA系列分析天平。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 斑馬魚急性毒性試驗(yàn)。

①按照《水質(zhì)-物質(zhì)對(duì)淡水魚（ 斑馬魚）急性毒性的測(cè)定方法》中的要求進(jìn)行急性毒性預(yù)試驗(yàn)來(lái)確定斑馬魚0～100%估計(jì)致死量。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選定6個(gè)苯酚濃度進(jìn)行正式試驗(yàn)，分別為5、10、20、30、40、50 mg/L，每組3個(gè)平行，每組投放大小相似斑馬魚5條。

②實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溫度保持在25 ℃，試驗(yàn)時(shí)長(zhǎng)96 h。

③采用靜態(tài)置換法每天更新溶液的50%[7-8]，保證溶液濃度，并記錄更換前后染毒液的pH、溫度、溶解氧（DO）。

④記錄12、24、48、72、96 h死魚數(shù)及中毒癥狀，并及時(shí)撈出死魚。

1.2.2 信號(hào)波監(jiān)測(cè)苯酚對(duì)斑馬魚行為強(qiáng)度試驗(yàn)。

采用水質(zhì)安全在線生物預(yù)警系統(tǒng)（BEWs），研究0.5 Hz頻率下不同濃度苯酚脅迫前后斑馬魚的綜合行為強(qiáng)度變化，以期建立苯酚與斑馬魚行為學(xué)變化的劑量-效應(yīng)關(guān)系。同時(shí)，為了排除自身變量等因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，采用斑馬魚自身對(duì)照。具體方法步驟：

①根據(jù)苯酚對(duì)斑馬魚急性毒性試驗(yàn)結(jié)果，確定染毒藥劑的濃度梯度。以48 h半致死濃度（48 h LC50）為1個(gè)染毒單位（TU），濃度梯度設(shè)定為染毒單位的0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、2.00倍，所對(duì)應(yīng)的苯酚濃度分別為0.18、090、1.80、9.00、18.00、36.00 mg/L。

②每個(gè)密閉管放置大小相似的斑馬魚2條，試驗(yàn)采用蠕動(dòng)泵連續(xù)注水進(jìn)行半靜態(tài)流水試驗(yàn)，進(jìn)水流速保持2 L/h，染毒藥劑由裝置底部進(jìn)水口進(jìn)入，在蠕動(dòng)泵作用下向上經(jīng)過(guò)密閉管后進(jìn)入排水管，測(cè)定不同染毒單位下斑馬魚綜合行為強(qiáng)度變化。

③試驗(yàn)期間保持水溫（25±1） ℃，試驗(yàn)時(shí)長(zhǎng)48 h。

④暴露試驗(yàn)過(guò)程中，空白對(duì)照組和試驗(yàn)組不能有魚死亡。

2 結(jié)果與分析

2.1 苯酚對(duì)斑馬魚急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 斑馬魚中毒特征及行為表現(xiàn)。

觀察不同濃度苯酚脅迫下斑馬魚的急性中毒反應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)圖1、2。低濃度試驗(yàn)組（5、10 mg/L）苯酚暴露下，魚體基本可以正常游動(dòng)，24 h以后開(kāi)始出現(xiàn)斑馬魚死亡現(xiàn)象；高濃度組（20～50 mg/L）斑馬魚表現(xiàn)出劇烈的異常反應(yīng)，在燒杯中急速游動(dòng)，魚體上下翻滾，四處亂竄，魚體失去平衡，擺尾擺鰭頻率明顯加快；30 min后斑馬魚活動(dòng)量開(kāi)始減少，游動(dòng)行為逐漸減緩直至死亡。魚體死亡后表現(xiàn)為魚鰓、心臟部出現(xiàn)紅色出血癥狀，體表產(chǎn)生白色黏液，魚體脊柱后彎（圖1、2）。這可能是由于苯酚刺激斑馬魚的皮膚，使其分泌黏液，同時(shí)損害鰓的呼吸上皮細(xì)胞，魚鰓出現(xiàn)出血癥狀。

2.1.2 苯酚對(duì)斑馬魚毒性。

通過(guò)記錄各時(shí)間段斑馬魚死亡數(shù)，利用SPSS軟件計(jì)算得到苯酚對(duì)斑馬魚不同時(shí)間的半致死濃度（LC50），結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，苯酚對(duì)斑馬魚作用時(shí)間越長(zhǎng)，苯酚的毒性就愈明顯，說(shuō)明苯酚對(duì)斑馬魚的毒性大小受暴露時(shí)間的影響，二者呈明顯的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。根據(jù)魚類急性毒性試驗(yàn)毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[9]，苯酚對(duì)斑馬魚毒性為中等毒性物質(zhì)。有研究表明，苯酚對(duì)莫桑比克羅非魚、奧尼羅非魚、白鰱、中華鱘的LC50～96 h分別為28.49、28.09、25.50、71.00 mg/L [9，10-12]，均比苯酚對(duì)斑馬魚的LC50～96 h高。表明斑馬魚對(duì)苯酚的耐受力較低，對(duì)苯酚的敏感性高于其他淡水養(yǎng)殖魚類，以斑馬魚作為受試生物可行性較高。

從圖3可見(jiàn)，在40、50 mg/L苯酚脅迫下，染毒開(kāi)始的12 h內(nèi)，斑馬魚死亡率為80%以上；30 mg/L苯酚暴露下，斑馬魚48 h致死率接近100%；96 h內(nèi)，5、10、20 mg/L濃度組斑馬魚致死率均較小。這表明暴露的苯酚濃度越高，斑馬魚致死率越高，兩者呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

2.2 苯酚對(duì)斑馬魚行為強(qiáng)度試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，不同濃度苯酚脅迫下，對(duì)照組斑馬魚行為強(qiáng)度變化基本穩(wěn)定，波動(dòng)范圍在15%～25%，表明斑馬魚在水質(zhì)安全在線預(yù)警系統(tǒng)中的行為變化基本不受外界干擾，所測(cè)數(shù)據(jù)可以用來(lái)分析苯酚對(duì)斑馬魚的行為學(xué)影響。 與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組斑馬魚行為強(qiáng)度極顯著減弱（P<0.01），苯酚濃度在0.18 mg/L （0.01 TU）及以上時(shí)，通過(guò)對(duì)48 h內(nèi)斑馬魚行為強(qiáng)度變化分析可實(shí)現(xiàn)水體污染的監(jiān)測(cè)預(yù)警。

從圖4可以看出，正常水體中斑馬魚行為強(qiáng)度基本穩(wěn)定，不同濃度苯酚脅迫下斑馬魚的行為強(qiáng)度均發(fā)生顯著變化，幾乎都經(jīng)歷先增大后減小再恢復(fù)的過(guò)程。這表明無(wú)論濃度高低，斑馬魚均感知到水體污染物的刺激，表現(xiàn)出明顯的“回避行為”，綜合行為強(qiáng)度短時(shí)間內(nèi)突然增大，均高于對(duì)照；隨著染毒時(shí)間延長(zhǎng)和斑馬魚機(jī)體積極適應(yīng)水體環(huán)境變化，中等濃度（1.80、9.00 mg/L）和高濃度組（18.00、36.00 mg/L）均在10 h后行為強(qiáng)度變化趨于穩(wěn)定，這種行為調(diào)節(jié)符合環(huán)境壓力模型[13]；苯酚濃度越高，斑馬魚行為強(qiáng)度變化波動(dòng)幅度越大，行為強(qiáng)度與苯酚濃度呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。因此，根據(jù)斑馬魚行為強(qiáng)度變化可以在線監(jiān)測(cè)分析水體苯酚污染程度。

3 結(jié)論

（1）苯酚對(duì)斑馬魚屬于中毒物質(zhì)，苯酚對(duì)斑馬魚的毒性呈明顯的時(shí)間-效應(yīng)和劑量-效應(yīng)關(guān)系，暴露時(shí)間越長(zhǎng)，苯酚濃度越高，斑馬魚死亡率越高。

（2）苯酚脅迫下，斑馬魚行為變化符合環(huán)境壓力模型，1～4 h行為強(qiáng)度增大，之后逐漸減弱并趨于穩(wěn)定。苯酚濃度為0.18～36.00 mg/L時(shí)，試驗(yàn)組斑馬魚行為強(qiáng)度與對(duì)照組相比差異極顯著（P<0.01），苯酚濃度為0.18 mg/L時(shí)，水質(zhì)安全在線監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可監(jiān)測(cè)出水體污染，并及時(shí)報(bào)警。

（3）斑馬魚在苯酚脅迫下反應(yīng)明顯，行為響應(yīng)敏感、迅速，利用斑馬魚在線監(jiān)測(cè)水質(zhì)變化，是實(shí)現(xiàn)生物在線安全預(yù)警的有效手段。

參考文獻(xiàn)

[1] 倪芳.在線監(jiān)測(cè)不同污染物對(duì)魚類運(yùn)動(dòng)行為的影響[D].大連：大連理工大學(xué)，2014：6.

[2] 嚴(yán)莎.苯系物對(duì)我國(guó)典型魚類和水生植物的毒害效應(yīng)及其水質(zhì)基準(zhǔn)的研究[D].天津：南開(kāi)大學(xué)，2012.

[3] 李汝.基于斑馬魚行為學(xué)的水質(zhì)監(jiān)測(cè)預(yù)警技術(shù)試驗(yàn)研究[J].濟(jì)南：山東建筑大學(xué)，2015：6.

[4] 邢軍.苯、氯苯、苯酚、4-氯酚對(duì)斑馬魚、孔雀魚、劍尾魚的急性毒性[J].生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào)，2011，20（11）：1720-1724.

[5] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)：GB 5749—2006[S/OL].[2016-09-21].http：//www.51z6z.com/biaozhun/36161.html.

[6] 北京市環(huán)境保護(hù)監(jiān)測(cè)中心.水質(zhì) 物質(zhì)對(duì)淡水魚（斑馬魚）急性毒性測(cè)定方法：GB/T13267—91[S/OL].[2016-09-20].http：//www.51z6z.com/biaozhun/2178.html.

[7] 吳聲敢，吳長(zhǎng)興，陳麗萍，等.兩種有機(jī)硅表面活性劑和3種農(nóng)藥對(duì)斑馬魚的急性毒性與聯(lián)合毒性研究[J].農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2009，11（1）：145-148.

[8] 吳聲敢，吳長(zhǎng)興，陳麗萍，等.4種有機(jī)硅表面活性劑對(duì)斑馬魚的急性毒性與安全評(píng)價(jià)[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009，21（4）：395-398.