蘿卜葉不同萃取物對乙酰膽堿酯酶抑制活性研究

王樂　黃明遠　高品一　劉學(xué)貴

摘要 [目的]研究蘿卜葉不同萃取組分對乙酰膽堿酯酶的抑制活性。[方法]通過對蘿卜葉水提原液、水提不同萃取組分及萃取后的水相進行乙酰膽堿酯酶抑制活性測試，對蘿卜葉抑制乙酰膽堿酯酶能力進行評價。[結(jié)果]以石杉堿甲為對照，蘿卜葉不同萃取物對乙酰膽堿酯酶的抑制能力從大到小依次為石杉堿甲、二氯甲烷組分、乙酸乙酯組分、石油醚組分、正丁醇組分、水相、蘿卜葉水提原液。[結(jié)論]蘿卜葉具有較好的乙酰膽堿酯酶抑制活性，并呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。

關(guān)鍵詞 不同萃取組分；乙酰膽堿酯酶；抑制活性；蘿卜葉水提原液；水相

中圖分類號 S188 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）01-0120-02

Study of Inhibitory Activity of Different Extracts from Radish Leaves to Acetylcholinesterase

WANG Le， HUANG Mingyuan， GAO Pinyi， LIU Xuegui*

（College of Pharmaceutical and Biological Engineering， Shenyang University of Chemical Technology， Shenyang， Liaoning 110142）

Abstract [Objective] To study inhibitory activity of different extraction fractions from radish leaves to acetylcholinesterase. [Method] The inhibitory activities of different polarities of water extracts from radish leaves to acetylcholinesterase were determined and the ability of radish leaves inhibiting acetylcholinesterase was evaluated. [Result] Using huperzine as the control， the order of inhibiting ability from strong to weak is huperzine， dichloromethane layer， ethyl acetate layer， petroleum ether layer， butanol layer， waterphase， radish leaf extract . [Conclusion] Radish leaves have a good inhibitory activity to acetylcholinesterase and present a concentrationdependent manner.

Key words Different extraction fractions；Acetylcholinesterase；Inhibitory activity；Radish leaf extract；Waterphase

蘿卜（Raphanus sativus L.）古漢語中又稱萊菔、雹突、菜頭等，始載于《唐本草》，是生活中常見的蔬菜，為十字花科蘿卜屬1～2年生草本植物[1]。蘿卜根部為主要的食用部位；蘿卜葉又名萊菔葉、蘿卜纓，其纓葉性味甘苦平，主要功能消食理氣[2]。化學(xué)分析證明，蘿卜葉的主要成分是精油和多種維生素，還含微量元素和抗病毒成分[1-2]。

在生物體內(nèi)，乙酰膽堿酯酶（AChE）是以一種蛋白質(zhì)為結(jié)構(gòu)的生物催化劑，在神經(jīng)傳導(dǎo)過程中起關(guān)鍵作用，能降解乙酰膽堿，使得神經(jīng)遞質(zhì)在突觸后膜上失去活性，從而保證信號的正常傳導(dǎo)。AChE在體內(nèi)一般有6種不同的分子形式，包括3種球形與3種膠原尾樣亞基連接形成的不對稱形式，其主要在肝臟中合成，AChE在人體的紅細胞、內(nèi)皮細胞、胸腺細胞、肝細胞甚至在骨細胞中廣泛表達[3]。乙酰膽堿酯酶抑制劑（AChEI）一般是從天然產(chǎn)物中提取出來的，主要為生物堿類、萜類、酚類等[4]。在天然產(chǎn)物中分離提取AChEI目前已經(jīng)成為醫(yī)藥研究的重點[3-6]。筆者通過對蘿卜葉水提原液、水提不同萃取成分及萃取后的水相進行乙酰膽堿酯酶抑制活性研究，旨在為發(fā)現(xiàn)天然乙酰膽堿酯酶抑制劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象。

白蘿卜葉產(chǎn)于遼寧省沈陽市，經(jīng)鑒定為蘿卜的葉子。

1.1.2 主要儀器。

電子天平TD5102（余姚市金諾天平儀器有限公司），ZF-20D暗箱式紫外分析儀（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司），Biotek Synergy2多功能酶標儀（基因有限公司），薄層色譜展開缸（上海信宜儀器廠制造），HZC 超聲波清洗器（福州志科學(xué)儀器公司），UV-3200PC紫外可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司），RE-5205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮有限公司）。

1.1.3 主要試劑。

二甲基亞砜（DMSO，博迪化工股份有限公司），乙酰膽堿酯酶（AChE，北京索萊寶科技公司），PBS粉末（北京索萊寶科技公司），石杉堿甲對照品（北京索萊寶科技公司），二硫二硝基苯甲酸（DTNB，北京索萊寶科技公司），碘代硫代乙酰膽堿（ATCI，北京索萊寶科技公司），其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 蘿卜葉不同萃取組分的制備。

將4 kg干燥的蘿卜葉放在恒溫水浴鍋中，設(shè)置溫度為20 ℃，加8 L蒸餾水，浸泡水解18 h；提取3次，減壓濃縮，得到濃縮液4 000 mL。取1 000 mL濃縮液，分別用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇1 000 mL萃取3次，萃取完畢，旋蒸，揮干，制得4個不同極性萃取組分的浸膏，待用[5]。

1.2.2 樣品溶液的配制。

將蘿卜葉中不同萃取組分加入不同劑量的0.1% PBS-DMSO溶液分別配制成濃度為2、100、400、800 μg/mL的樣品儲備液，待用。

1.2.3 其他溶液的配制。

1.2.3.1

PBS緩沖液的配制。

將PBS粉末通過定容配制成pH 7.4、0.1 mol/L的PBS緩沖液。

1.2.3.2

P-D溶液的配制。

量取10 μL二甲基亞砜至15 mL的EP管中，加入9.99 mL PBS緩沖液，配制成P-D溶液。

1.2.3.3

DTNB的配制。

稱取40 mg DTNB加入無水乙醇將其配制成10 mmol/L的溶液，將溶液保存在4 ℃環(huán)境中。

1.2.3.4

底物ATCI的配制。

準確稱取43 mg ATCI加入無水乙醇將其配制成15 mmol/L的ATCI溶液。

1.2.4 活性測試試驗。

1.2.4.1 原理。

由于碘代硫代乙酰膽堿在AChE的作用下能夠分解生成碘代硫代膽堿，碘代硫代膽堿與顯色劑（DTNB）反應(yīng)生成5-巰基-2-硝基苯甲酸，而生成的5-巰基-2-硝基苯甲酸能夠在405 nm下具有紫外光吸收的黃色物質(zhì)[5]，反應(yīng)原理方程式見圖1。

1.2.4.2 步驟。

主要采用改良的酶標儀法（Ellman法[6]）對蘿卜葉不同萃取組分進行測試，步驟主要在于樣品組、樣品本底組以及對照組之間通過檢測其吸光度值來觀察乙酰膽堿酯酶抑制活性。

樣品組：在96孔酶標板上中依次加入140 μL 0.1 mol/L pH 7.4的PBS緩沖液、20 μL樣品溶液、15 μL 0.4 U/mL AChE，在4 ℃條件下反應(yīng)20 min。加入10 μL 15 mmol/L底物ATCI，再加入20 μL 10 mmol/L DTNB，在37 ℃條件下反應(yīng)30 min，用酶標儀在405 nm處測定其吸光度值，每組試驗做3次平行試驗。

樣品本底組：用15 μL PBS緩沖液代替15 μL AChE溶液，其他條件不變。

空白對照組：用20 μL PBS緩沖液代替20 μL樣品溶液，其他條件不變。

完全抑制對照組：用20 μL PBS緩沖液配制石杉堿甲溶液（0.1 mg/mL）。

抑制率=[（空白組-完全抑制組）-（樣品組-樣品本底組）]/（空白組-完全抑制組）×100%，各組值均為吸光度值。

2 結(jié)果與分析

蘿卜葉經(jīng)過水提取以及石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，得到石油醚組分、二氯甲烷組分、乙酸乙酯組分、正丁醇組分、蘿卜葉水提原液、水相和石杉堿甲7個樣品溶液。對這7個樣品分別進行乙酰膽堿酯酶抑制活性檢測[7]。

由圖2可見，蘿卜葉不同萃取組分樣品均表現(xiàn)出一定的乙酰膽堿酯酶抑制活性，且其乙酰膽堿酯酶抑制活性與其樣

品濃度均表現(xiàn)出一定的濃度依賴關(guān)系。在樣品濃度梯度較

低時，抑制率隨著濃度增加近似為線性關(guān)系， 而濃度較大時抑制率趨于穩(wěn)定。其中二氯甲烷組分具有相對最強的AChE抑制活性，對其相關(guān)數(shù)據(jù)進行分析得其IC50為344.02 μg/mL。 乙酸乙酯及石油醚組分對AChE也表現(xiàn)出較好的抑制活性，且呈明顯的線性相關(guān)， IC50分別為369.27、371.12 μg/mL。正丁醇組分的AChE活性相對較弱。蘿卜葉水提取原液及水相的AChE抑制效果不佳。

根據(jù)7個樣品的抑制曲線，確定各樣品的IC50值（表1）。結(jié)合圖2和表1可以確定，7個樣品的抑制能力從大到小依次為石杉堿甲、二氯甲烷組分、乙酸乙酯組分、石油醚組分、正丁醇組分、水相、蘿卜葉水提原液。但參考陽性對照石杉堿甲，發(fā)現(xiàn)蘿卜葉水提取物各萃取組分的乙酰膽堿酯酶抑制活性相對偏低。

3 結(jié)論

對蘿卜葉中不同萃取組分及其AChE抑制活性進行研究，以石杉堿甲為對照品，對蘿卜葉中6個不同萃取組分的乙酰膽堿酯酶抑制活性進行試驗。結(jié)果表明，6個組分樣品均表現(xiàn)出一定的AChE抑制活性，其AChE抑制活性與其樣品濃度均表現(xiàn)出一定的濃度依賴關(guān)系。由6個不同萃取組分樣品的IC50值可知，其抑制AChE的活性從大到小為二氯甲烷組分、乙酸乙酯組分、石油醚組分、正丁醇組分、水相、蘿卜葉水提原液。由此可見，蘿卜葉具有較好的AChE抑制活性，同時為蘿卜葉中AChE抑制活性成分的跟蹤分離提供試驗依據(jù)。

參考文獻

[1] 汪隆植，何啟偉.中國蘿卜[M].北京：科學(xué)技術(shù)文獻出版社，2005：1-6.

[2] 鄭一美，周福富.萊菔葉的藥效應(yīng)用及有效成分的提取分離研究[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2008，4（11）：49-50.

[3] 張明，李盾，陳儀本，等.乙酰膽堿酯酶分子生物學(xué)研究進展[J].農(nóng)藥，2006，45（1）：8-11.

[4] 楊建紅，陶媛媛，張云梅，等.藥用植物中乙酰膽堿酯酶抑制劑研究進展[J].云南化工，2006，33（6）：78-82.

[5] 張翼，馮妍，李曉明，等.海藻組分抑制乙酰膽堿酯酶活性研究[J].海洋與湖沼，2005，36（5）：459-464.

[6] ELLMAN G L，COURTNEY K D，ANDRES V，Jr，et al.A new and rapid colorimeteric determination of acetylcholinesterase activity[J].Biochem Pharmacol，1961，7（2）：88-95.

[7] 殷帥文，劉麗萍，王安萍，等.17種植物不同溶劑萃取物乙酰膽堿酯酶抑制活性研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（10）：293-296.