超聲波法提取凹葉厚樸內生真菌代謝產物

耿直

摘要 [目的]優化超聲波法提取凹葉厚樸內生真菌代謝產物的工藝。[方法]采用正交試驗設計，以超聲溫度、超聲時間、超聲功率為考察因素，以厚樸酚的含量為指標，采用高效液相色譜法，確定發酵液的最佳超聲提取條件。[結果]最佳超聲提取條件為超聲溫度50 ℃、超聲時間60 min、超聲功率100 kHz。[結論]該方法能夠用于內生真菌發酵液中代謝產物提取。

關鍵詞 凹葉厚樸；內生真菌；超聲提取；正交試驗

中圖分類號 S567.1+1 文獻標識碼

A 文章編號 0517-6611（2017）01-0122-02

Ultrasonic Extraction of Magnolia officinalis Endophytic Fungi Metabolites

GENG Zhi

（Shaanxi Institute of International Trade Commerce， Xian， Shaanxi 712046）

Abstract [Objective] The aim was to optimize the technique for extracting endogenous fungal metabolites from Magnolia officinalis with ultrasonic method. [Method] Using orthogonal test design， with ultrasonic temperature， ultrasonic time， ultrasonic power as investigated factors， the content of magnolol as indicator， adopting HPLC method， the optimum ultrasonic extraction conditions of mycelia were obtained. [Result] The optimum ultrasonic extraction conditions were as following： ultrasonic temperature 50 ℃， ultrasonic time 60 min， ultrasonic power 100 kHz. [Conclusion] The method can be used to extract endogenous fungal metabolites in the fermented liquid.

Key words Magnolia officinalis；Endophytic fungi；Ultrasonic extraction；Orthogonal test

凹葉厚樸（Magnolia officinalis Rehd.et Wils.var.biloba Rehd.et Wils.）為木蘭科木蘭屬厚樸植物（Magnolia officinalis Rehd.et Wils.）的變種，是我國特有的樹種，具有很高的藥用價值。凹葉厚樸在臨床上多以復方入藥，故用量很大，因厚樸藥材的藥用部位為干燥的根、皮，導致這一資源的破壞，這極度不符合資源合理利用和環境保護[1]。

植物內生真菌是屬于天然組成成分，在生物發展史上有極其豐富的代謝產物。研究表明，幾乎所有的植物組織中都含有內生真菌。另有大量研究報告指出，在現有的植物體中，其內生真菌也能夠產生與宿主相同或相似的次生代謝產物[2]。

厚樸內生真菌長期生活在厚樸植物體內，在漫長的進化過程中，可以產生與厚樸植物化學成分相似的代謝產物，即厚樸酚與和厚樸酚[3]。由于內生真菌代謝產物成分復雜多樣，而傳統的提取方法嚴重不足，影響內生真菌的開發與利用，因此，必須開發新的技術提取。超聲波提取技術發展日益成熟化，用該技術提取內生真菌發酵液中生理活性物質逐漸成為趨勢[4]。目前，有學者對厚樸內生真菌的分離鑒定進行了研究[5-6]，但對厚樸內生真菌代謝產物的報道較少。筆者利用超聲提取技術對凹葉厚樸的內生真菌代謝產物進行研究，深入了解超聲提取技術對內生真菌代謝產物的提取效率，為超聲提取內生真菌代謝產物的合理性提供理論依據，以提高中藥資源凹葉厚樸的利用率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源。菌種于4 ℃冰箱保存在陜西國際商貿學院微生物實驗室，編號YX-24（分離自凹葉厚樸）。

1.1.2 試劑。厚樸酚對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號140823）；KH2PO4（天津市紅巖化學試劑廠）；MgSO4·7H2O（天津市津北精細化工有限公司）；葡萄糖（天津市河東區紅巖試劑廠）；其余試劑為分析純；水為純凈水。

1.1.3 儀器。

電子天平（YP-2102，上海光正醫療儀器有限公司）；立式壓力蒸汽滅菌器（LDZM-40KC，上海申安醫療器械廠）；恒溫恒濕培養箱（SPX-150-C，上海瑯玕實驗設備有限公司）；恒溫振蕩器（HZQ-R，哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司）；旋轉蒸發器（RE-52AA，上海亞榮生化儀器廠）；Waters高效液相色譜儀（e2695型，上海冉超光電科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 培養基的配制。液體發酵培養基（PDA培養基）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、KH2PO4 3 g、MgSO4·7H2O 0.75 g、水1 000 mL，121 ℃滅菌15 min。

1.2.2 液體發酵培養。

配制好的液體培養基（按“ 1.2.1 ”培養基配方）滅菌后于超凈工作臺靜置過夜，確認其沒有污染后，將菌株接種于內裝液體發酵培養基的三角瓶中，每菌株3瓶，于28 ℃、140 r/min搖床上培養3～4 d。

1.2.3 色譜條件。Waters e2695型高效液相色譜儀，流動相為甲醇-水（78 ∶22），柱溫25 ℃，檢測波長294 nm。

1.2.4 對照品溶液制備。精密稱定厚樸酚對照品適量，加甲醇定容至25 mL，即得。

1.2.5 供試品溶液制備。待菌絲體布滿培養基后，抽濾發酵液，菌液加等體積的乙酸乙酯萃取3次，收集乙酸乙酯相。菌絲放入-20 ℃冰箱冷凍，待菌絲凍融后，取出，放入研缽研磨至菌絲體完全破碎，呈糊狀，同樣加等體積乙酸乙酯，在超聲條件下提取，收集乙酸乙酯相。

合并上述兩者乙酸乙酯相，于55 ℃旋轉蒸發至干，以甲醇定容至25 mL容量瓶中，作為供試品，待測。

1.2.6 正交試驗設計。以超聲溫度（A）、超聲時間（B）、超聲功率（C）為考察因素，選取3因素3水平進行多因素的正交試驗，按L9（34）進行試驗（表1），以厚樸酚的含量為指標，采用高效液相色譜法，確定菌絲的最佳超聲提取條件。

2 結果與分析

由表2可見，各因素對凹葉厚樸內生真菌代謝產物厚樸酚提取量的影響程度從大到小依次為C、A、B，即超聲功率是影響厚樸酚提取量的主要因素。凹葉厚樸內生真菌發酵液的最佳超聲提取工藝條件為A3B2C2，即超聲溫度為50 ℃、超聲時間為90 min、超聲功率為90 kHz。然而由于因素B中各均值數值相差不大，且超聲提取時間過長導致溫度升高，影響厚樸酚含量；另外，超聲波提取功率越高對細胞的破壞越徹底，內生真菌代謝產物提取量越多，綜合分析考慮確定最佳超聲提取功率為100 kHz。最終確定最優提取工藝為超聲溫度50 ℃、超聲時間60 min、超聲功率100 kHz。

3 結論與討論

試驗結果表明，超聲波法提取凹葉厚樸內生真菌代謝產物最佳超聲提取工藝為超聲溫度50 ℃、超聲時間60 min、超聲功率100 kHz。在對菌絲體的提取時，采用了超聲波萃取技術。超聲功率是影響厚樸酚含量最大的因素，這是因為超聲波在工作時，通過振動、空化效應加快相之間的傳質速度，使有效成分和溶劑的交互作用增強，使有效成分更充分地溶入溶劑，提高有效成分的提取效果。

在對菌絲超聲時，因實驗室超聲波清洗儀的規格原因，在儀器工作一段時間后，很明顯出現溫度上升的趨勢，經過多次試驗測量，結果表明在60 min之內，超聲波清洗儀內水的溫度均高出預設溫度5～7 ℃，因此，在試驗過程中設置溫度時均比正常的試驗溫度低5～7 ℃，且使儀器每工作20 min，間隔10 min，更好地控制變量對試驗結果的影響，控制試驗結果的準確性。

在試驗中，對菌液進行等量的乙酸乙酯萃取3次，使得菌液中含有的有效成分充分地融入乙酸乙酯相中。每次發酵液中菌絲體的量不是很多，相比菌液的量明顯很少，且在提取菌絲體時，僅以等量的乙酸乙酯超聲萃取1次。可見，原本就不多的菌絲體含量相比菌液顯得微不足道。因此，前人在研究各種內生真菌的發酵液時，有的直接就舍棄了菌絲體的提取。該試驗不但研究菌絲體，且研究用超聲萃取技術提取菌絲體的最佳提取工藝。

參考文獻

[1]

斯金平，童再康，曾燕如，等.厚樸種質資源評價與利用研究[J].中藥材，2002，25（2）：79-81.

[2] 王興紅.內生真菌與天然產物研究進展[J].中草藥，2007，38（1）：140-143.

[3] 馬昭，唐承晨，張純，等.內生菌與宿主植物關系對中藥材道地性研究的啟示[J].上海中醫藥大學學報，2015，29（6）：4-11.

[4] 楊海麟，呂霞付，楊勝利，等.超聲波在生物發酵工程中的應用[C]//中國生物工程學會.中國生物工程學會第三次全國會員代表大會暨學術討論會論文摘要集.北京：中國生物工程學會，2001：1.

[5] 龐蕾，嚴鑄云，郭曉恒，等.厚樸內生真菌的研究（Ⅰ）：菌種分離及其鑒定[J].時珍國醫國藥，2006，17（10）：2013-2014.

[6] 仝保慧，關銘.厚樸內生真菌的分離鑒定及藥理學活性的分析[J].湖南中醫藥大學學報，2009，29（7）：36-40.