連芩解毒顆粒提取工藝研究

鄧桂明，何 海，葛金文*，肖小芹，陳 鎮，張志國，吳 萍，戴 冰，歐陽林旗，肖望重，向 彪

（1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫藥大學中西醫結合學院，湖南 長沙 410208）

連芩解毒顆粒提取工藝研究

鄧桂明1,2，何 海1，葛金文2*，肖小芹2，陳 鎮1，張志國1，吳 萍1，戴 冰1，歐陽林旗1，肖望重1，向 彪1

（1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫藥大學中西醫結合學院，湖南 長沙 410208）

目的優選連芩解毒顆粒的最佳提取工藝。方法以鹽酸小檗堿及黃芩苷的轉移率為考察指標，結合單因素及正交試驗法，對連芩解毒顆粒的提取工藝進行優化。結果優選出連芩解毒顆粒的最佳提取工藝為：藥材用60%乙醇浸泡1.0 h，回流提取 2 次，第一次 1.5 h，料液比 1∶10（g∶mL），第二次 1 h，料液比 1∶8（g∶mL）。結論優選的提取工藝穩定、可行，為連芩解毒顆粒的生產制備提供實驗依據。

連芩解毒顆粒；正交試驗；提取工藝；鹽酸小檗堿；黃芩苷

連芩解毒顆粒原方為湖南中醫藥大學第一附屬醫院耳鼻喉科協定制劑處方。由黃連、黃芩、黃芪等組成，具有清熱解毒，扶正培本之功效，用于鼻炎、咽炎、鼻咽癌及EB病毒陽性的鼻咽癌高危人群的抗病毒治療。本實驗根據方中各藥味的化學成分及藥理作用，以鹽酸小檗堿及黃芩苷的轉移率為考察指標，結合單因素及正交試驗法，優選最佳的提取工藝，為連芩解毒顆粒的研發提供實驗依據。

1 材料與儀器

1.1 材料

鹽酸小檗堿、黃芩苷對照品 (批號分別為110713-201009、100715-201002，供含量測定用，中國藥品生物制品檢定所)，制備連芩解毒顆粒所用藥材經湖南中醫藥大學第一附屬醫院張志國教授鑒定為正品，水為蒸餾水，流動相用色譜純試劑，其余所用試劑均為分析純。

1.2 儀器

Agilent1100系列高效液相色譜儀 (DAD檢測器，Agilent1100 工作站)；Adventurer TM SOPYJ-020萬分之一電子分析天平 (奧豪斯國際貿易上海有限公司)；KQ-600型超聲波清洗器(上海科導超聲儀器有限公司)；DHG-9076A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；LH-1型電熱恒溫真空干燥箱 （上海醫療器械七廠）；SHB-III型循環水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）。

2 方法與結果

圖1 連芩解毒顆粒HPLC圖

2.1 溶液制備

2.1.1 供試品溶液的制備[1]取已定容連芩解毒顆粒處方的醇提液，搖勻，精密量取25 mL，置蒸發皿中蒸干，放冷，加60%的乙醇50 mL，溶解，搖勻，濾過，精密量取2 mL續濾液，置5 mL量瓶中，加60%的乙醇至刻度，搖勻，即得。

2.1.2 混合對照品溶液的制備[1]分別精密稱取減壓干燥至恒重的鹽酸小檗堿對照品、黃芩苷對照品適量，置50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，得質量濃度分別為0.09 mg/mL、0.048 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2 色譜條件

2.2.1 分析條件 色譜柱：KromasilC18(5 μm，250 mm×4.6 mm)；流動相：甲醇-0.1%磷酸水溶液（48∶52）； 檢測波長分別為 280 nm，345 nm； 流速1 mL/min；柱溫 30℃。

2.2.2 系統適用性試驗 將空白溶液、混合對照品溶液、供試品溶液及陰性供試品溶液依次進樣10 μL，見圖1，結果表明空白溶液及陰性供試品溶液無干擾，混合對照品溶液及供試品溶液中各組分峰分離完全；理論塔板數按鹽酸小檗堿和黃芩苷計均在4 000以上。

2.3 方法學觀察

2.3.1 線性范圍 分別精密吸取上述混合對照品溶液 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mL，置 10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取10 μL，注入色譜儀，記錄色譜峰圖，以峰面積為y軸，進樣量為x軸作回歸方程，得鹽酸小檗堿回歸方程為：Y=665.16X+8.026 5，r=0.999 9，黃芩苷回歸方程為：Y=1 014.0X-10.911，r=0.999 3；結果表明：鹽酸小檗堿、黃芩苷進樣量分別在 0.018～0.18 μg、0.0096 μg～0.096 μg時，峰面積和進樣量呈現良好的線性關系。

2.3.2 精密性試驗 精密吸取同一混合對照品溶液10 μL，按照“2.2”項下色譜條件，重復進樣 6 次，記錄峰面積，鹽酸小檗堿、黃芩苷峰面積的RSD分別為2.02%、1.76%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩定性試驗 分別于 0、2、4、6、8、24 h 精密吸取同一供試品溶液10 μL，注入色譜儀，記錄峰面積。鹽酸小檗堿、黃芩苷峰面積RSD分別為2.07%、2.63%。表明樣品在24 h內穩定性良好。

2.3.4 重復性試驗 取同一批次藥材，精密稱定，平分6份，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，按照“2.2”項下色譜條件測得鹽酸小檗堿、黃芩苷含量的RSD分別為1.39%、1.86%，表明方法重復性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗 精密量取6份各供試液1.0 mL，精密加入混合對照品溶液1.0 mL，搖勻，吸取10 μL注入色譜儀。計算鹽酸小檗堿、黃芩苷平均回收率為102.37%、96.72%,RSD為1.01%、1.04%。

2.4 實驗結果

2.4.1 提取方法的觀察 按處方量稱取五味藥材粗粉（90 g），用60%乙醇浸泡1.0 h后超聲提取兩次，第一次 1.5h，料液比 1∶10（g∶mL），第二次 1.0 h，料液比 1∶8（g∶mL）。 同理，選擇 60%乙醇為提取溶媒，回流提取 2 次，第一次 1.5h，料液比 1∶10（g∶mL），第二次 1.0 h，料液比 1∶8（g∶mL），按“2.1”項下方法制備供試品溶液并測定鹽酸小檗堿、黃芩苷的轉移率，比較回流法和超聲法的提取效果，見表1。

表1 提取方法考察

結果表明：回流法提取的鹽酸小檗堿、黃芩苷的轉移率比超聲法提取的均要高，提取方法以回流法較佳。

2.4.2 提取溶劑的考察 取藥材粗粉81 g，分別以蒸餾水，60%乙醇，按 “2.4.1”所述回流提取方法提取2次，分別測定鹽酸小檗堿、黃芩苷的轉移率，見表2。

表2 提取溶劑考察

結果表明：60%乙醇提取鹽酸小檗堿、黃芩苷的轉移率比蒸餾水提取均要高，且水提后得到的溶液黏度較大，含有較多的水溶性雜質，對后續的過濾和濃縮會產生一定的影響，故選擇乙醇為提取溶劑。2.4.3 提取次數的觀察 在上述正交試驗優選的工藝條件基礎上，增加一次提取，考察提取次數對浸出效果的影響，按處方量稱取五味藥材粗粉（90 g），第一次 1.5 h，料液比 1∶10（g∶mL），第二次 1 h，料液比1∶8（g∶mL），第三次 1h，料液比 1∶8（g∶mL），分別收集三次提取液，分別測定鹽酸小檗堿、黃芩苷的轉移率，結果見表3。

表3 提取次數考察

結果表明：第三次提取得到鹽酸小檗堿、黃芩苷的轉移率均小于三次提取總量的10%，故選擇提取兩次合理。

2.4.4 浸泡時間的觀察 取藥材粗粉81g，60%乙醇分別浸泡 0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h 后，按“2.4.1”所述回流提取方法提取2次，分別測定鹽酸小檗堿、黃芩苷的轉移率，結果見表4。

表4 浸泡時間考察

結果表明：延長浸泡時間對鹽酸小檗堿、黃芩苷的轉移率的影響變化不大，結合生產，選擇浸泡時間為1.0小時。

2.4.5 乙醇回流提取正交試驗考察 根據單因素考察結果，為進一步優化提取工藝，選擇乙醇濃度、乙醇用量、提取時間作為觀察因素，以鹽酸小檗堿、黃芩苷轉移率為評價指標，進行綜合評分[2]，用L9（34）正交表安排試驗。工藝因素水平見表5，正交設計與實驗結果見表6，方差分析見表7。

表5 提取工藝因素水平表

表6 正交設計與實驗結果

表7 方差分析表

正交設計與實驗結果表明，直觀分析極差可知，影響提取效果的因素順序為A＞B＞C，方差分析表表明，A、B 因素差異有統計學意義（P＜0.05），且 A、B 因素各水平間差異也有統計學意義（P＜0.05），而C因素差異無統計學意義 （P＞0.05），C 因素各水平間差異也統計學意義（P>0.05），出于節省時間考慮，最終確定該復方的最佳提取工藝為A2B2C1，即最佳提取工藝條件為：五味藥材用60%的乙醇水溶液浸泡1.0 h，回流提取2次，第一次 1.5 h，料液比 1∶10（g∶mL），第二次 1 h，料液比1∶8（g∶mL）。

2.5 提取工藝的驗證實驗考察

根據提取工藝單因素實驗與正交試驗優選的最佳提取工藝條件，擬定工藝驗證實驗，平行提取三份，分別測定鹽酸小檗堿、黃芩苷的轉移率為80.64%和77.47%，結果表明：該結果方法可取。

3 討論

中藥成分復雜、藥效各異，組成復方并非藥物簡單相加，因此對復方中藥一般采取復方提取[3-4]。本實驗在提取工藝設計前根據處方的功能、主治，通過文獻資料的查閱，分析每味中藥的有效成分與藥理作用；結合提取原理與預試驗結果，以君藥黃連中鹽酸小檗堿及臣藥黃芩中黃芩苷的轉移率為考察指標，通過單因素考察及正交試驗，優選最佳的提取工藝[5-6]。結果表明該法簡單、穩定、可靠，可作為連芩解毒顆粒提取工藝。

本試驗結合單因素及正交試驗法，對連芩解毒顆粒的提取工藝進行優化篩選，確認連芩解毒顆粒的最佳提取工藝條件為：60%乙醇浸泡1.0 h，回流提取 2 次，第一次 1.5 h，料液比 1∶10（g∶mL），第二次1 h，料液比 1∶8（g∶mL）。 該工藝穩定，可行，為該制劑的研制提供了科學的實驗依據。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫藥科技出版社,2010.285.

[2]任愛農,高 燃,田耀洲.多指標綜合評分法優選清清顆粒提取工藝[J].中成藥,2008,30（7）:1059-1062.

[3]于秀娟.扶正顆粒劑提取工藝的優化 [J].醫學信息,2012,25(12):165-166.

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[5]常占瑛,劉桂花,高曉黎,等.復方必清片的提取工藝優選[J].中國實驗方劑學雜志,2013,19(22):51-55.

[6]曾 明,吳國海,邊佳明，等.舒通無糖顆粒制備工藝研究[J].中國醫藥導報,2012,9(24):121-123.

（本文編輯 李 杰）

Study on the Extraction Process of Lianqin Jiedu Granule

DENG Guiming1,2,HE Hai1,GE Jinwen2*,XIAO Xiaoqin2,CHEN Zhen1,ZHANG Zhiguo1,WU Ping1,DAI Bing1,OUYANG Linqi1,XIAO Wangzhong1,XIANG Biao1
(1.The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China;2.The College of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China)

ObjectiveTo optimize the extraction technology of Lianqin Jiedu granules.MethodsThe transfer rate of berberine hydrochloride and baicalin rate as indexes,combined with single factor and orthogonal test method,the extraction process of Qinlian Jiedu granule was optimized.ResultsThe optimal extraction process was 60%ethanol immersion 1.0 h,reflux extraction 2 times,the first time 1.5 h,1∶10 (g∶mL),second time 1 h,1∶8 (g∶mL).ConclusionThe optimized extraction technology is stable and feasible,provide experimental basis for industrial production of Lianqin Jiedu granules.

Lianqin Jiedu granule;orthogonal test;extraction process;berberine;baicalin

R283.6

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2017.02.011

2015-11-30

湖南省科技廳博士后基金項目（2014RS4013）；2014年湖南省人力資源和社會保障廳博士后研究人員日常經費資助項目；張志國全國名老中醫藥專家傳承工作室建設項目(國中醫藥人教教育〔2016〕。

鄧桂明，女，在站博士后，副主任藥師，碩士研究生導師，研究方向：藥物新劑型與新技術研究。

*葛金文,男，博士，教授，博士研究生導師，E-mail:40831556@qq.com。

本文引用：鄧桂明，何 海，葛金文，肖小芹，陳 鎮，張志國，吳 萍，戴 冰，歐陽林旗，肖望重，向 彪.連芩解毒顆粒提取工藝研究[J].湖南中醫藥大學學報，2017，37（2）：157-159.