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電針對糖尿病胃輕癱大鼠胃竇部INS及IR表達的影響

2017-07-12 18:12:55楊建文林亞平陳海交張程程劉薇薇
湖南中醫藥大學學報 2017年2期
關鍵詞:血糖糖尿病模型

楊建文,林亞平,陳海交,張程程,劉薇薇,劉 麗,劉 密,彭 艷*

(湖南中醫藥大學,湖南 長沙 410208)

·針灸推拿·

電針對糖尿病胃輕癱大鼠胃竇部INS及IR表達的影響

楊建文,林亞平,陳海交,張程程,劉薇薇,劉 麗,劉 密,彭 艷*

(湖南中醫藥大學,湖南 長沙 410208)

目的觀察電針“足三里”等穴對糖尿病胃輕癱(diabetic gastroparesis,DGP)模型大鼠胰島素及其受體表達的影響,探討電針調整血糖、改善DGP胃腸動力的可能機制。方法將50只SD大鼠隨機分為5組,即空白對照組、DGP模型對照組、電針穴位組、電針非穴組、胃復安對照組,每組10只。造模組按55 mg/kg單次右下腹腔注射2%鏈脲佐菌素 (STZ)聯合高脂高糖不規律飲食建立DGP模型,連續喂養8周,每周用強生穩豪倍易型血糖儀及試紙測量血糖,尿糖試紙測量尿糖。電針穴位取大鼠“足三里”、“梁門”、“三陰交”,電針非穴組取大鼠“足三里”、“梁門”、“三陰交”的穴位對照點,胃復安對照組予1.7%胃復安藥液 (1 ml/100 g)灌胃。治療結束后,以酚紅為標志物,觀察各組大鼠胃排空率及小腸移行率,以ELISA法檢測胃竇部胰島素 (INS)及胰島素受體 (IR)的表達。結果與空白對照組比較,模型組血糖水平、癥狀積分明顯升高,胃排空率、小腸移行率、胃竇部INS、IR含量明顯降低 (P<0.01);與模型組比較,電針穴位組血糖水平及癥狀積分明顯降低,胃排空率及小腸移行率、胃竇組織INS及IR表達升高 (P<0.05,P<0.01),與電針穴位組比較,電針非穴組、胃復安對照組癥狀積分升高、胃竇部INS、IR含量明顯減少(P<0.05,P<0.01)。結論電針能降低DGP大鼠血糖,促進DGP大鼠胃腸動力,其作用機制可能與增加胃竇部INS及IR含量有關。

電針;糖尿病胃輕癱;胃排空率;胰島素;胰島素受體

糖尿病胃輕癱(diabetic gastroparesis,DGP)是糖尿病的常見并發癥之一[1],以胃排空延緩為主要病理特征[2]。DGP發病機制尚不完全清楚,近年來胰島素、干細胞因子、Cajal間質細胞(interstitial cells of cajal,ICC)在糖尿病胃輕癱的發病機制中的作用逐漸得到重視[3-5]。胰島素是于1921年首次發現,主要有胰島β細胞分泌,經血液循環運輸至靶器官,主要分布于肝臟、肌肉等組織[6]。胰島素受體(insulin receptor,IR)是一類跨膜糖蛋白,廣泛分布于多種組織細胞表面。研究發現胰島素通過與其受體結合能保護ICC細胞,從而調節胃腸運動[7]。近年來,開展不少針灸治療DGP的臨床實驗,并取得良好療效[8-10]。但從胰島素細胞水平角度探討電針治療DGP的相關研究鮮有報道。因此,本實驗建立DGP大鼠模型,觀察電針“足三里”對DGP模型大鼠血糖、胃排空率、胃竇部胰島素(insulin,INS)及IR表達的影響,探討電針調整DGP血糖,調節胃腸動力的可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

SD大鼠,SPF級,雌雄各半,體質量 180~220 g,共50只,購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,動物合格證號:43004700017604。所有大鼠均經檢測后,均血糖正常、尿糖陰性可納入實驗。適應性飼養7 d后,隨機挑選10只為空白對照組,其余大鼠造模。均飼養于湖南中醫藥大學實驗動物中心動物房內,溫度25℃,相對濕度40%~60%,自然采光。實驗期間對動物的操作和處置符合科學技術部頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》中相關條文規定。

1.2 主要試劑與儀器

鏈脲佐菌素(美國Sigma公司);胃復安(山西云鵬制藥有限公司);酚紅(天津市光復精細化工研究所);NaOH、三氯乙酸、水合氯醛、檸檬酸鈉(國藥集團化學試劑有限公司);檸檬酸(天津市恒興化學試劑制造有限公司);血糖儀及血糖試紙(美國強生公司 穩豪倍易型);尿糖試紙(廣州市花都高爾寶生物技術有限公司);電針儀(華佗牌SDZ-V型);華佗牌針灸針(蘇州醫療用品廠有限公司生產);臺式高速離心機(長沙湘儀貝克儀器儀表公司 TG16-WS);超低溫冰箱 (海爾 DW-86L626);大鼠INS、InR酶聯免疫試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 造模方法及評定方法

根據參考文獻[11],實驗前所有造模大鼠禁食12 h,禁水 2 h,按55 mg/kg體質量劑量將 STZ[臨用前用0.1 mmol/L(pH4.2,4℃)檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配成2%濃度]于右下腹腔內單次注射,72 h后取尾靜脈血測即刻血糖,即刻血糖≥16.7 mmol/L者作為糖尿病大鼠,配合高脂高糖飼料(普通飼料、熟豬油、蔗糖、奶粉、雞蛋之比為 58∶15∶20∶5∶2)不規律喂養8周,即單日上午和雙日下午進食的方法。空白組予單次右下腹腔注射等容量的0.1 mmol/L(pH 4.2,4℃)檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液,普通飼料規律喂養8周。實驗期間,每周測量血糖、尿糖一次,觀察大鼠的一般情況,并評分。血糖<16.7 mmol/L,尿糖陰性者剔除實驗。DGP模型成功標志[12]:血糖≥16.7 mmol/L,尿糖陽性者;造模組大鼠精神狀態、行為活動、皮毛色澤、大便性狀與空白對照組有明顯差異;造模組胃排空率及小腸移行率與空白對照組有明顯差異。將造模成功的大鼠再次隨機分為模型組、電針穴位組、電針非穴組和胃復安對照組,每組10只。

1.4 各組干預方法

穴位定位是參考李忠仁主編《實驗針灸學》“動物針灸穴位圖譜”[13],并結合解剖學方法及擬人對照法進行大鼠穴位定位。“足三里”:膝關節后外側,腓骨小頭下約5 mm處;“梁門”:以胸骨柄上緣至恥骨聯合連線的上3/4與下1/4交界處為肚臍,胸劍聯合到肚臍連線中點水平線至鎖骨中線相交處;“三陰交”:后肢內踝尖直上10 mm。穴位對照點定位:“足三里”的對照點設在“足三里”水平外側5 mm;“梁門”的對照點設在“梁門”水平外側5 mm;“三陰交”的對照點設在“三陰交”水平內側5 mm。

空白對照組、DGP模型組:將大鼠仰臥位捆綁于鼠板20 min,并予生理鹽水灌胃(1 mL/100 g),連續15 d。

電針穴位組:取同側足三里、梁門、三陰交穴,用0.30 mm×13 mm的華佗牌針灸針直刺3 mm,再循經分別于足三里、梁門、三陰交直下2 mm取一點作為電針連接點 (附點),針刺深度2 mm。將華佗牌SDZ-V型電針治療儀的三組輸出線分別連接在3個穴位及其附點的針灸針上,穴位接負極,附點接正極,采用疏密波(疏波為10HZ,密波為50HZ,疏波時間為10 s,密波時間為15 s);強度為2 mA,電針時間20 min,每天1次,連續15 d,左右兩側穴位交替使用。電針結束后給予生理鹽水灌胃 (1 mL/100 g)

電針非穴組:取同側足三里、梁門、三陰交穴的對照點,用0.30 mm×13 mm的華佗牌針灸針直刺3 mm,再分別于對照點直下2 mm取一點作為電針連接點(附點),針刺深度2 mm,電針操作同電針穴位組,每天1次,連續15 d,左右兩側穴位交替使用。電針結束后給予生理鹽水灌胃(1 mL/100 g)。

胃復安對照組:將大鼠仰臥位固定于鼠板上20 min,予1.7%胃復安藥液 (1 mL/100 g),1次/d灌胃,連續給藥15 d。

1.5 觀察指標及檢測方法

1.5.1 一般情況 每周觀察并記錄大鼠精神狀態、行為活動、皮毛色澤、糞便性狀,并用自擬一般情況評分表評分,計算各組大鼠癥狀積分。見表1。

表1 大鼠一般狀況評分標準

1.5.2 血糖及尿糖測量方法 剪尾采集尾靜脈血,每周以強生穩豪倍易型血糖儀和血糖試紙測血糖并記錄;尿液收集以壓迫大鼠腹部促使膀胱排空,收集尿液,用尿糖試紙測量其尿糖值。

1.5.3 胃排空率測定方法[14-15]治療結束后,將所有大鼠禁食24 h,禁水2 h。每只大鼠給予50 mg/dL酚紅溶液2 mL灌胃,20 min后處死,剖腹,結扎賁門和幽門,取出整個鼠胃,沿胃大彎切開,以蒸餾水沖洗胃內容物,定容為20 mL。再加入0.5 mol/L Na0H 20 mL攪拌混勻,靜置1 h后取5 mL上清液,加入20%三氯乙酸0.5 mL去蛋白,以3500 r/min(離心半徑0.1 m)離心10 min,取上清液用分光光度計在560 nm波長下測定吸光度值(OD)。另取酚紅溶液2 mL,先后加入蒸餾水18 mL、0.5 mol/L Na0H 20 mL、20%三氯乙酸 4 mL攪拌混勻,測定吸光度值。大鼠胃排空率=(1-實測酚紅吸光度/標準酚紅吸光度)×100%。

1.5.4 小腸移行率測定方法[14-15]打開大鼠腹腔后迅速取出小腸,輕輕剝離后直鋪于冰面上,先用肉眼觀察小腸被酚紅染成紅色的末端,用眼科剪在該末端剪一小口,在此處滴少量0.5 mol/L Na0H溶液,若變成紫色則是酚紅所到達的部位。再在此紫色區域各滴少量0.5 mol/L Na0H溶液以確定酚紅所到達的實際部位。用直尺測量幽門到回盲瓣全長(A)及幽門至酚紅染成紅色末端距離(a)。小腸移行率為幽門至酚紅染成紅色末端距離與幽門到回盲瓣全長的百分率為小腸移行率。即小腸移行率=a/A×100%。

1.5.5 胃竇INS及IR檢測 大鼠麻醉處死后,迅速剪取胃竇部組織一塊,保存至-80℃冰箱,待測。按照試劑盒說明依次操作采用ELISA法檢測。

1.6 統計方法

2 結果

2.1 各組大鼠癥狀積分情況比較

與造模前比較,造模后模型組、電針穴位組、電針非穴組、胃復安對照組大鼠的精神狀態、行為活動、皮毛色澤、大便性狀均出現明顯改變,與正常對照組比較有顯著差異(P<0.01)。連續干預15 d后,電針穴位組大鼠精神狀態、行為活動、皮毛色澤、大便性狀較前有明顯改善(P<0.01),電針穴位組大鼠精神狀態、行為活動、皮毛色澤、大便性狀較模型組、電針非穴組、胃復安組有明顯改善 (P<0.01,P<0.05)。 見表2。*

表2 各組大鼠癥狀積分情況比較 (分,±s,n=10)

表2 各組大鼠癥狀積分情況比較 (分,±s,n=10)

注:①組內比較:與造模前比較△△P<0.01,與造模后比較☆☆P<0.01;②組間比較:與空白對照組比較▲P<0.01,與模型組比較◆◆P<0.01,與電針非穴組比較★P<0.05,與胃復安組比較*P<0.05。

2.2 各組大鼠血糖水平比較

造模后模型組、電針穴位組、電針非穴組、胃復安對照組血糖水平較前明顯升高,與空白對照組亦有顯著差異(P<0.01)。治療15天后,電針穴位組血糖水平較造模后下降,且電針穴位組血糖水平較治療后模型組下降(P<0.05),見表3。

表3 各組大鼠血糖水平比較 (mmol/Ls,n=10)

表3 各組大鼠血糖水平比較 (mmol/Ls,n=10)

注:①組內比較:與造模前比較△△P<0.01;與造模后比較☆P<0.05;②組間比較:與空白對照組比較●●P<0.01,與模型組比較▲P<0.05。

組別 造模前 造模后 治療后空白對照組 6.09±0.99 5.29±0.50 5.61±1.24模型組 6.69±1.30 28.93±1.75△△●● 25.72±3.33●●電針穴位組 6.37±0.55 27.67±2.80△△●● 22.62±4.09☆●●▲電針非穴組 6.32±1.01 27.79±2.52△△●● 24.37±3.55●●胃復安對照組 6.84±0.93 26.45±2.68△△●● 23.21±3.16●●F0.93 43.25 66.46P0.46 0.00 0.00

2.3 各組大鼠胃排空率與小腸推進率比較

與空白對照組比較,模型組大鼠胃排空率、小腸移行率均明顯降低 (P<0.01),說明造模后DGP模型大鼠胃腸排空時間延長,結合癥狀積分和血糖,說明造模成功;與模型組比較,治療后電針穴位組胃排空率、小腸移行率升高 (P<0.05,P<0.01),說明電針能改善改善DGP大鼠胃排空,促進胃腸道運動。見表4。

表4 各組大鼠治療后胃排空率、小腸推進率的比較 (%,±s)

表4 各組大鼠治療后胃排空率、小腸推進率的比較 (%,±s)

注:與空白組比較●●P<0.01;與模型組比較▲▲P<0.01,▲P<0.05。

組別 n 胃排空率 小腸推進率空白對照組 10 70.14±15.50 66.71±12.38模型組 10 47.10±14.46●● 37.53±7.25●●電針穴位組 10 64.63±18.28▲ 52.65±9.84●●▲▲電針非穴組 10 58.65±15.64 48.84±6.41●●胃復安對照組 10 63.00±12.15 52.41±11.09●●F3.18 11.67P0.22 0.00

2.4 各組大鼠胃竇組織INS、IR含量比較

與空白對照組比較,模型組為胃竇組織INS、IR含量明顯下降(P<0.01);與模型組比較,電針穴位組胃竇組織INS、IR含量顯著升高,電針非穴組、胃復安對照組胃竇組織INS含量明顯增加 (P<0.05,P<0.01);與電針穴位組比較,電針非穴組、胃復安對照組胃竇組織 INS、IR 含量明顯減少 (P<0.05,P<0.01)。 見表5。

表5 各組大鼠胃竇組織INS、IR含量比較 (mIU/L±s)

表5 各組大鼠胃竇組織INS、IR含量比較 (mIU/L±s)

注:與空白組比較●●P<0.01,與模型組比較▲P<0.05,▲▲P<0.01,與電針非穴組比較★P<0.05,與胃復安組比較◆◆P<0.01。

組別 n INS IR空白對照組 10 12.08±1.65 5.98±1.10模型組 10 9.35±2.27●● 4.92±0.73●●電針穴位組 10 13.12±1.19▲▲★◆◆ 6.41±0.62▲▲★◆◆電針非穴組 10 11.47±1.34▲▲ 5.51±0.91胃復安對照組 10 10.96±1.89▲ 5.54±0.83FP6.66 4.28 0.00 0.00

3 討論

中醫古籍中沒有明確的“糖尿病胃輕癱”病名,根據病史和臨床表現,多認為糖尿病胃輕癱是以消渴病為基礎的脾胃病,屬于中醫學的 “痞滿”、“反胃”、“嘔吐”等范疇。針灸治療DGP立足于辨證論治,從整體出發,健脾和胃、疏經通絡、調理臟腑,作用于DGP發病的多個環節,標本兼治,從多層次、多角度發揮作用。“足三里”為胃經之合穴,又為胃經之下合穴,具有理氣和胃之效,大量文獻研究表明電針足三里能夠提高胃排空速度[16-17]。梁門穴具有和胃理氣,健脾和中的功效,有研究證實“梁門穴”對胃粘膜有保護作用[18-19]。“三陰交”為足三陰經之交會穴,研究發現電針“三陰交”等穴能改善胃運動,其作用主要通過調節胃腸激素實現[20-21]。諸穴配伍具有補益脾胃、和胃降逆、理氣活血、疏通經絡的作用。

ICC是胃腸道中一類特殊間質細胞,為胃腸慢波電位的起搏者和傳播者,主要參與胃腸基本電節律的調控和神經遞質的信號轉導。有研究發現DGP患者及動物模型均存在ICC數目減少、結構破壞、且與神經末梢及平滑肌連接減少。ICC異常可能是糖尿病胃腸道功能紊亂的機制之一[22]。INS是由胰臟內的胰島β細胞受內源性或外源性物質如葡萄糖、胰高血糖素等的刺激而分泌的一種蛋白質激素,主要分布于肝臟、肌肉、脂肪等組織,其最明顯的作用是促進合成代謝[6]。IR是一類具有酪氨酸蛋白激酶活性的跨膜糖蛋白,由α、β各兩個亞單位組成,廣泛分布于各型細胞表面如胃平滑肌細胞,與其配體INS結合后使其自身磷酸化,激活胰島素受體底物(IRS),介導細胞的代謝、生長、分化、凋亡等[23]。既往研究認為高血糖是糖尿病胃輕癱胃腸道ICC病變的重要機制,胰島素通過控制血糖對ICC起保護作用。但有研究發現糖尿病小鼠胃腸道ICC網絡破壞與INS/IR信號減弱有關,而非高血糖所致。并做進一步研究推測胰島素可能直接作用于胃平滑肌細胞相應受體,促進細胞生長、抑制其凋亡,保護胃平滑肌細胞,從而促進胃腸運動[7,24]。

有實驗研究表明糖尿病合并胃腸動力障礙與胃腸道INS、IR含量減少有關[24]。本研究結果提示,胃腸運動功能低下與胃竇部INS及IR含量下降有關,這與以往研究一致。并進一步觀察發現,電針穴位組大鼠癥狀積分、血糖水平均較模型組下降,胃排空率及小腸移行率升高,表明電針“足三里”等穴能促進DGP模型大鼠胃腸運動,改善DGP癥狀,并且可能通過促進胃腸運動從而調節大鼠血糖水平。同時,本研究結果顯示電針穴位組大鼠胃竇部INS、IR含量較模型組均有明顯升高,提示電針“足三里”等穴改善胃腸動力可能通過增加胃竇部INS、IR含量有關。

在實驗過程中,每周觀察并記錄大鼠精神狀態、行為活動、皮毛色澤、糞便性狀,并用自擬一般情況評分表評分,每組數據采集時間相同,胃竇組織采集的時間點亦相同,本實驗結果顯示,電針穴位組癥狀積分較電針非穴組、胃復安對照組明顯降低,而電針穴位組胃竇部INS、IR含量較電針非穴組、胃復安對照組明顯升高(P<0.05,P<0.01),表明電針穴位組改善DGP癥狀的效應明顯優于電針非穴組、胃復安對照組,可能與電針增加胃竇部INS、IR含量,促進胃排空有關。而電針非穴組癥狀積分、胃竇部INS及IR含量與胃復安對照組比較無統計學意義(P>0.05)。

本實驗研究結果顯示,電針“足三里”等穴能改善DGP癥狀,促進胃腸功能,調節血糖水平,可能與電針增加胃竇部INS、IR含量有關,這一過程涉及的機制十分復雜,有待后續做進一步研究。

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(本文編輯 匡靜之)

Effects of Electroacupuncture on the Expression of INS and IR in Gastric Antrum of Diabetic Gastroparesis Rats

YANG Jianwen,LIN Yaping,CHEN Haijiao,ZHANG Chengcheng,LIU Weiwei,LIU Li,LIU Mi,PENG Yan*

(Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China)

ObjectiveTo observe the effects of electroacupuncture (EA)stimulation at"Zusanli"etc.on level of insulin(INS)and insulin-like receptor(IR)in diabetic gastroparesis(DGP)rats,so as to investigate its mechanism underlying adjusting blood glucose level and improving gastrointestinal motility.MethodsFifty Sprague-Dawley(SD)rats were randomly divided into five groups:black control group,DGP model group,EA acupoint group,EA non-acupoint group,metocloppramide group,10 rats in each group.The DGP models were established by intraperitoneal injection of 2%concentration of streptozotocin(STZ,55 mg/kg)and by feeding the ratswith high fat-sugarforage forirregularly 8 weeks.Blood glucose ofallrats were determined by blood glucose meters and test strips produced by American Johnson company and its urine sugar by tes-tape for every week.The EA was performed to"Zusanli","Liangmen","Sanyingjiao"and non-acupoints.The metocloppramide group were received 1.7%concentration of metocloppramide (1 mL/100 g).After treatment,with 50 mg/dL phenol red solution as maker,the gastric empting rates (GER)were identified by its absorbance values,and the intestinal propulsion rats(IPR)were assessed by measuring the ratio of the distance of phenol red running in the intestine and the total length.The insulin(INS)and insulin-like receptor(IR)level in gastric antrumwere detected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).ResultsCompared with the normal control group,the blood glucoses and symptom score in the model group were significantlyincreased,whileGER,IPR and antrum INS and IR decreased (P<0.01).In comparison with themodelgroup,the blood glucoses and symptom score obviously diminished after EA stimulation of acupoint,while the GER,IPR,antrum INS and IR were respectively raised (P<0.05,P<0.01).Compared with EA acupointgroup,the INS and IR in gastric antrum markedly increased in EA non-acupoint group,while the symptom score reduced(P<0.05,P<0.01).ConclusionEA stimulation can adjust blood glucose level and improve gastrointestinal motility,which may be closely associated with its effects of raising INS and IR in gastric antrum.

electroacupuncture;diabetic gastroparesis;gastric empting rates;insulin;insulin-like receptor

R245.9

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2017.02.016

2016-08-28

國家自然科學基金項目(81403487);湖南省教育廳青年基金(14B128,14B129)。

楊建文,女,在讀碩士研究生,研究方向:針灸治病作用機制的研究。

* 彭 艷,女,副教授,E-mail:penyatcm@126.com。

本文引用:楊建文,林亞平,陳海交,張程程,劉薇薇,劉 麗,劉 密,彭 艷.電針對糖尿病胃輕癱大鼠胃竇部 INS及 IR 表達的影響[J].湖南中醫藥大學學報,2017,37(2):172-176.

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