蘋果多酚及其活性單體的提取·分離純化及降脂效果研究

李新明 李群 高忠東 王峰田志芳 徐琳 王賢萍 劉森

摘要 [目的]分離并分析蘋果多酚組分及活性單體純度，并評價了它們的降脂活性。[方法] 利用乙醇提取蘋果多酚，并分離純化了4種（綠原酸、兒茶素、根皮苷、槲皮素）活性單體，采用高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用分析多酚組分及活性單體純度，建立小鼠糖尿病模型。[結果]蘋果多酚中綠原酸的含量是35.207%、兒茶素3.991%、根皮苷15.662%、槲皮素0.274%。4個活性單體成分（綠原酸、兒茶素、根皮苷、槲皮素），經(jīng)過液相質(zhì)譜分析，綠原酸的純度是99.298%、兒茶素99.426%、根皮苷99.857%、槲皮素99.317%。動物試驗表明，蘋果多酚、綠原酸、兒茶素、根皮苷、槲皮素均能有效降低糖尿病鼠血總膽固醇（TG）、甘油三脂（TC）、低密度脂蛋白（LDL-c）水平，增加血高密度脂蛋白（HDL-c）水平。相比較蘋果多酚，4種單體（綠原酸、兒茶素、根皮苷、槲皮素）均顯示了更好的降脂活性。其中，根皮苷的降脂效果最好。[結論] 蘋果多酚及活性單體有著較好的降脂活性。

關鍵詞 蘋果多酚；根皮苷；兒茶素；綠原酸

中圖分類號 TQ914.1 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）13-0085-04

Extraction， Isolation and Purification of Apple Polyphenol and Its Active Monomers and Their Lowing-fat Effect

LI Xin-ming， LI Qun， GAO Zhong-dong et al

（Institute of Agricultural Products Processing， Shanxi Academy of Agricultural Sciences， Taiyuan， Shanxi 030031）

Abstract [Objective] To evaluate the lowing-fat effect of apple polyphenol and its active components. [Method] Apple polyphenol was extracted using ethanol， and four active monomers （chlorogenic acid， catechin， phlorizin， quercetin） were isolated and purified. High performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry technology was used for analyzing components of apple polyphenol and purity of active monomers. A mice diabetes model was established. [Result] Apple polyphenol contained chlorogenic acid （35.207%）， catechin （3991%）， phlorizin （15.662%）， and quercetin （0.274%）. Purities of chlorogenic acid， catechin， phlorizin， and quercetin were respectively 99.298%， 99426%， 99.857%， and 99.317%. Animal experiments showed that apple polyphenol， chlorogenic acid， catechin， phlorizin， and quercetin could all effectively decrease blood TG， TC， LDL-c levels in diabetes mice， and increase HDL-c level. Compared with apple polyphenol， four active monomers （chlorogenic acid， catechin， phlorizin， quercetin） displayed stronger lowing blood fats effect. Among them， lowing blood fats effect of phlorizin was the best. [Conclusion] Apple polyphenol and its active components show good lowing-fat effect.

Key words Apple polyphenol；Phlorizin；Catechin；Chlorogenic acid

多酚為蘋果中的主要功能活性成分，蘋果多酚具有苯環(huán)并結合多個羥基化學結構，它主要包括黃酮醇、黃烷-3-醇、二氫查爾酮、羥基苯丙烯酸、花色素五大類。蘋果多酚純品為淡黃褐色粉末，略帶蘋果風味，稍有苦味，易溶于水和乙醇。蘋果多酚具有多種保健功能（例如抗腫瘤、防高血壓、抗突變、抗衰老、抗過敏、抗輻射等）[1]，因此，它可以被使用在功能性食品的開發(fā)研究上，對人們的身體保健有著重要意義。

綠原酸是一類苯丙素類化合物，近年來對綠原酸的研究較多，發(fā)現(xiàn)綠原酸具有降血脂、抗菌、抗炎、抗病毒、保肝利膽等方面的藥理作用[2]。槲皮素是一種天然黃酮類化合物，多以苷的形式存在于植物的花、葉、果實中，研究證實，槲皮素具有擴張血管、降血壓、降血脂、降低毛細血管通透性和脆性、防治冠心病等藥理活性[3-4]。兒茶素類物質(zhì)具有明顯降低高脂血癥小白鼠的血清總膽固醇（TG）、甘油三脂（TC）、低密度脂蛋白（LDL-c）和升高高密度脂蛋白（HDL-c）的作用[5-6]。根皮苷是從蘋果、蘋果樹皮及葉等中提取而得，它是蘋果樹體內(nèi)的酚類物質(zhì)。根皮苷是由根皮素和配糖體為葡糖苷結合成的苷，它的降解產(chǎn)物根皮酚能有效抑制微生物活動的作用等[7-8]。國內(nèi)外的臨床研究表明，根皮苷在治療糖尿病方面有很好的療效。蘋果多酚中含有這4種活性成分。

在該試驗中，筆者提取了蘋果多酚，并從中分離純化了4種活性單體（根皮苷、兒茶素、槲皮素和綠原酸），同時評估了它們的降血脂效果。

1 材料與方法

1.1 原料

供試蘋果為山西省太谷縣產(chǎn)的紅富士蘋果。

1.2 蘋果多酚的提取、純化及分析

1.2.1 多酚提取和提取率。

準確稱取200 g蘋果，切碎，加入70%乙醇水溶液。在40 ℃溫度下提取一定時間后抽濾。濾液轉(zhuǎn)入500 mL容量瓶，定容，精密吸取樣品液2.5 mL，置25 mL容量瓶中稀釋10倍后，按沒食子酸標準曲線制作法測定吸光度，計算多酚含量。

式中，C為測定液總酚濃度（μg/mL）；V為粗提液體積（mL）；N為稀釋倍數(shù)；W為蘋果原料重量（g）

1.2.2 蘋果多酚的純化。

試驗路線：大孔吸附樹脂預處理→多酚粗提濃縮液上柱吸附→水頂洗→乙醇溶液洗脫，收集洗脫液→真空濃縮→冷凍干燥→多酚純化物。

1.2.3 蘋果多酚的液相色譜及質(zhì)譜分析。

對獲得的純化蘋果多酚進行液相色譜及質(zhì)譜分析，通過與標樣比較分析，確定純化蘋果多酚的化學組成。

儀器型號：

Agilent 1100 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MSD-TRAP-XCT）。

1.2.3.1 液相色譜分析條件。

色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×150.0 mm，5-Micron），流動相A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈。梯度洗脫為0→7→15→30 min時，流動相B的用量依次為15%、15%、30%、50%；柱溫30 ℃；檢測器DAD（190～400 nm）；

檢測波長280 nm；流速0.8 mL/min。

1.2.3.2質(zhì)譜分析條件。

進樣方式為液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）；離子源為ESI；檢測模式負離子；掃描范圍50～800 m/z；離子源溫度300 ℃；霧化氣流速275.79 kPa；干燥氣流速10 L/min；毛細管電壓3 500 V；毛細管出口電壓109 V；掃描方式auto MS/MSn。

質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理采用LC-MS Trap軟件（5.2）版本分析質(zhì)譜結果。

1.3 蘋果多酚活性單體（根皮苷、兒茶素、槲皮素和綠原酸）的分離、純化、收集和檢測

稱取上述純化得到的蘋果多酚10 g，用20 mL 97%乙醇溶解，用有機膜（0.45 μm）過濾，接著用95%乙醇以5 mL/min的流速上柱洗脫，用自動部分收集器開始收集洗脫液，紫外分光光度計在波長280 nm處在線檢測洗脫液吸光值，并用高效液相色譜法（HPLC）對各峰的洗脫液進行檢測，合并相同峰的洗脫液。低純度餾分收集后作為層析原料再次純化。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮、凍干，得到蘋果多酚活性單體樣品。

蘋果多酚活性單體樣品使用液相質(zhì)譜法檢測純度。

液相色譜分析條件：儀器型號Agilent 1100 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MSD-TRAP-XCT）；色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×150.0 mm，5-Micron）。

1.3.1槲皮素。

流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈；梯度洗脫：在時間0→5→15 min時，流動相B的用量依次為35%、35%、70%；柱溫30 ℃；檢測器為DAD（190～400 nm）；檢測波長254 nm；流速0.8 mL/min。

1.3.2 根皮苷。

流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈；洗脫A∶B為75∶25；柱溫30 ℃；檢測器為DAD（190～400 nm）；檢測波長285 nm；流速0.8 mL/min。

1.3.3 綠原酸。

流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈；梯度洗脫：在時間0→12→20 min時，流動相B的用量依次為18%、18%、32%；柱溫30 ℃；檢測器為DAD（190～400 nm）；檢測波長327 nm；流速0.8 mL/min。

1.3.4 兒茶素。

流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為甲醇；梯度洗脫：在時間0→5→18→22 min時流動相B的用量依次為20%、20%、50%、50%；柱溫35 ℃；檢測器為DAD（190～400 nm）；檢測波長280 nm；流速0.8 mL/min。

1.3.5 質(zhì)譜分析條件。

進樣方式：LC-MS；離子源：ESI；檢測模式：負離子；掃描范圍 50～600 m/z；離子源溫度300 ℃；霧化氣流速275.79 kPa；干燥氣流速10 L/min；毛細管電壓3 500 V；毛細管出口電壓109 V；掃描方式：auto MS/MSn。所有樣品均配成約1 mg/mL，流動相溶解，過膜后，進樣10 μL。

1.4 糖尿病小鼠模型的制備與分組

將KKAy小鼠隨機分成4組，設非處理糖尿病對照組；藥物處理組（低濃度組、中濃度組、高濃度組）。另10只C57BL/6J小鼠為正常對照組。

藥物處理各組分別灌胃相應濃度的提取物（每天50 mg/kg體重、100 mg/kg體重、200 mg/kg體重），并飼喂高脂飼料；模型組每天飼喂高脂飼料并灌胃70 mg/kg體重蒸餾水，灌胃前最好為空腹。空白組每天飼喂正常飼料并灌胃70 mg/kg體重蒸餾水。連續(xù)進行70 d。試驗結束時，取血以供生化指標測試。

1.5 生化指標測定

TG、TC、LDL-c、HDL-c分別使用它們的試劑盒測定，所有操作都按照試劑盒說明進行。

1.6 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 12.0軟件進行統(tǒng)計學處理，單因素方差分析檢驗組間顯著性差異，各項指標以x±S表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

試驗得出，蘋果多酚提取率為4.79 mg/g。如圖1所示，

蘋果多酚中，綠原酸的含量是35.207%（保留時間4.089 min），兒茶素含量3.991%（保留時間6.164 min），根皮苷含量15.662%（保留時間16.921 min），槲皮素含量0274%（保留時間20.505 min）。 通過分離純化，獲得4個活性單體成分（綠原酸、兒茶素、根皮苷、槲皮素），經(jīng)過液相色譜分析，綠原酸的純度是99.298%，兒茶素純度99.426%，根皮苷純度99857%，槲皮素純度99.317%（圖2）。

2.1 藥物對糠尿病鼠血TG水平的影響

如表1所示，與正常對照組相比，模型對照組TG水平顯著升高，藥物處理組TG水平均顯著降低，且效果與劑量呈正比。各處理組相比，各劑量點根皮苷的干預效果最好，蘋果多酚的效果最弱。

2.2 藥物對糠尿病鼠血TC水平的影響

如表2所示，與正常對照組相比，模型對照組TC水平顯著升高，藥物處理組TC水平均顯著降低，且效果與劑量呈正比。各處理組相比，各劑量點根皮苷的干預效果最好，蘋果多酚的效果最弱。

2.3 藥物對糖尿病鼠血LDL-c水平的影響

如表3所示，與正常對照組相比，模型對照組LDL-c水平顯著升高，藥物處理組LDL-c水平均顯著降低，且效果與劑量呈正比。各處理組相比，各劑量點兒茶素的干預效果最好，蘋果多酚的效果最弱。

2.4 藥物對糠尿病鼠血HDL-c水平的影響

如表4所示，與正常對照組相比，模型對照組HDL-c水平顯著降低，藥物處理組HDL-c水平均顯著升高，且效果與劑量呈正比。各處理組相比，各劑量點兒茶素的干預效果最好，蘋果多酚和槲皮素的干預效果略次，且各劑量點兩者的值相近，蘋果多酚的效果最弱。

3 結論

該試驗得出，蘋果多酚中，綠原酸的含量是35.207%（保留時間4.089 min），兒茶素含量3.991%（保留時間6.164 min），根皮苷含量15.662%（保留時間16.921 min），槲皮素含量0.274%（保留時間20.505 min）。在該試驗中，糖尿病組鼠血TG、TC、LDL-c水平顯著升高，而HDL-c顯著下降，這表明高脂飼料的飼喂能夠提高小鼠的TG、TC、LDL-c含量，降低HDL-c含量。藥物（蘋果多酚、根皮苷、兒茶素、槲皮素、綠原酸）的飼喂能夠降低血TG、TC、LDL-c水平，增高血HDL-c水平。由此說明，適量的藥物（蘋果多酚、根皮苷、兒茶素、槲皮素、綠原酸）對糖尿病可能有一定的防治作用。降低高血脂是預防和治療糖尿病、心血管疾患的有效途徑之一，綜合分析數(shù)據(jù)表明，4種活性單體的降血脂效果均優(yōu)于蘋果多酚，而且根皮苷的效果最好，并呈現(xiàn)明顯的量效依賴關系。研究結果為進一步開發(fā)利用蘋果多酚及其活性單體提供了一定的依據(jù)。

參考文獻

[1] KHANIZADEH S，TSAO P，REKIKA D，et al.Polyphenol composition and total antioxidant capacity of selected apple genotypes for processing[J].Journal of food composition and analysis，2008，21（5）：396-401.

[2] WIANOWSKA D，TYPEK R，DAWIDOWICZ A L.How to eliminate the formation of chlorogenic acids artefacts during plants analysis？ Sea sand disruption method（SSDM）in the HPLC analysis of chlorogenic acids and their native derivatives in plants[J].Phytochemistry，2015，117：489-499.

[3] KEE J Y，HAN Y H，KIM D S，et al.Inhibitory effect of quercetin on colorectal lung metastasis through inducing apoptosis，and suppression of metastatic ability[J].Phytomedicine，2016，23（13）：1680-1690.

[4] SUGANTHY N，DEVI K P，NABAVI S F，et al.Bioactive effects of quercetin in the central nervous system：Focusing on the mechanisms of actions[J].Biomedicine & pharmacotherapy，2016，84：892-908.

[5] 林親錄，施兆鵬，劉湘新，等.脂質(zhì)體與膠束體兒茶素對動物血清血脂的影響[J].食品科學，2002，23（11）：129- 133.

[6] 陳裕明，朱蕙蓮，王身笏，等.茶多酚對大鼠血脂及機體脂質(zhì)過氧化作用的影響[J].中國老年學雜志，1998，18（2）：100- 102.

[7] PEI F，LI B Y，ZHANG Z，et al.Beneficial effects of phlorizin on diabetic nephropathy in diabetic db/db mice[J].Journal of diabetes and its complications，2014，28（5）：596-603.

[8] CHANG W T，HUANG W C，LIOU C J.Evaluation of the anti-inflammatory effects of phloretin and phlorizin in lipopolysaccharide-stimulated mouse macrophages[J].Food chemistry，2012，134（2）：972-979.