惡霉靈對蚯蚓的毒性效應及其蛋白含量的影響

王曉菲 薛一 劉長莉

摘要 [目的]研究惡霉靈（3-羥基-5-甲基異惡唑）對蚯蚓的毒性效應，及其對蚯蚓體內蛋白質含量的影響。[方法]采用濾紙接觸法進行不同濃度惡霧靈對蚯蚓的毒害作用試驗，并測定蚯蚓體內蛋白含量。[結果]蚯蚓在接觸農藥時有明顯反應，染毒48 h惡霉靈對蚯蚓半致死濃度（LC50）為2.455 g/L，不同濃度農藥處理結果存在顯著差異（P<0.05）。 各種濃度的惡霉靈處理24 h后，蚯蚓體內蛋白含量呈先升高后降低的趨勢，處理48 h后呈現出升高、降低、再升高的變化。并且用同一個濃度處理24 、48 h后，其體內蛋白質含量也存在顯著差異（P<0.05）。[結論]惡霉靈對蚯蚓具有毒害作用，且受到的毒害程度隨濃度和培養時間的增加而加重。蚯蚓在染毒后體內蛋白質的含量發生一定的變化。

關鍵詞 惡霉靈；蚯蚓；濾紙接觸法；毒性效應

中圖分類號 S171.5 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）34-0095-04

Abstract [Objective]The aim is to study the Hymexazol （3-hydroxy-5-methylisoxazole） toxicity effect on earthworms and its influence on the protein content of earthworms.[Method]Method of filter paper contact was used to study the toxicity effects of different concentrations of Hymexazol on earthworm ，and the protein content of earthworms was determined.[Result] Earthworms had a significant response to pesticide exposure，and the lethal concentration （LC50） of 48 hours against earthworms was 2.455 g/L.In addition，there were significant differences with different concentrations of Hymexazol treatment（P<0.05）.The total soluble protein content of earthworms increased first and then decreased after treating with various concentrations of Hymexazol for 24 hours.While they present increased，decreased and increased again after treating for 48 hours.There was also significant difference in protein content between 24 h and 48 h treated with the same concentration （P<0.05）.[Conclusion] Hymexazol has a toxic effect on earthworms，and the degree of poisoning rose with increasing concentration and incubation time.And the total soluble content of the protein in the earthworm has a certain change after exposuring.

Key words Hymexazol； Earthworms； Method of filter paper contact； Toxic effects

隨著現代農業生產的發展，農藥與化肥大量使用，帶來巨大經濟效益的同時，也嚴重污染破壞了土壤環境。蚯蚓是土壤中常見的雜食性環節動物之一，在生態環境保護中，蚯蚓能夠改善土壤成分，提高土壤肥力，分解固體廢物，調節土壤pH[1]。另外，土壤中有許多動物都是以蚯蚓為食，一旦土壤中的污染物積累在蚯蚓體內，這些污染物就會沿著食物鏈進行傳遞和富集[1-2]，從而可能對食物鏈中更高級的生物產生威脅[3]。因此，根據其生物學特性，蚯蚓常被用作為測定土壤環境污染狀況的模式生物之一[4-6]。

蛋白質是構成生物體細胞、組織的重要成分。在某些理化因素的作用下，蛋白質會發生變性，并且多數蛋白質的變性是不可逆的。研究表明，蚯蚓體內蛋白質含量的變化可以作為土壤毒理診斷指標之一[7]。惡霉靈是一種新型農藥，其藥效作用獨特，在防治病害等方面具有高效、廣譜、內吸性等特點，得到廣泛應用，但目前關于惡霉靈是否對環境有害鮮有報道。為此，選取哈爾濱市周邊地區，研究惡霉靈對當地蔬菜大棚中蚯蚓的毒性效應及其蛋白質含量的影響，為該地區農藥污染的生態毒理檢測和農業害蟲的生物學防治提供理論依據，同時也為科學的評價這種農藥的生態安全性奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試蚯蚓

蚯蚓采集于哈爾濱周邊的蔬菜大棚，選取有明顯環帶、體重為300～500 mg、大小基本相同的健康成蚓進行試驗。

1.2 藥品

惡霉靈（批號為HNP37113-D4202），由威海韓孚生化藥業有限公司生產。惡霉靈（hymexazol）又名綠亨一號、土菌消，為高效殺菌劑和土壤消毒劑，為白色可濕性粉劑。分子式為C4H5NO2；化學名稱為3-羥基-5-甲基異惡唑；結構式見圖1。

1.3 試劑

蛋白測定試劑盒，南京建成生物工程研究所生產； 考馬斯亮蘭貯備液，上海拜力生物科技有限公司生產；蛋白標準液，北京雷根生物技術有限公司生產。

1.4 器材

電冰箱（BCD-215ADL）購于海爾公司；離心機（DD-5M低速臺式離心機）購于上海珂淮儀器有限公司；分光光度器（UV-9600）、玻璃比色皿、電子天平（CPA224S）購于上海菁華科技科技儀器有限公司；移液槍（10～100、20～200 μL）購于大龍興創實驗儀器（北京）有限公司；玻璃培養皿（直徑15 cm，高2.5 cm）、中速濾紙（直徑15 cm）、量筒（10 mL）、燒杯（50、100 mL）、離心管（10 mL）購于北京華興科諾生物技術有限公司。

1.5 方法

1.5.1 污染物試驗濃度設計。

在正式試驗前進行預試驗對農藥濃度范圍進行選擇，確保所選污染物濃度染毒48 h對蚯蚓在最大致死濃度（LD100）和最小致死濃度（mLD）的范圍內。然后在選取的濃度區間設置正式濃度梯度序列進行正式試驗。惡霉靈選取濃度分別為2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6 g/L。

1.5.2 蚯蚓急性毒性試驗。進行預試驗，采用濾紙接觸法，找出濃度范圍，并在此濃度范圍內設置

2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6 g/L 7個濃度梯度，進行蚯蚓毒性試驗。

挑選出體型大小基本一致，有明顯生殖環帶的蚯蚓，用清水洗去表面泥土后放入底部有一層濾紙的1 000 mL燒杯中，并且噴灑少量的水，以保證濕潤，之后用保鮮膜將燒杯口封住，并用解剖針扎孔使燒杯內部與外界保持空氣流通，清腸24 h[8]。

在直徑15 cm的玻璃培養皿中放入3張濾紙，使濾紙剛好遮住皿底。用注射器取10 mL各濃度惡霉靈水溶液按照試驗設計濃度分別均勻注入墊有3張濾紙的培養皿中，使濾紙全部浸濕并標好序號。每一濃度設置3組重復試驗，并設置1個不含藥物的空白對照組。

取清腸24 h后的蚯蚓沖洗干凈，并用濾紙吸去表面水分。每個培養皿中放入10條蚯蚓，用保鮮薄膜封住，并用解剖針扎孔確保通氣。將培養皿置于實驗臺上，在每個培養皿下鋪一層棉花，在染毒24和48 h各計數1次，觀察并記錄中毒癥狀和死亡數目，對其頭尾部機械刺激無反應認為死亡，48 h后結束試驗[8-9]。

1.5.3 蚯蚓體內蛋白質含量的測定。

分別用24、48 h后蚯蚓的存活樣品進行蛋白測定，首先準確稱取存活樣品的質量，按質量∶體積（mL）=1∶9的比例加入9倍體積的生理鹽水，然后冰水浴條件下機械勻漿，2 500 r/min，離心10 min，取上清液用生理鹽水按1∶9稀釋成1%組織勻漿，混勻，靜置10 min，按試劑盒說明方法用蒸餾水在595 nm處、1 cm光徑調零，取3支試管，分別添加0.05 mL蒸餾水（空自管）、0.05 mL 0.563 g/L標準液（標準管）、0.05 mL樣品（測定管），均加入然后依次測定各管吸光光度值（OD值），根據測定值計算蛋白質濃度，具體計算公式如下：

1.6 數據處理

在計算機中輸入染毒24和48 h蚯蚓的死亡數目和測定的蛋白質含量，應用簡明統計10.35 （Concise Statistics，CS10.35）和Microsoft Excel進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 惡霉靈對蚯蚓毒理試驗的結果

經試驗表明，蚯蚓與惡霉靈剛接觸就表現出中毒現象：蚯蚓翻滾身體并發生卷曲身體，對接觸敏感，部分爬到濾紙下面。24 h后進行觀察，發現蚯蚓活動逐漸減弱，身體變柔軟，顏色變深，體液分泌量增加，有的抱成一團，高濃度下的蚯蚓出現個別環節腫大，個別蚯蚓出現死亡現象；48 h后觀察時，個別蚯蚓身體出現斷節，生殖環輕有滲血現象，并有黃色液體滲出（圖2），而且死亡率隨農藥濃度的增大而升高。對照組蚯蚓正常，無中毒或死亡現象。

由表1可以看出，染毒24 h后在惡霉靈濃度為2.0～2.2 g/L，其對蚯蚓不產生致死效應，濃度為2.3～2.6 g/L蚯蚓出現個別死亡；當染毒48 h，惡霉靈對蚯蚓有明顯的致死效應，且死亡率隨著農藥濃度的增大而不斷增加，當達到試驗設計的最大濃度時，蚯蚓的死亡率達到76.7%。

對表1中數據進行統計分析，以惡霉靈的濃度為橫坐標，蚯蚓染毒48 h的死亡率為縱坐標（圖3）進行擬合，得到回歸方程如下：

D=126.32X-260.07 （r2=0.931 4，n=7，P<0.05）（2）

式（2）中，D為蚯蚓死亡率（%），X為惡霉靈濃度（g/L），P為顯著性水平，r為相關系數，n為試驗處理數。根據方程計算出惡霉靈的半致死濃度（LC50）為2.455 g/L。

2.2 惡霉靈對蚯蚓蛋白質含量的影響

利用722分光光度計在595 nm下測出吸光值，根據蛋白質計算公式計算出各濃度的樣本中蛋白質的含量，如表2所示。用Microsoft Excel軟件對試驗數據進行處理，所得結果均為平均數±標準差，并用回歸方程檢驗藥品濃度與蛋白質含量的相關性。

從圖4和圖5可以看出，處理24 h后，農藥濃度為2.6 g/L時蚯蚓體內蛋白質的含量最小，為0.205 9 g/L；其中最大值為0.318 7 g/L，所對應的濃度為2.4 g/L，惡霉靈濃度由低到高對應蛋白質含量呈現出先上升后下降的趨勢；處理48 h后，濃度范圍內蛋白質含量最小值和最大值含量分別為0.191 2、0.288 3 g/L，其對應的濃度分別為2.3、2.1 g/L，蛋白質含量呈升高、降低、再升高的趨勢。

3 結論與討論

3.1 惡霉靈對蚯蚓毒性的影響

采用濾紙分析法可以讓蚯蚓與農藥直接接觸，成本低廉，操作簡便，更直觀的體現農藥對土壤動物的毒性及危害[10]。試驗結果顯示，采用濾紙接觸法試驗24、48 h時，根據回歸方程得出惡霉靈單一毒性試驗蚯蚓的半致死濃度（LC50）為2.455 g/L，且對蚯蚓的毒害隨著濃度的增加而上升。

同時蚯蚓對惡霉靈有一定的耐受限度，當農藥濃度超過其耐受限度時，就會危害蚯蚓的健康和生存。惡霉靈對蚯蚓的作用機理是接觸和內吸性多重作用，在試驗中既可以通過接觸由皮膚滲入蚯蚓體內使其對藥品進行吸收，也可以通過食入途徑進入到體內產生胃毒作用。而惡霉靈還是一種含氮雜環類殺菌劑，使蚯蚓不能正常生存生長甚至產生畸變，具體的影響還有待于進一步探索研究。

3.2 惡霉靈對蚯蚓體內蛋白質含量的影響

用不同濃度惡霉靈對蚯蚓處理24、48 h后，根據其體內蛋白質含量的測定結果，惡霉靈能使蚯蚓體內蛋白質含量增加，且不同濃度處理的結果有顯著差異（P<0.05）。而且在同一個濃度處理24、48 h后的蚯蚓的體內蛋白質含量也存在顯著差異（P<0.05）。在對蚯蚓染毒24 h時，蚯蚓體內蛋白質含量濃度呈現先升高再降低的變化，但總體蛋白質含量均比對照組有所增加，在濃度為2.4 g/L時出現最大值。對于這種現象，有研究表明，當生物體受到不利因素迫害時，機體內多種功能受損，內環境失衡，新陳代謝活動出現異常，會導致體內某些血漿蛋白含量改變，同時機體在應激狀態下會產生一些急性應急蛋白，從而使體內蛋白質含量有所升高[11-12]。隨著農藥濃度的增大以及染毒時間的延長，可能因蚯蚓機體受到傷害的加重，機體多種功能高度受損，蛋白質的合成來源遭到破壞，因而影響蛋白質的合成[13]。在染毒48 h后，蚯蚓體內蛋白質含量濃度總體出現先升高后降低再升高的變化，在2.1 g/L時出現最大值。根據此變化曲線可看出，當濃度大于2.3 g/L時，蚯蚓體內蛋白質含量又出現隨污染濃度的升高而增大的趨勢，可能是蚯蚓機體在受到高濃度和長時間的污染后，自身功能受到損傷，內環境紊亂，代謝活動失調，同時機體內產生應激蛋白，使總蛋白質含量隨濃度的升高而增大[14]。

蚯蚓機體內蛋白質含量增大或下降，均表示機體內系統功能紊亂。而生物體內蛋白質等大分子物質的變化往往是動態變化的過程，將蚯蚓作為污染暴露的生物標志物時還需要考慮多種其他因素的影響，惡霉靈對蚯蚓體內蛋白質影響比較復雜，可以進行土壤檢測，并采用其他生物標志物進行綜合分析[15]，這都需要在今后的工作中繼續研究和完善。

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