部分雞場致病性葡萄球菌的分離·鑒定·藥敏試驗

錢昌銀 胡曉苗

摘要 [目的]從合肥地區部分養雞場病雞組織中分離葡萄球菌，并對其進行鑒定和藥敏試驗。 [方法] 從合肥地區部分養雞場病雞組織中分離葡萄球菌，并通過形態特征觀察、溶血性試驗、血漿凝固酶試驗、生化試驗對其進行鑒定，最后對其進行藥敏試驗。[結果]共分離到9株葡萄球菌。經鑒定，其中4株為金黃色葡萄球菌，在臨床分離的葡萄球菌中為優勢群株；在凝固酶陰性葡萄球菌中2株為頭狀葡萄球菌，孔氏葡萄球菌、模仿葡萄球菌和沃氏葡萄球菌各1株。這說明金黃色葡萄球菌是合肥地區家禽養殖場中葡萄球菌類疾病的主要病原菌。藥敏試驗結果表明，所有分離菌株對12種臨床常用抗生素均呈不同程度的耐藥性，對青霉素、復方磺胺甲噁唑和恩諾沙星有較高的耐藥性。凝固酶陰性葡萄球菌與金黃色葡萄球菌在抗藥性方面存在差異。[結論] 在用抗生素防治葡萄球菌病時需通過藥敏試驗進行藥物篩選。該研究結果可為養雞場用藥提供參考。

關鍵詞 葡萄球菌；分離；鑒定；耐藥性；藥敏試驗

中圖分類號 S852.61 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）13-0111-03

Isolation，Identification and Drug Sensitivity of Pathogenic Staphylococcus in Some Chicken Farms

QIAN Chang-yin1，HU Xiao-miao2

（1.Hefei Animal Disease Prevention and Control Center， Hefei， Anhui 230601；2.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine， Anhui Academy of Agricultural Sciences， Hefei， Anhui 230031）

Abstract [Objective] To isolate and identify staphylococcus in some chicken farms of Hefei，and make drug sensitivity test. [Method] Staphylococcus was isolated from some chicken farms of Hefei and the isolated strains were identified by morphological observation， haemolytic test，plasma coagulase test and biochemical tests. And drug sensitivity test was made. [Result] 9 strains of staphylococcus were isolated. 4 strains of them were identified as Staphylococcus aureus， which was dominant strains. Among negative staphylococcus strains in plasma coagulase test， there were 2 strains of Staphylococcus capitis， one strain of Staphylococcus cohnii， Staphylococcus simulans， Staphylococcus warneri. These results showed that Staphylococcus aureus were main pathogen that caused Staphylococcus diseases in chicken farm of Hefei City. The drug sensitivity test results showed that all strains showed different tolerance to 12 common clinical antibiotics. All isolated strains showed higher drug tolerance to penicillin， compound sulfamethoxazole， enrofloxacin. The negative strains in plasma coagulase test and Staphylococcus aureus had difference drug tolerance. [Conclusion] Drugs should be screened out for preventing and controlling staphylococcus by drug sensitivity test. The research results can provide references for the drug administration in chicken farms.

Key words Staphylococcus；Isolation；Identification；Drug tolerance；Drug sensitivity test

葡萄球菌感染雞后能引起關節炎、皮膚（包括翼尖）壞死、急性敗血癥狀和雛雞臍炎等。該病常年發生，在高溫高濕環境中最易發病，雛雞和中雛感染葡萄球菌后死亡率最高，是養雞業中危害嚴重的疾病之一[1]。雞表皮或黏膜損傷、機體抵抗力弱和飼養管理不善時，處于金黃色葡萄球菌污染環境下，則容易感染金黃色葡萄球菌。金黃色葡萄球菌病在各類動物之間可以傳播，容易引起交叉感染[2]。Wendlandt等[3]對某農場菌群的調查發現，同一種金黃色葡萄球菌株能在人、雞、環境之間相互傳播，同時同一環境中又存在多種金黃色葡萄球菌菌株。筆者從合肥地區部分養雞場病雞組織中分離葡萄球菌，通過形態特征觀察、溶血性試驗、血漿凝固酶試驗、生化試驗等對其進行鑒定，最后通過藥敏試驗檢測其對12種常用抗生素的耐藥性。

1 材料與方法

1.1 病料來源

病料為合肥地區部分養雞場提供的病雞組織。

1.2 葡萄球菌的分離及形態特征觀察

無菌條件下取出肝臟組織，用無菌剪刀剪出1個切面，在TSB瓊脂平板上涂布，37 ℃下培養24 h，觀察并記錄菌落特點，并對分離菌株進行革蘭氏染色，在油鏡下觀察，取單克隆轉至TSB瓊脂平板進行純化，觀察菌落生長情況。

1.3 溶血性試驗

挑取細菌接種在兔血平板上，置于37 ℃恒溫箱中生長24 h，觀察菌落外周是否產生透明的溶血環。

1.4 血漿凝固酶試驗

取新鮮兔血漿和生理鹽水各1滴，分別滴于載玻片上，用移液槍分別吸取1滴菌液與兔血漿和生理鹽水混合，若混合液中有顆粒形成，而對照混合液中沒有發生自凝現象者為陽性。

1.5 生化試驗

1.5.1

微量生化管培養特性鑒定。包括糖（醇）發酵試驗、精氨酸雙水解酶試驗、七葉苷、V-P試驗、脲酶試驗。

1.5.2 明膠液化試驗。

取大量純培養的菌液穿刺接種到明膠培養基內，刺入約2/3深度，37 ℃下培養7 d，每隔24 h取出置于4 ℃下20～30 min后，觀察結果。

1.5.3 接觸酶試驗。用接種環從普通平板上挑取單個菌落于載玻片上，滴1滴3%過氧化氫溶液，在30 s內出現大量氣泡的是陽性，不產生氣泡的為陰性。

根據以上鑒定的生化特性，對分離到的葡萄球菌進行葡萄球菌菌屬鑒定[4]。

1.6 藥敏試驗

選用臨床上常用的頭孢曲松、左氧氟沙星、青霉素、紅霉素、萬古霉素、復方磺胺甲噁唑、克林霉素、利福平、新霉素、氟苯尼考、磷霉素、恩諾沙星12種抗生素的藥敏片，根據美國CISI操作手冊和《全國臨體檢驗操作規程》2006年第2版，依據Bauer和Kirby的紙片擴散法進行藥敏試驗。藥敏試驗結果的判定標準見表1。

2 結果與分析

2.1 形態特征觀察及溶血性試驗結果

經篩選，共分離到9株細菌。對分離到的9株細菌進行革蘭氏染色，然后在光學顯微鏡油鏡下觀察，可見菌體呈紫色、球形、不規則葡萄串狀排列，確定為葡萄球菌。對分離菌株進行編號，分別為1～9。9株分離株在TSB瓊脂平板和兔血平板上培養，其菌落直徑、形態、顏色、耐鹽程度、溶血性等如表2所示。

2.2 生化試驗及菌種鑒定結果

根據葡萄球菌的生化特性，采用微量試管培養法對所有分離菌株進行了鑒定，結果見表3。

經鑒定，4株分離菌株（1、3、4、5號）為金黃色葡萄球菌，2號菌株為模仿葡萄球菌，6號菌株為沃氏葡萄球菌，7號、8號菌株為頭狀葡萄球菌，9號菌株為孔氏葡萄球菌。

2.3 藥敏試驗結果

由表4可知，分離菌株的耐藥能力存在差異，對左氧氟沙星、紅霉素、克林霉素、利福平、青霉素、復方磺胺甲噁唑、恩諾沙星耐藥，對磷霉素、萬古霉素高度敏感。

3 結論與討論

3.1 家禽葡萄球菌的類型分析

筆者從安徽合肥地區部分雞場的病雞組織中共分離到9株葡萄球菌，經鑒定屬于以下5種葡萄球菌：金黃色葡萄球菌、孔氏葡萄球菌、頭狀葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、模仿葡萄球菌。除金黃色葡萄球菌其他4種均為凝固酶陰性葡萄球菌，5種都具有溶血性。金黃色葡萄球菌的檢出率最高，說明金黃色葡萄球菌是目前合肥地區家禽養殖場感染的主要病原菌。

3.2 分離的葡萄球菌具有較高的耐藥性

近年來養殖業普遍使用抗生素，逐漸增強了葡萄球菌的耐藥能力，多重耐藥菌株日益增多。邢志廣等[5]研究發現金黃色葡萄球菌對萬古霉素、利福平、氯霉素敏感，而對青霉素、復方新諾明等藥物耐藥。朱德姝等[6]研究發現金黃色葡萄球菌對磺胺甲噁唑-甲氧芐啶和磷霉素敏感，而凝固酶陰性葡萄球菌對利福平和磷霉素敏感。該研究中藥敏試驗結果表明，合肥地區養雞場流行的葡萄球菌對頭孢曲松、萬古霉素、新霉素、磷霉素較敏感，可作為合肥地區養雞場治療葡萄球菌感染疾病的參考用藥。此外，不同雞場來源的葡萄球菌菌株對臨床常用的抗生素耐藥情況差異較大，說明不同養雞場葡萄球菌感染需按所在養殖場藥敏試驗結果進行治療。

參考文獻

[1] 于福秋.雛雞腫頭型葡萄球菌病的診斷與治療[J].中國畜牧獸醫文摘，2015，31（12）：207-208.

[2] ELASHKER M，GWIDA M，TOMASO H，et al.Staphylococci in cattle and buffaloes with mastitis in Dakahlia Governorate，Egypt [J].J Dairy Sci，2015，98（11）：7450-7459.

[3] WENDLANDT S，KADLEC K，FEβLER A T，et al.Transmission of methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolates on broiler farms[J].Vet Microbiol，2013，167（3/4）：632-637.

[4] 周庭銀.臨床微生物學診斷與圖解[M].3版.上海：上海科學技術出版社，2012：101-107.

[5] 邢志廣，孫文萱，周位強，等.葡萄球菌屬的分離鑒定與耐藥性監測[J].中華醫院感染學雜志，2007，17（7）：881-884.

[6] 朱德姝，汪復，胡付品，等.2010年中國CHINET細菌耐藥性監測[J].中國感染與化療雜志，2011，11（5）：321-329.