膠東地區(qū)金銀花品種間遺傳關(guān)系的RAPD分析

王一斐 劉林德 葛宜和 孫太元

摘要 [目的]探討不同金銀花（Lonicera japonica）品種間的遺傳關(guān)系。[方法]利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)膠東地區(qū)31個(gè)金銀花品種的遺傳多樣性及遺傳關(guān)系進(jìn)行研究。[結(jié)果]5個(gè)引物共擴(kuò)增出650條帶，每個(gè)引物可擴(kuò)增出0～9個(gè)條帶。聚類分析結(jié)果表明，31個(gè)金銀花品種可以分為兩大類，采自昆崳山太白頂?shù)慕疸y花品種為一類，其余30個(gè)金銀花品種為一類。從遺傳距離來看，采自昆崳山太白頂?shù)钠贩N與中醫(yī)世家引進(jìn)金銀花品種大毛花遺傳距離最遠(yuǎn)，為2.507；采自龍口蘭高鎮(zhèn)馬藺塂（Ⅱ）與中醫(yī)世家引進(jìn)金銀花品種四季豐遺傳距離最近，為0.020。[結(jié)論]不同金銀花種源間具有較高的遺傳多樣性，不同金銀花種源間的遺傳關(guān)系與地理分布有一定的相關(guān)性。

關(guān)鍵詞 金銀花；聚類分析；遺傳多樣性；RAPD；膠東地區(qū)

中圖分類號(hào) S567.7+9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）13-0145-02

RADP Analysis of Genetic Relationships Among Cultivars of Lonicera japonica in Jiaodong Region

WANG Yi-fei1 ， LIU Lin-de1*， GE Yi-he1 et al

（1.College of Life Sciences，Ludong University，Yantai，Shandong 264100）

Abstract [Objective]Genetic relationships among cultivars of Lonicera japonica were studied.[Method]Genetic diversity and genetic relationship of 31 varieties of L. japonica in Jiaodong Region were studied by using Random Amplified Polymorphic DNA （RAPD） molecular marker technology. [Result]5 primers were used to amplify 650 bands. Each primer could amplify 0-9 bands. The result of cluster analysis showed 31 kinds of L. japonica varieties could be divided into two categories， one was from Taibai Top of Kunyu mountain， the other was anther category. From the genetic distance， the variety from Taibai Top of Kunyu mountain and the Damao flower which was introduced by family of traditional Chinese Medicine had the farthest genetic distance， it was 2.507.The variety from the Malin Port of Longkou Langao town and the Sijifeng flower which was introduced by family of traditional Chinese Medicine had the nearest genetic distance， it was 0.020. [Conclusion]There was high genetic diversity among different cultivars of L. japonica，the genetic relationship among different cultivars of L. japonica had a certain correlation with geographical distribution.

Key words Lonicera japonica；Cluster analysis；Genetic diversity；RAPD；Jiaodong region

金銀花（Lonicera japonica）為忍冬科忍冬屬多年生半常綠藤本植物[1]。全世界忍冬屬植物約200種，我國有98種[2]。金銀花具有清熱解毒、消炎退腫、保肝抗病毒、延緩衰老的功效，研究發(fā)現(xiàn)它還具有良好的抗癌、抗艾滋病的作用，屬衛(wèi)生部、國家藥品監(jiān)督管理局和國家工商局關(guān)于30個(gè)貴重藥材的通知品種，被列為出口創(chuàng)匯的主要品種[2]。同時(shí)，由于金銀花根系發(fā)達(dá)，耐旱、耐寒熱、耐瘠薄、耐鹽堿，因而又是水土保持和沙漠治理的良好樹種[3]。

我國忍冬科植物在全國各省各地形區(qū)均有分布，尤以西南地區(qū)種類最多，可供藥用的種類達(dá)47種，其中作為金銀花藥材原植物的有忍冬（Lonicera japonica Thunb.）、菰腺忍冬（Lonicera hypoglauca Miq.）、山銀花（Lonicera hypoglauca）和毛花柱忍冬（Lonicera dasystyla Rehd.），以山東平邑和河南封丘為道地產(chǎn)區(qū)[4]。隨著應(yīng)用范圍的擴(kuò)大和需求量的增加，金銀花野生資源逐漸減少，人工栽培已成為金銀花藥材的主要來源，山東、河南等省均有大面積的金銀花栽培種植基地[5]。不同種金銀花在株型、枝條、葉片形態(tài)及化學(xué)成分含量等方面均存在較大差異，種內(nèi)遺傳變異十分顯著[5]。該研究利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)膠東地區(qū)31個(gè)金銀花品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，旨在探討不同金銀花品種間的遺傳關(guān)系，為該地區(qū)金銀花品種間的關(guān)系提供分子系統(tǒng)學(xué)資料，為進(jìn)一步選育金銀花優(yōu)良品種奠定理論基礎(chǔ)[6]。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的金銀花材料為采自昆崳山、牙山、招虎山等膠東不同地區(qū)的27個(gè)品種，以及煙臺(tái)中醫(yī)世家引進(jìn)的美國金銀花、四季豐、巨豐1號(hào)、大毛花4個(gè)優(yōu)良的金銀花品種（表1）。

1.2 儀器和試劑

所用儀器有PTC-200基因擴(kuò)增儀、微型離心機(jī)、凝膠成像系統(tǒng)、電泳儀、水平電泳槽和超微量紫外分光光度計(jì)。

試驗(yàn)用Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒、瓊脂糖、引物、RNA酶、TaqDNA聚合酶、10×PCR Buffer、Mg2+、dNTPs均購自上海生工生物工程股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA的提取。

采集31個(gè)金銀花品種的幼嫩枝葉，稱取100 mg在液氮中充分研磨成粉末，利用Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒提取金銀花基因組DNA，對(duì)提取的基因組DNA用超微量分光光度計(jì)檢測其濃度及純度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 PCR反應(yīng)。

利用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系總體積為25 μL，包括10×PCR Buffer 2.5 μL，25 mmol/L的 Mg2+ 1.5 μL，2.5 mmol/L 的dNTPs 2 μL，10 ng/μL引物1 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶1 μL，20 ng/μL的DNA模板1 μL，ddH2O 16 μL。

擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性1 min，37 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增結(jié)束后將反應(yīng)產(chǎn)物于4 ℃保存。

1.3.3 電泳。

取10 μL PCR產(chǎn)物，加3 μL Loading Buffer，電泳。電泳結(jié)束后，將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)上觀察拍照。

1.4 數(shù)據(jù)分析

將電泳圖譜上清晰出現(xiàn)的條帶做出統(tǒng)計(jì)，由此生成原始矩陣。利用SPSS軟件計(jì)算任意2個(gè)品種間的遺傳距離，并利用該軟件的聚類分析方法建立不同種源間的遺傳關(guān)系樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 RAPD-PCR擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)供試的31個(gè)金銀花品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)所用5個(gè)引物的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（表1）。5個(gè)引物共擴(kuò)增出650條帶，不同引物擴(kuò)增DNA片段數(shù)0～9條不等，分子量范圍為100～3 000 bp。650條DNA擴(kuò)增帶中，585條帶具有多態(tài)性，多態(tài)條帶比率為90%，這表明供試的31個(gè)金銀花品種間RAPD條帶多態(tài)性高，遺傳多樣性豐富。

2.2 聚類分析結(jié)果

根據(jù)RAPD數(shù)據(jù)，利用SPSS軟件對(duì)31個(gè)金銀花品種間的遺傳距離和相似系數(shù)進(jìn)行計(jì)算，并進(jìn)行聚類分析，建立聚類分支樹狀圖[7]。由圖1可知，供試材料可分為兩類，樣品1（采自昆崳山太白頂）為一類，其余30個(gè)樣品為一類。而在剩余的30個(gè)金銀花品種中，樣品2（采自昆崳山林場）、3（采自乳山東夼鐘家）、4（采自文登新村）、7（采自棲霞牙山）、8（采自牟平磨石格莊）、14（采自招遠(yuǎn)上院村）、16（采自海陽東村）、18（采自海陽招虎山東）、24（采自臨朐沂山居委會(huì)）、31（大毛花）為一類，剩余的部分為另一類。

根據(jù)31個(gè)金銀花品種間的遺傳距離可以看出，品種1（采自昆崳山太白頂）與品種31（大毛花）之間遺傳距離最遠(yuǎn)，為2507；品種25[采自龍口蘭高鎮(zhèn)馬藺塂（Ⅱ）]與品種29（四季豐）遺傳距離最近為0.020，這與聚類分析結(jié)果相符。品種1（采自昆崳山太白頂）與品種31（大毛花）親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，品種25[采自龍口蘭高鎮(zhèn)馬藺塂（Ⅱ）]與品種29（四季豐）親緣關(guān)系最近。

3 討論與結(jié)論

RAPD分子標(biāo)記被廣泛應(yīng)用于作物品種或種子純度鑒定，具有簡便快速等優(yōu)點(diǎn)，但也存在條帶穩(wěn)定性差、飾演重復(fù)性低等問題[5，8]。為了保證試驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，嚴(yán)格控制反應(yīng)條件的一致性，每個(gè)引物多次重復(fù)，統(tǒng)計(jì)穩(wěn)定出現(xiàn)、重復(fù)性高的條帶并進(jìn)行遺傳分析，放棄重復(fù)性低的模糊條帶[5，9]。在此基礎(chǔ)上所獲得的數(shù)據(jù)是可靠的，試驗(yàn)結(jié)果能真實(shí)反映膠東地區(qū)31個(gè)金銀花品種的遺傳特征。

從供試材料的聚類分析結(jié)果可以看出，樣品1（采自昆崳山太白頂）聚為一類，其余30個(gè)金銀花品種聚為一類。聚類結(jié)果與形態(tài)學(xué)分類相符。此外，31個(gè)金銀花品種遺傳多樣性豐富，表現(xiàn)出了不同的遺傳特征，品種間遺傳差異較大。而遺傳多樣性反映了物種的遺傳背景、育種潛力和利用價(jià)值[10]。通過對(duì)擴(kuò)增條帶的分析，可以清楚地對(duì)供試31個(gè)金銀花品種進(jìn)行分類，說明運(yùn)用RAPD技術(shù)對(duì)金銀花進(jìn)行分子水平的鑒定是可行的[11]，可以為供試31個(gè)金銀花品種的進(jìn)一步開發(fā)利用提供詳細(xì)的分子生物學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：一部[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000：177.

[2] 中國科學(xué)院植物志編輯委員會(huì).中國植物志：第72卷[M].北京：科學(xué)出版社，1988：236-238.

[3] 李金璐，王碩，于婧，等.一種改良的植物DNA提取方法[J].植物學(xué)報(bào)，2013，48（1）：72-78.

[4] 周鳳琴，張永清，張芳，等.山東金銀花種質(zhì)資源的調(diào)查研究[J].山東中醫(yī)雜志，2006，25（4）：268-271.

[5] 楊飛，張敏，彭興揚(yáng)，等.金銀花五個(gè)品系的RAPD分析及DNA指紋圖譜的建立[J].武漢植物學(xué)研究，2007，25（3）：235-238.

[6] 向增旭，郭巧生.不同金銀花種源間遺傳關(guān)系的RAPD分析[J].植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2007，16（2）：57-59.

[7] 譚賢杰，吳子愷，程偉東，等.關(guān)聯(lián)分析及其在植物遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用[J].植物學(xué)報(bào)，2011，46（1）：108-118.

[8] LI Y，DING W L.RAPD profiling in detecting genetic diversity in partial Trollius accessions of China[J].Biochemical genetics，2010，48：34-43.

[9] SUN Z Y，GAO T，YAO H W，et al.Identification of Lonicera japonica and its related species using the DNA barcoding method[J].Planta medica，2011，77（3）：301-306.

[10] MURRAY M G，THOMPSON W F.Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J].Nucleic acids research，1980，8（19）：4321-4325.

[11] WILLIAMS J G，KUBELIK A R，LIVAK K J，et al.DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers[J].Nucleic acids research，1990，18（22）：6531-6535.