不同滅菌方法對(duì)茜草組織培養(yǎng)污染率控制的研究

陳建+常權(quán)記

摘要：利用不同滅菌方法對(duì)茜草外植體進(jìn)行處理，觀測(cè)組織培養(yǎng)污染率、愈傷組織誘導(dǎo)率。實(shí)驗(yàn)表明：10%高錳酸鉀溶液浸泡3分鐘效果最佳，污染率30%，愈傷組織誘導(dǎo)率25%；75%酒精溶液滅菌10s處理效果較差，污染率60%，愈傷組織誘導(dǎo)率為10%。

關(guān)鍵詞：茜草；滅菌；組織培養(yǎng)；污染率；誘導(dǎo)率

中圖分類(lèi)號(hào)：R282 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A DOI編號(hào)： 10.14025/j.cnki.jlny.2017.14.019

茜草（Rubiasylvatica），又名鋸鋸藤、紅茜草、掛拉豆、小血藤、過(guò)山龍等， 茜草科茜草屬，為多年生攀援草本植物。其味苦， 歸肝心經(jīng)， 有涼血止血作用，可用于治療吐血、外傷出血，經(jīng)脈阻塞、關(guān)節(jié)麻木、跌撲腫痛等，其成分具有消炎、抗腫瘤、抗氧化、清除自由基、抗輻射、鎮(zhèn)咳祛痰等功效，在醫(yī)藥上具有很高的應(yīng)用價(jià)值[1]。

自然界茜草生長(zhǎng)緩慢，野生茜草根莖自然產(chǎn)量低，茜草的藥用價(jià)值主要是在根莖，由于人們的大量采挖，導(dǎo)致野生資源趨于枯竭。野生種馴化移栽成活率低。為了保護(hù)國(guó)內(nèi)茜草品種以及產(chǎn)量資源，對(duì)野生品種進(jìn)行馴化，滿足茜草生產(chǎn)規(guī)模化栽培的需要，彌補(bǔ)國(guó)內(nèi)茜草資源不足，開(kāi)展茜草快速繁殖及組織培養(yǎng)的研究就顯得更為迫切和重要。本試驗(yàn)是探究不同滅菌方法對(duì)組織培養(yǎng)污染率控制，經(jīng)過(guò)不同滅菌方法的處理，旨在探索出最適組織培養(yǎng)的滅菌方法，使其達(dá)到快速繁殖甚至工廠化提供參考。

1材料與方法

1.1材料

茜草原材料采自陜西省安康市漢濱區(qū)長(zhǎng)嶺村火車(chē)道旁。外植體采用當(dāng)年生生長(zhǎng)健壯、污染較少的幼嫩枝條為實(shí)驗(yàn)材料，直徑為0.1～0.2厘米。

1.2培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

本實(shí)驗(yàn)使用MS+2.4-D2.0毫克/升/l+KT0.1mg/l[2]。培養(yǎng)基pH調(diào)至6.0。在26℃溫度條件下，光照1000lx，環(huán)境相對(duì)濕度70%～80%。莖段接種平放和斜插入培養(yǎng)基，葉片接種時(shí)葉片正面朝上，平放在培養(yǎng)基上[3]。

1.3實(shí)驗(yàn)處理

消毒劑選擇：

A1：0.1%次氯酸鈉15min+75%酒精10S+0.1%氯化汞8S

A2：10%高錳酸鉀溶液3min+75%酒精10S+0.1%氯化汞8S

A3：0.1%過(guò)氧化氫溶液10min+75%酒精10S+0.1%氯化汞8S

A4：75%酒精10S+0.1%氯化汞8S

在消毒劑選擇中，A1：次氯酸鈉消毒后，用無(wú)菌水清洗3次，75%酒精消毒后，無(wú)菌水清洗3次，0.1%氯化汞滅菌后用無(wú)菌水清洗5次。A2：高錳酸鉀消毒后，用無(wú)菌水清洗3次，用保鮮膜包裹，靜置8小時(shí)[4]，75%酒精消毒后，無(wú)菌水清洗3次，0.1%氯化汞滅菌后用無(wú)菌水清洗5次。A3：過(guò)氧化氫消毒后，用無(wú)菌水清洗3次，用保鮮膜包裹，75%酒精消毒后，無(wú)菌水清洗3次，0.1%氯化汞滅菌后用無(wú)菌水清洗5次。A4：75%酒精消毒后，無(wú)菌水清洗3次，0.1%氯化汞滅菌后用無(wú)菌水清洗5次。全部外植體邊使用邊切，保證外植體的生理活性。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

不同滅菌方法對(duì)污染率及愈傷組織誘導(dǎo)的影響（污染率=污染外植體/接種外植體數(shù)×100%，愈傷組織誘導(dǎo)率=發(fā)生愈傷組織數(shù)/接種外植體數(shù)×100%）。

由表1得出：使用不同滅菌方法的處理后，效果最好的是10%的高錳酸鉀溶液，污染率30%，愈傷組織誘導(dǎo)率也較高，為25%；效果最差為只使用75%酒精+0.1%氯化汞的方法，污染率為60%，愈傷組織誘導(dǎo)率10%。10%的高錳酸鉀氧化性比較小，對(duì)外植體的損害較小，雖然消毒滅菌時(shí)間比較長(zhǎng)，但是效果比較明顯，能夠顯著誘導(dǎo)愈傷組織形成；過(guò)氧化氫處理后，因?yàn)橄緶缇?，產(chǎn)生較多氧離子，對(duì)茜草損害比較大，導(dǎo)致不能產(chǎn)生較多的愈傷組織。使用氯化汞消毒滅菌時(shí)，由于其毒性大，對(duì)外植體損害大，因此使用氯化汞只滅菌8S。

3 分析討論

有學(xué)者經(jīng)過(guò)多種滅菌方法對(duì)外植體進(jìn)行滅菌，得到最佳滅菌方法，即75%酒精滅菌30S，后用10%次氯酸鈉滅菌20分鐘處理。植物組織培養(yǎng)過(guò)程中，污染是影響外植體誘導(dǎo)形成愈傷組織的主要因素。植物組織培養(yǎng)中用的外植體大多從野外直接獲取，因此通常都攜帶了自然界中的菌種，因此造成外植體誘導(dǎo)愈傷組織污染率較大。

本實(shí)驗(yàn)使用了10%高錳酸鉀溶液滅菌三分鐘，清洗后用75%酒精滅菌10S，清洗3次后使用0.1%氯化汞8S，清洗5次，進(jìn)行接種，最終得到了較適合的滅菌方法，取得了較好效果，為以后茜草組織培養(yǎng)研究提供理論上的參考。

本次試驗(yàn)中，加入7.0克/升瓊脂[5]，采用高壓蒸汽滅菌，設(shè)置滅菌溫度為121℃，滅菌時(shí)長(zhǎng)25分鐘，培養(yǎng)基在滅菌前測(cè)得pH為6.0，培養(yǎng)基凝固。滅菌后培養(yǎng)基未凝固，顏色偏黃。具體原因有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)

[1]張麗萍，楊春清，王瑞芳，等.181種藥用植物繁殖技術(shù)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2004：348.

[2]何俊平，■小云.不同培養(yǎng)基配方對(duì)鐵皮石斛生根培養(yǎng)的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（02）：57-59

[3]曾慶玲，尹書(shū)亮，魏靜.外植體不同長(zhǎng)度及接種方式對(duì)馬尾松愈傷組織誘導(dǎo)的影響[J].林業(yè)科學(xué)，2014，62（02）：175-

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[4]王雋.馬鈴薯的高錳酸鉀消毒[J].福建農(nóng)業(yè)科技，1990，4（32）：38.

[5]鞠倩.生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及蔗糖濃度對(duì)彩葉草組織培養(yǎng)物迷迭香酸含量的影響[D].山東：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

作者簡(jiǎn)介：陳建，在讀本科生，研究方向：農(nóng)學(xué)；常權(quán)記，本科學(xué)歷，副教授，研究方向：設(shè)施栽培。