番木瓜籽揮發(fā)油對(duì)變異鏈球菌的抑制作用研究

姚孟霞，張菁蕓，陳錦萍，何小穩(wěn)，易國(guó)輝

（海南醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，海南海口571199）

齲病是一種常見(jiàn)的多發(fā)性因素聯(lián)合作用的口腔疾病。多年研究證明，變異鏈球菌（Streptococcus mutans）是導(dǎo)致人類患齲的主要病原菌，它的致齲毒力主要表現(xiàn)在牙面黏附、聚集并形成牙菌斑生物被膜[1]。研究發(fā)現(xiàn)，具有生物被膜的細(xì)菌抵抗抗生素的作用力要比游離態(tài)的細(xì)菌高1 000倍以上，并且難以用普通的消毒方法將其除掉，因此控制牙菌斑生物被膜的形成是預(yù)防和控制齲病的關(guān)鍵[2]。變異鏈球菌毒力基因luxS、gtfB、gbpD、brpA和ftf在其聚集、黏附形成牙菌斑生物被膜的過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，已有研究證明抑制毒力基因的表達(dá)即可控制生物被膜的形成[3-9]。

植物揮發(fā)油又稱精油，具有抗氧化、抗病毒、抗菌等多種生物活性[10-12]。番木瓜為被廣泛食用的藥食同源食品，近年發(fā)現(xiàn)，在番木瓜籽中提取出的精油檢測(cè)到芳香烷側(cè)鏈異硫氰酸鹽，主要成分為異硫氰酸芐酯（benzyl isothiocyanate，BITC），含量高達(dá) 99.36%[6，10，13-14]。異硫氰酸芐酯是十字花科蔬菜（如辣根、芥末、甘藍(lán)、花椰菜、卷心菜和水芹菜等）中的硫代葡萄糖苷的降解產(chǎn)物，以往研究表明異硫氰酸芐酯具有極高的生物活性，例如殺菌、抗氧化、抑制血小板聚集、防癌和抑癌等作用[7-8，11，15-17]，但未發(fā)現(xiàn)其在抑制口腔細(xì)菌生長(zhǎng)方面的研究報(bào)道。本試驗(yàn)擬建立體外變異鏈球菌生物被膜模型，檢測(cè)番木瓜籽揮發(fā)油對(duì)其抑制效果，并在此基礎(chǔ)上利用實(shí)時(shí)定量PCR（real-timequantitativePCR，qPCR）技術(shù)檢測(cè)變異鏈球菌致齲毒力基因luxS、gtfB、gbpD、brpA和ftf表達(dá)水平的變化，以揭示番木瓜籽揮發(fā)油對(duì)變異鏈球菌生物被膜的抑制作用是否是通過(guò)調(diào)節(jié)某些毒力基因的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)，為臨床篩選防齲藥物開(kāi)辟一個(gè)新方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

ATCC700610變異鏈球菌UA159：上海瑞楚生物科技有限公司；番木瓜籽揮發(fā)油：海南醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供；氯已定、吐溫80：上海麥克林生化科技有限公司；甲基四氮鹽（the abated tetrazolium salt，XTT）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；腦心浸液培養(yǎng)基（brain heart infusion，BHI）：青島海博生物科技有限公司；Total RNA提取試劑盒：寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR預(yù)混液、反轉(zhuǎn)錄試劑盒：賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；引物：上海生工生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

熒光定量PCR儀（Mx3005P）：安捷倫科技（中國(guó)）有限公司；多功能酶標(biāo)儀（Synergy HTX）：美國(guó)伯騰儀器有限公司；微孔板培養(yǎng)箱（SI19）、離心機(jī)（5424R）、生物安全柜（HR60-IIIA2）、厭氧培養(yǎng)箱（YQX-II）、細(xì)菌濁度儀（WGZ-2XJ）：海南雋譽(yù)科技有限公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（QP2010plus）：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 世紀(jì)菌懸液制備

變異鏈球菌菌株凍干粉在厭氧培養(yǎng)箱中37℃常規(guī)復(fù)蘇培養(yǎng)至第二代，革蘭氏染色鏡檢確認(rèn)菌落生長(zhǎng)形態(tài)無(wú)污染后挑取單個(gè)純菌落接種于BHI培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)24 h，按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute，CCLS）標(biāo)準(zhǔn)方法，使用細(xì)菌濁度儀測(cè)定菌懸液麥?zhǔn)蠞舛龋孟♂屢簩⒕鷳乙簼舛刃Ｕ?麥?zhǔn)蠞舛龋?×108CFU/mL）備用。

1.3.2 藥液配制

番木瓜籽揮發(fā)油為海南醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提取，并經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatographymass spectrometer，GC-MS）分析其BITC含量在99%以上，純油用2%的吐溫80溶液溶解，后用無(wú)菌水配制成10 mg/mL的母液置于4℃保存；工作液用BHI液體培養(yǎng)基將揮發(fā)油母液稀釋成1 280 μg/mL；對(duì)照藥物氯已定（chlorhexidine，CHX）用BHI液體培養(yǎng)基稀釋成32 mg/mL。

1.3.3 試驗(yàn)分組

空白對(duì)照組：BHI液體培養(yǎng)基；試驗(yàn)組（番木瓜籽揮發(fā)油和CHX）：含藥液和菌液的BHI液體培養(yǎng)基；陰性對(duì)照組：含菌液的BHI液體培養(yǎng)基。

1.3.4 最低抑制生物被膜形成濃度（minimum biofilm inhibition concentration，MBIC）測(cè)定

試驗(yàn)濃度每組4個(gè)重復(fù)，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板試驗(yàn)孔中（1號(hào)～7號(hào)）加入 100 μL的 BHI培養(yǎng)液，向2號(hào)A～D孔加入100 μL番木瓜籽揮發(fā)油工作液（濃度為1 280 μg/mL）和 E～H 加入 100 μL 氯已定工作液（濃度為32 mg/mL），然后依次進(jìn)行倍比稀釋（每孔揮發(fā)油濃度為：320、160、80、40 μg/mL 和 20 μg/mL；氯已定濃度為：8、4、2、1 mg/mL 和 0.5 mg/mL），1 號(hào)孔做為空白對(duì)照組，繼續(xù)加入100 μL BHI培養(yǎng)液，其它孔各加入100 μL 1× 106CFU/mL 的 S.mutans菌液，7號(hào)孔為陰性。96孔板加蓋用薄膜密封以減少孵育過(guò)程水分的蒸發(fā)，置于CO2厭氧培養(yǎng)箱37℃孵育48 h，小心去除培養(yǎng)液，用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液洗板3次后，每孔加入現(xiàn)配的XTT液100 μL，避光培養(yǎng)2 h，然后酶標(biāo)儀A490nm讀數(shù)。抑制率/%=（陰性組A值-試驗(yàn)組A值）/（陰性組A值-空白組A值）×100。MBIC90為能夠抑制90%以上生物被膜形成的最低藥物濃度。

1.3.5 qPCR檢測(cè)變異鏈球菌毒力基因 luxS，gtfB，gbpD，brpA和ftf的表達(dá)情況

1.3.5.1 總RNA的提取

選取番木瓜籽揮發(fā)油濃度為40、80 μg/mL、氯已定濃度2 mg/mL、空白藥物作為分組，于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)48 h，小心去除培養(yǎng)液，用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液洗板3次后，用細(xì)胞鏟收集生物被膜態(tài)的S.mutans于2 mL離心管中，在各離心管中加入500 μL濃度為35 mg/mL的溶解酶并充分吹打混勻后置于37℃水浴鍋中孵育4 h，之后所有操作均在室溫中進(jìn)行。按照細(xì)菌總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)RNAisoTMPlus（Total RNA提取試劑）進(jìn)行總RNA提取。

1.3.5.2 逆轉(zhuǎn)錄

確保總RNA質(zhì)量符合后續(xù)試驗(yàn)要求后，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)逐步進(jìn)行，在冰上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄混合液配置。所使用的槍頭及PCR管均為RNA酶處理過(guò)的一次性耗材。

1.3.5.3 qPCR

NCBI Primer-BLAST設(shè)計(jì)最優(yōu)引物，見(jiàn)表1。遵照PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix試劑盒說(shuō)明書(shū)配制qPCR反應(yīng)液，反應(yīng)液配制過(guò)程需在冰上操作，應(yīng)用安捷倫Mx3005P定量?jī)x進(jìn)行qPCR反應(yīng)。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

2-△△Ct法處理熒光定量數(shù)據(jù)，SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件和Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩組間均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，p＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 番木瓜籽揮發(fā)油對(duì)變異鏈球菌生物被膜形成的影響

XTT法測(cè)得番木瓜籽揮發(fā)油和CHX對(duì)變異鏈球菌生物被膜形成的吸光度值結(jié)果如圖1、圖2所示。

隨著番木瓜籽揮發(fā)油與CHX濃度的增加，A值減小，表明對(duì)變異鏈球菌生物被膜形成的抑制增強(qiáng)，而當(dāng)藥物濃度達(dá)到一個(gè)臨界值時(shí)，A值顯著減小，其抑制率也顯著增強(qiáng)。番木瓜籽揮發(fā)油和CHX對(duì)變異鏈球菌生物被膜形成的抑制率的計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表2。通過(guò)對(duì)抑制率的計(jì)算可知陽(yáng)性對(duì)照藥物CHX對(duì)變異鏈球菌的MBIC90為2 mg/mL，其抑制率達(dá)到96.3%，與文獻(xiàn)報(bào)道相符[9，18]，番木瓜籽揮發(fā)油對(duì)變異鏈球菌的MBIC90為80 μg/mL，其抑制率達(dá)到95.4%。

圖1 XTT法測(cè)得番木瓜籽揮發(fā)油對(duì)變異鏈球菌生物被膜形成的吸光度值Fig.1 The absorbance of Carica papaya Linn.seed essential oil on Streptococcus mutans biofilm by XTT

圖2 XTT法測(cè)得CHX對(duì)變異鏈球菌生物被膜形成的吸光度值Fig.2 The absorbance of CHX on Streptococcus mutans biofilm by XTT

表2 番木瓜籽揮發(fā)油和CHX對(duì)變異鏈球菌生物被膜形成的抑制率Table 2 The inhibition rate of Carica papaya Linn.seed essential oil and CHX on Streptococcus mutans biofilm

2.2 番木瓜籽揮發(fā)油對(duì)變異鏈球菌毒力基因luxS，gtfB，gbpD，brpA和ftf表達(dá)水平的影響

總 RNA OD260/OD280的值范圍在 1.8～2.2之間，RNA 濃度在 190 ng/μL～460 ng/μL 之間，質(zhì)量穩(wěn)定，完整無(wú)降解符合后續(xù)試驗(yàn)要求。根據(jù)番木瓜籽揮發(fā)油和CHX對(duì)變異鏈球菌的MBIC結(jié)果，選取番木瓜籽揮發(fā)油40、80 μg/mL和CHX 2 mg/mL 3個(gè)藥物濃度作用變異鏈球菌，檢測(cè)其對(duì)變異鏈球菌生物被膜形成過(guò)程中毒力基因 luxS，gtfB，gbpD，brpA 和 ftf的表達(dá)水平，結(jié)果如圖3所示。

圖3 S.mutans相關(guān)毒力基因的表達(dá)水平Fig.3 Expression levels of S.mutans related virulence genes

番木瓜籽揮發(fā)油40 μg/mL和80 μg/mL和陽(yáng)性藥物CHX 2 mg/mL作用變異鏈球菌后，各毒力基因表達(dá)水平與陰性處理組相比顯著性下調(diào)（p＜0.01），在番木瓜籽揮發(fā)油40 μg/mL和80 μg/mL濃度作用下，基因luxS，gtfB，gbpD，brpA和ftf的表達(dá)水平隨濃度增加呈現(xiàn)顯著性下調(diào)（p＜0.01）。番木瓜籽揮發(fā)油80 μg/mL和陽(yáng)性藥物CHX 2 mg/mL對(duì)其毒力基因的表達(dá)水平無(wú)顯著性差異，效果相當(dāng)，與MBIC結(jié)果一致。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了番木瓜籽揮發(fā)油對(duì)變異鏈球菌生物被膜形成的影響，并進(jìn)一步對(duì)變異鏈球菌致齲相關(guān)的5種主要毒力基因luxS，gtfB，gbpD，brpA和ftf在轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平上做了相關(guān)研究。研究表明番木瓜籽揮發(fā)油對(duì)變異鏈球菌生物被膜的形成有較為顯著的抑制作用，濃度為80 μg/mL時(shí)的抑制率達(dá)95.4%。在毒力基因表達(dá)水平研究中選取番木瓜籽揮發(fā)油40、80 μg/mL和CHX 2 mg/mL3個(gè)藥物濃度作用變異鏈球菌，發(fā)現(xiàn)與不加藥物的陰性對(duì)照相比，5種毒力基因luxS，gtfB，gbpD，brpA和ftf的轉(zhuǎn)錄表達(dá)均受到了顯著抑制，當(dāng)番木瓜籽揮發(fā)油濃度80 μg/mL時(shí)，毒力基因受抑制的表達(dá)水平與陽(yáng)性藥物CHX 2 mg/mL的效果相當(dāng)。由此可推斷番木瓜籽揮發(fā)油是通過(guò)抑制相關(guān)毒力基因的表達(dá)來(lái)影響變異鏈球菌生物被膜的形成，從而達(dá)到防齲的目的。因此，番木瓜籽揮發(fā)油在作為一種新型開(kāi)發(fā)的防齲藥物研究上具有很好的應(yīng)用前景。