凋亡抑制基因survivin與稽留流產發病機制的相關性研究

陳鳳英　江歡　吳巧珠

【摘要】 目的 研究凋亡抑制基因survivin與稽留流產發病機制的相關性。方法 30例稽留流產排除胚胎染色體異常者為研究組， 正常早孕要求行人工流產患者30例為對照組。根據免疫組化結果分析survivin在稽留流產及正常早孕患者絨毛、蛻膜survivin表達情況以及兩組患者細胞滋養層細胞、合體滋養層細胞中survivin陽性表達情況。結果 survivin主要在細胞滋養層細胞、部分容貌間質細胞、蛻膜細胞等位置， 呈核/漿表達， 在子宮內膜腺體中也較為常見， 呈胞漿陽性狀態。研究組患者絨毛survivin表達為（160.28±21.34）， 蛻膜survivin表達為（167.52±16.78）， 均顯著高于對照組患者， 差異具有統計學意義（P<0.05）。在細胞滋養層細胞、合體滋養層細胞中， 研究組患者survivin陽性表達分別為（6.42±3.16）%和（4.93±3.68）%， 均低于對照組患者， 差異具有統計學意義（P<0.05）。結論 在稽留流產發病機制中， 凋亡抑制基因survivin具有較大的相關性。

【關鍵詞】 凋亡抑制基因survivin；稽留流產；發病機制；相關性研究

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.18.035

稽留流產也叫做過期流產， 指的是胎兒或胚胎死亡后， 在宮內未及時排出。近年來， 稽留流產的發病幾率整逐漸上升， 對孕產婦的身心健康、家庭穩定等， 都造成了不良的影響。目前， 對于稽留流產的具體發病機制尚未完全清除， 相關研究認為， 稽留流產的發病， 可能與凋亡抑制基因survivin存在一定的關系。基于此， 本文選擇稽留流產排除胚胎染色體異常者30例及正常早孕要求行人工流產患者30例作為研究對象， 研究了凋亡抑制基因survivin與稽留流產發病機制的相關性問題。現報告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取2015年1月～2016年12月稽留流產排除胚胎染色體異常者30例作為研究組， 停經時間6～10周， 平均時間（8.6±2.2）周， 年齡20～35歲， 平均年齡（27.9±3.3）歲，

尿人絨毛膜促性腺激素（HCG）呈陽性， B超檢查無胎心搏動， 根據婦產科學標準進行檢查， 診斷患者均為稽留流產患者。選擇同期正常早孕要求行人工流產患者30例作為對照組， 停經時間6～10周， 平均時間（8.3±1.9）周， 年齡21～37歲， 平均年齡（28.1±2.7）歲， 尿HCG呈陽性， B超顯示有胎心搏動。兩組患者一般資料比較差異無統計學意義（P>0.05）， 具有可比性。

1. 2 方法 稽留流產患者排胎后及正常早孕者行人工流產后， 分別選取絨毛組織各分成3小份， 注意避開出血、壞死及鈣化部位。1份置于4%多聚甲醛中保存固定， 待制備石蠟切片行免疫組化檢查， 其余2份用以后續實驗的mRNA及western blot檢測。采用免疫組化法觀察survivin在兩組患者絨毛滋養細胞上的表達， 首先進行石蠟包埋， 常規HE染色， 石蠟切片依次二甲苯、梯度酒精脫蠟至水， 置于檸檬酸鹽緩沖液中放于微波爐， 中火煮沸15 min， 待其自然冷卻后， 將切片取出， 以0.1 M的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗2 min×3次[1]。加3%過氧化氫， 封閉內源性過氧化物酶， 室溫10 min， 0.1 M的PBS洗

2 min×3次。滴加一抗小鼠抗人單克隆抗體（1：200）4℃， 過夜。室溫復溫40 min， 0.1 M的PBS洗2 min×3次。滴加聚合物輔助劑， 室溫20 min， 0.1 M的PBS洗2 min×3次。滴加辣根酶標記羊抗兔/小鼠免疫球蛋白（Ig）G多聚體， 室溫30 min，

0.1 M的PBS洗2 min×3次。DAB顯色， 鏡下控制顯色時間， 自來水洗滌中止顯色。蘇木素復染， 以鹽酸酒精分化。梯度酒精脫水、二甲苯透明， 封片[2]。采用實時熒光定量PCR檢測兩組患者絨毛組織內survivin mRNA的表達水平， 總RNA提取， 去基因組， RNA純度及完整性檢測， 逆轉錄， 30℃保溫10 min， 42℃保溫60 min， 72℃保溫10 min。定量PCR， 應用相對定量比較CT值法（2-ΔΔCt法）分析PCR結果[3]。采用Western blot檢測兩組患者絨毛組織內survivin蛋白的表達水平， 絨毛組織內細胞總蛋白提取及定量， SDS-PAGE膠制作， 加樣電泳并轉膜封閉， 然后進行孵育一抗及孵育二抗， 采用化學發光法（ECL）顯影， 應用Bio-Rad Quantity One軟件對蛋白條帶進行定量分析[4]。

1. 3 觀察指標 觀察survivin分布情況；根據免疫組化結果分析survivin在稽留流產及正常早孕患者絨毛、蛻膜survivin表達情況以及兩組患者細胞滋養層細胞、合體滋養層細胞中survivin陽性表達情況。

1. 4 統計學方法 采用SPSS16.0統計學軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

survivin主要在細胞滋養層細胞、部分容貌間質細胞、蛻膜細胞等位置， 呈核/漿表達， 在子宮內膜腺體中也較為常見， 呈胞漿陽性狀態。研究組患者絨毛survivin表達為（160.28±21.34）， 蛻膜survivin表達為（167.52±16.78）， 均顯著高于對照組患者， 差異具有統計學意義（P<0.05）。在細胞滋養層細胞、合體滋養層細胞中， 研究組患者survivin陽性表達分別為（6.42±3.16）%和（4.93±3.68）%， 均低于對照組患者， 差異具有統計學意義（P<0.05）。

3 討論

稽留流產是一種較為常見的疾病， 在單胎妊娠10～14周時， 發病幾率約在2%左右。相關研究表明[5]， 稽留流產的發病可能與胚胎染色體異常、母體免疫反應及內分泌疾病、感染、環境、母體精神壓力及不良生活習慣等因素相關。另外， 有研究認為凋亡抑制基因survivin與稽留流產的發病機制相關[6]。survivin是一種凋亡抑制蛋白， 作為抗凋亡基因具有廣泛的分布， 能夠對多種刺激誘發的細胞凋亡進行抑制， 在細胞正常生理活動中， 發揮著重要的作用。survivin具有較高的表達特異性， 通常只在胚胎組織、腫瘤組織中表達[7-10]。通常認為， 在過期妊娠、子癇前期、絨癌、葡萄胎等婦科疾病當中， survivin表達異常都具有一定的影響。稽留流產是一種早孕期病理妊娠， 其發病機制和母胎界面微環境穩態破壞相關。而在母胎界面滋養細胞中， survivin則具有廣泛的表達。

survivin作為一種結構特殊的凋亡抑制蛋白， 能夠發揮出調節細胞有絲分裂、抑制細胞凋亡等作用。survivin可在細胞漿中通過多種方式與Caspase-3、Caspase-7等進行結合， 對凋亡過程進行阻斷。survivin可在細胞核中與CDK4進行結合， 從CDK4復合體中將癌基因蛋白質P21釋放出來， P21可與線粒體Caspase-3相結合， 對其活性進行抑制， 并對細胞凋亡進行組織。經本文研究結果正是， 適量的survivin能夠有效抑制凋亡， 確保滋養層細胞穩定分化， 對于滋養層細胞胎盤血管重鑄有著較大幫助。

綜上所述， 在稽留流產發病機制中， 凋亡抑制基因survivin具有較大的相關性， 同時對疾病具有一定的潛在的調控機制。

參考文獻

[1] 耿堯， 牛成玲， 王鳳羽. 熒光定量PCR檢測稽留流產患者沙眼衣原體和解脲支原體結果分析. 中國優生與遺傳雜志， 2011， 1（10）：19-20.

[2] 張娟， 王蓁. 稽留流產病人survivin、bax及caspase-3的表達. 齊魯醫學雜志， 2011， 2（10）：165-166， 168.

[3] 張心紅， 丁子奇， 張艷婷. 藥物流產配合清宮術治療稽留流產358例臨床觀察. 臨床醫學， 2012， 9（20）：24-25.

[4] 謝杏美， 王玉霞. 米非司酮配伍米索前列醇治療稽留流產和終止10～16周妊娠的效果比較. 實用婦產科雜志， 2012， 8（19）：693-695.

[5] 陳帆. CRT、IAP及TSP-1在人稽留流產蛻膜組織中的表達及意義. 鄭州大學， 2013.

[6] 張娟. Survivin、bax及caspase-3在稽留流產中的表達. 青島大學， 2011.

[7] 黃樂為. 凋亡相關基因Survivin、Caspase-3和Caspase-7在非小細胞肺癌組織中的表達及意義. 中國醫科大學， 2007.

[8] 畢鐵. 凋亡抑制蛋白Survivin在卵巢透明細胞癌中的表達. 大連醫科大學， 2013.

[9] 楊斌. mTOR信號通路和survivin在人腦神經膠質瘤中的表達及臨床意義. 鄭州大學， 2013.

[10] 陳發弟. 米非司酮配伍米索前列醇治療稽留流產的療效觀察. 中國計劃生育學雜志， 2013， 11（23）：751-753.

[收稿日期：2017-03-16]