水產品中堿性玫瑰精殘留量的UPLC-MS/MS和LCMS-IT-TOF分析

黃麗英，王永超，顧 捷

（1.浙江海洋大學海洋與漁業研究所，浙江省海洋水產研究所，浙江舟山 316021；2.浙江海洋大學海洋科學與技術學院，浙江舟山 316022）

水產品中堿性玫瑰精殘留量的UPLC-MS/MS和LCMS-IT-TOF分析

黃麗英1，王永超2，顧 捷1

（1.浙江海洋大學海洋與漁業研究所，浙江省海洋水產研究所，浙江舟山 316021；2.浙江海洋大學海洋科學與技術學院，浙江舟山 316022）

建立了水產品中堿性玫瑰精測定的超高效液相色譜-串聯質譜法（UPLC-MS/MS）和離子阱飛行時間質譜法（LCMS-IT-TOF）。樣品經均質，以無水乙醇進行提取，通過Oasis HLB固相萃取小柱凈化后進行UPLC-MS/MS和LCMS-ITTOF定性定量分析。結果表明，UPLC-MS/MS法在0.5～10.0 μg/L范圍內線性相關性好，相關系數為0.999 1，回收率在70%～120%之間，相對標準偏差低于15%，檢測限為0.1 μg/kg。自制陽性樣品進行LCMS-IT-TOF定性，采用V飛行模式，根據正離子模式下獲得的多級質譜數據，對比對照品碎裂特征，總結其多級裂解規律，進一步確證該非食用物質的添加使用。

堿性玫瑰精B；UPLC/MS/MS；LCMS-IT-TOF；水產品

堿性玫瑰精（英文名Rhodamine B），又名羅丹明B、鹽基玫瑰精B、堿性熒光紅8B，俗稱"洋紅"，溶于水和乙醇呈藍光紅色，微溶于丙酮，極易溶于乙二醇乙醚，是一種偶氮類堿性工業染料，用于染蠶絲、腈綸、羊毛，也用于皮革、紙張、麥稈著色以及制備色淀顏料[1]。雖然堿性玫瑰精用途廣泛，但濫用該類工業染料仍會通過皮膚接觸、呼吸吸入、直接食入等對人體導致不良的影響。我國禁止食品及農產品中添加該工業染料，但非法使用的情況還是存在，也曾發生過一起群體性堿性玫瑰精中毒事件[2]。堿性玫瑰精已被我國衛生部列為食品中可能違法添加的非食用物質名單，但由于這些色素比食用色素更易于在肉制加工品上著色，且價格低廉，一些不法食品生產經營企業為了改善水產品的外觀亮澤，在生產加工過程中可能濫用非食用物質堿性玫瑰精，以謀求更大利益。

目前工業染料的檢測方法主要有紫外分光光度法[3]、高效液相色譜法[4]、液相色譜串聯質譜法[5-6]、飛行時間質譜法[7]等，多集中在調味料[8]和通用食品[9]上，水產品中有堿性嫩黃O的研究[10]，堿性玫瑰精的測定報道較少。液相色譜-串聯質譜技術具有選擇性、靈敏度、分析效率高等特點，本文建立了水產品中堿性玫瑰精的超高效液相色譜－串聯質譜檢測法，大幅度排除了食用色素的干擾。同時，對水產品中檢出堿性玫瑰精的自制陽性樣品應用液相色譜－離子阱飛行時間質譜技術進行了多級質譜的分析，進一步確證該非食用物質的添加使用，極大提高了水產品中堿性玫瑰精的風險監測質量安全分析能力。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

美國Waters液質聯用儀（AcquityTMUPLC/Quattro Premier XE，MsssLynx4.1工作站）；日本島津高效液相色譜離子阱飛行時間質譜儀（LCMS-IT-TOF，LCMSsolution V3.50工作站）；固相萃取柱（Oasis HLB 6 mL，500 mg或相當者）；固相萃取裝置；渦旋混合器；超聲波清洗器；離心機；旋轉蒸發儀；氮吹儀。

標準物質：堿性玫瑰精（SIGMA公司，50 g/瓶），用甲醇配制成1 mg/mL的標準儲備液。色譜純：甲醇、甲酸；分析純：無水硫酸鈉、無水乙醇、氨水；超純水。

1.2 儀器條件

1.2.1 UPLC-MS/MS法

色譜柱：Waters AcquityTMUPLC BEH Cl8柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相 A 為 0.1%甲酸甲醇溶液，B 為 0.1%甲酸水溶液，65：35（A:B）等度洗脫 5 min；柱溫：30 ℃；進樣體積：5 μL；流速：0.2 mL/min。

離子化方式：ESI正離子模式；離子源參數：毛細管電壓3.5 kV，源溫度120℃，脫溶劑氣溫度350℃，脫溶劑氣流量600 L/hr，錐孔反吹氣流量50 L/hr；離子采集方式：多反應監測模式（MRM），選擇m/z 443/399、443/355作為定性離子對，m/z 443/399作為定量離子對，采用外標法定量。

1.2.2 LCMS-IT-TOF法

色譜柱：Shimadzu Shim-pack XR-ODS C18柱（2.0 mm×75 mm,2.2 μm）；流動相 A 為 0.1%甲酸甲醇溶液，B 為 0.1%甲酸水溶液，55：45（A:B）等度洗脫 10 min；柱溫：30 ℃；進樣體積：4 μL；流速：0.3 mL/min。IT-TOF MS 離子化方式：ESI正離子掃描；掃描范圍：MS1m/z 150～1 000，MS2m/z 100～500,MS3m/z 100～500；加熱模塊溫度：200℃；曲形脫溶劑管溫度：200℃；霧化氣N2流速：1.5 L/min；干燥氣流速：10 L/min；離子源電壓：4.5 KV；檢測器電壓：1.70 KV；校準方法：自動調諧優化電壓，外標法校準質量數。

1.3 試驗方法

稱取5 g樣品（精確到0.01 g）于50 mL聚丙烯離心管中，加入5 g無水硫酸鈉，攪拌均勻，加入25 mL無水乙醇，渦旋混合1 min，超聲提取20 min，以8 000 r/min離心5 min，上清液轉移至雞心瓶中，再加入25 mL無水乙醇，重復上述操作，合并全部上清液于雞心瓶中，在45℃旋轉蒸發至近干，待凈化。樣品提取濃縮液用10 mL水少量多次溶解，上固相萃取柱（使用前分別用10 mL甲醇和10 mL水預處理，保持柱體濕潤），調節流速小等于2 mL/min，用6 mL 4%氨水甲醇溶液洗脫，40℃氮氣吹干，準確加入1 mL 70%甲醇水溶液定容，過0.22 μm濾膜，待測。

2 結果與討論

2.1 UPLC-MS-MS法的TIC和MRM圖

根據堿性玫瑰精的結構特征我們選擇ESI（+）作為電離模式，采用流動注射的方式以10 μL/min將高濃度（5.0 mg/L）的標準溶液注入離子源中對離子源毛細管電壓、錐孔電壓、源溫度、脫溶劑溫度等作優化調節，得到堿性玫瑰精的分子離子峰443。優化碰撞室的氬氣、碰撞能量等條件參數，對其子離子進行二級質譜分析，并從中選取兩個子離子組成離子對，使離子對的豐度響應最大。在液質聯用技術的應用中，流動相的選擇除考慮色譜系統分離效果外，必須關注分離各組分進入質譜前離子化的效率，以便獲得最佳的分辨率和最高的靈敏度。對堿性玫瑰精進行分離中發現，在甲醇和水中加入0.1%甲酸時，母離子峰迅速提高，經離子化后獲得高靈敏度。按照上述色質譜條件分析測試堿性玫瑰精標準物質的總離子流圖和多反應監測圖如圖1，保留時間為2.22 min。

圖1 堿性玫瑰精標準物質的TIC和MRM圖Fig.1 TIC and MRM chromatograms of reference substance of Rhodamine B

2.2 UPLC-MS/MS法的方法學考察

準確移取適量的堿性玫瑰精標準液，配制系列濃度，UPLC/MS/MS法在0.5～10.0 μg/L范圍內呈現良好線性關系，以響應面積為縱坐標，以濃度值為橫坐標，進行線性回歸，回歸方程Y=805.584 X+96.233 2，線性相關系數為0.999 1。通過實驗確定，堿性玫瑰精B在水產品中的檢出限為0.1 μg/kg，方法靈敏度高，可滿足低含量樣品殘留檢測需求。根據堿性玫瑰精的溶解性能，為了得到盡可能高的回收率，選擇萃取效率高的無水乙醇作為萃取溶劑，并采用HLB固相小柱凈化方式，操作簡便，保證了實驗條件可操作性。在空白水產品中分別添加 0.1 μg/kg、0.4 μg/kg、2.0 μg/kg 三個高中低標準品濃度，每個水平各做3次平行，以外標法計算來驗證方法的回收率。實驗證明，在不同添加水平下，不同水產品基質的加標回收結果在70%～120%之間，其相對標準偏差小于15%，說明堿性玫瑰精的回收率比較穩定，該方法具有一定的可靠性。取一標準溶液進行精密度測試，平行測定6次，UPLC/MS/MS法的RSD為1.25%，也符合方法學要求。

2.3 堿性玫瑰精多級質譜裂解規律

對堿性玫瑰精對照品進行LCMS-IT-TOF研究，在ESI正離子模式下有良好信號，采用direct模式，進行了五級質譜分析，推測的裂解規律如圖2。

圖2 堿性玫瑰精的裂解途徑Fig.2 Fragmentation pathways of Rhodamine B

從電噴霧-離子阱/飛行時間質譜聯用檢測結果分析，堿性玫瑰精的一級質譜以準分子離子峰m/z 443.2329[M+H]+為基峰，其主要碎片離子分別為 m/z 399.170 3、355.107 7、326.077 8、311.117 9、282.091 3、255.080 4。堿性玫瑰精準分子離子m/z 443.232 9失去-C3H8產生碎片m/z 399.170 3，一級碎片又失去-C3H8產生二級碎片m/z 355.107 7。三級碎片離子m/z 326.077 8和311.117 9分別由二級碎片m/z 355.107 7失去-C3N和-CO2得到。三級碎片離子m/z 326.077 8和311.117 9分別失去-CO2和-C3N都得到四級碎片m/z 282.091 3，由碎片m/z 282.091 3失去HCN得到五級碎片m/z 255.080 4。

常規液質分析可以根據化合物質荷比來排除基質干擾提高靈敏度，但是由于低分辨率和低質量數準確度的缺點，加上傳輸效率的限制也會降低被檢測物的靈敏度；四級桿飛行時間串聯質譜具備高分辨率和高質量數準確度的特點，但只能進行2級質譜分析，而離子阱飛行時間質譜不僅具有高分辨率和高質量數準確度，還具有10級質譜功能，有利于化合物復雜裂解規律的推導。與傳統的LC-MS/MS相比，LCMS-ITTOF系統可獲得高精度的多級質譜數據，提供更多的化學結構信息，提高了結構解析的準確性，從而為堿性玫瑰精的定性提供了更可靠的依據。

2.4 陽性樣品的確證

在UPLC-MS/MS試驗條件下，自制陽性樣品中檢出的堿性玫瑰精與標準物質具有相同的保留時間，且樣品圖譜中各組分定性離子的相對豐度與濃度接近的混合基質標準校準溶液中對應的定性離子的相對豐度進行比較，偏差小于5，可判定樣品中存在對應的堿性玫瑰精。

在LCMS-IT-TOF試驗條件下，通過比較自制陽性樣品與對照品的多級質譜碎裂特征，一級質譜圖因基質干擾無法判斷，但是MS2到MS4的質譜圖信息清晰，同時m/z399.170 3提取離子流圖出峰時間也與標準品相符。LCMS-IT-TOF具有多級質譜掃描功能，選定母離子碎裂出子離子，MSn質譜圖中可大大降低基質干擾，因此具有極佳的定性準確性。

3 結論

本實驗采用超高效液相色譜串聯質譜技術，建立了水產品中堿性玫瑰精的檢測方法，該方法可操作性強，定性可靠，定量準確。對自制陽性樣品本文還應用離子阱飛行時間質譜技術進行了確證，檢測結果令人滿意。新儀器、新方法、新手段的快速應用，各方法之間相互驗證，保證了檢測結果的可靠性和準確性。

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Determination of Rhodamine B in Fishery Products based on UPLC-MS/MS and LCMS-IT-TOF

HUANG Li-ying1,WANG Yong-chao2,GU Jie1
(1.Marine and Fisheries Institute of Zhejiang Ocean University,Marine Fisheries Institute of Zhejiang Province,Zhoushan 316021;2.Marine Science and Technology School of Zhejiang Ocean University,Zhoushan 316022,China)

A comprehensive analytical method based on ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS)and high performance liquid chromatography ion tap-time-of-flight mass spectrometry(LCMS-IT-TOF)has been developed for confirmation and quantification of Rhodamine B in fishery products.The Samples were homogenized and extracted by ultrasound extraction in the solution of 25 mL anhydrous alcohol,then centrifuged at the rate of 8 000 r/min.The obtained upper clear liquid after twice extractions was distilled and the residues were redissolved with 10 mL deionized water followed by a further cleanup procedure using Oasis HLB solid phase extraction column.The residues retained in the column were rinsed with the mixture of ammonium hydroxide and methanol(4:96 by volume).Then the analysis was carriedout by UPLC-MS/MS.The results showed a good linearity in the range of 0.5-10.0 μg/mL and a LOQ of 0.1 μg/kg,with the correlation coefficient of 0.999 1.The absolute recovery ranges from 70%to 120%,with the relative standard deviation less than 15%.Further studies on confirmation of self-made positive sample was carried out with LCMS-IT-TOF.The fragmentation pathways of the compound of Rhodamine B were concluded.By compared the mass spectrometry information from self-made positive sample and the reference substance,the objective compound in the complex matrix was identified successfully.The developed method is accurate,reliable for both screening and determination the Rhodamine B pollutant in fishery products.

Rhodamine B;UPLC/MS/MS;LCMS-IT-TOF;fishery products

TS254.7

：A

2016-12-10

國家自然科學基金（31502182）；浙江海洋大學“海洋科學”省重中之重開放課題（20160107）

黃麗英（1981-），女，浙江義烏人，高級工程師，研究方向：水產品加工與質量安全.E-mail:hlypcd@163.com

1008－830X(2017)01－0025－04