肝細胞肝癌組織異黏蛋白的表達變化及臨床意義

朱 凱， 戰 昊， 周 儉， 樊 嘉， 代 智*

1. 復旦大學附屬中山醫院肝臟外科，復旦大學肝癌研究所，上海 200032 2. 教育部癌變與侵襲原理重點實驗室，上海 200032

·論 著·

肝細胞肝癌組織異黏蛋白的表達變化及臨床意義

朱 凱1,2， 戰 昊1,2， 周 儉1,2， 樊 嘉1,2， 代 智1,2*

1. 復旦大學附屬中山醫院肝臟外科，復旦大學肝癌研究所，上海 200032 2. 教育部癌變與侵襲原理重點實驗室，上海 200032

目的： 觀察異黏蛋白(metadherin, MTDH)在肝細胞肝癌(HCC)組織中的表達變化，并探討其可能的臨床價值。方法： 對含323例肝細胞肝癌患者腫瘤及癌旁正常肝臟組織的組織芯片進行免疫組化染色，分析MTDH的表達情況及其與肝癌患者臨床特征之間的關系。進一步采用免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation, Co-IP)結合質譜(mass spectrometry)技術尋找異黏蛋白的功能復合體。結果： 免疫組化結果顯示MTDH在肝癌組織中表達明顯高于癌旁正常肝臟組織，在有微血管侵犯、衛星結節、低分化和TNM分期Ⅱ～Ⅲ期的患者中升高尤其明顯(P<0.01)。低MTDH表達組患者的1、3、5年生存率和無復發生存時間明顯優于高MTDH表達組(P<0.05)。免疫共沉淀技術發現MTDH能與PRMT5形成蛋白復合體。結論： MTDH有助于判斷肝癌患者術后預后，可作為潛在的預后指標。

異黏蛋白；肝細胞肝癌；腫瘤轉移；預后

肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC，以下簡稱肝癌)是最常見的肝臟惡性腫瘤，也是世界范圍內主要的健康問題之一。盡管外科切除和肝移植為治愈肝癌提供了一定的機會，但由于復發和轉移率較高，肝癌的預后仍不理想。因此，尋找能指導預后和作為治療靶點的分子標記對肝癌的治療非常重要。

異黏蛋白(metadherin, MTDH)是近期發現的一種重要的促癌蛋白，在多條信號通路中發揮作用。癌基因H-ras通過激活phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt通路能明顯促進MTDH的表達[1]，MTDH同時也能影響PI3K/Akt的磷酸化水平[2-3]。MTDH還能促進核因子κB(NF-κB)介導的腫瘤進展和轉移[4-5]。MTDH的表達增加能促進血管生成相關因子，包括血管生成素-1(angiopoietin-1)、基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloprotease-2, MMP-2)、缺氧誘導因子-1(hypoxia-inducible factor 1-α, HIF1-α)[6]和基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloprotease-9, MMP-9)[7]等的表達。但目前對于MTDH在肝癌患者預后中的價值尚未見報道。本研究旨在檢測MTDH在肝癌組織中的表達及其預后價值，并探討其在調節肝癌轉移中的可能作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 入選患者為2003年1月至2004年3月復旦大學附屬中山醫院肝外科連續收治的323例原發性肝細胞肝癌患者，均接受了肝臟腫瘤切除手術。以323例肝細胞肝癌患者腫瘤及正常肝臟組織的組織芯片作為研究對象。患者術前均無遠處轉移，肝功能均為Child-Pugh A，其中278例(86.1%)感染了乙肝病毒。診斷均經病理證實。患者具體的臨床病理特征見表1。本研究經復旦大學附屬中山醫院醫學研究倫理委員會審核通過。最后隨訪時間為2009年3月15日，中位隨訪時間為66(2.3～74.0)個月。復發后治療參照文獻[8]。

1.2 免疫組化染色測定MTDH表達 組織芯片構建及免疫組化方法參照文獻[8]，所用抗體由Abcam公司提供(ab45338)。染色強度分為高低兩組[以平均光密度(median integrated optical density, mIOD)為分界點，MTDHHigh為IOD大于mIOD，MTDHLow為IOD≤mIOD]。

1.3 免疫共沉淀與2D-LC-MS/MS技術 免疫共沉淀與2D-LC-MS/MS方法參照文獻[9]。將細胞用預冷的PBS洗滌2次，然后用含有蛋白酶抑制劑(Roche)的RIPA裂解。通過12 000×g離心除去不溶物后，將溶解的提取物與50 μL兔抗人單克隆MTDH抗體偶聯的蛋白A/G珠孵育4℃過夜。然后用裂解緩沖液洗滌珠子5次，然后在5×緩沖液中煮沸。免疫沉淀物在SDS-PAGE變性凝膠上電泳分離，通過考馬斯藍染色顯現，取感興趣的蛋白質條帶用于MS分析。在反射模式下以19 kV加速電壓進行MS，m/z范圍為400～2 000。使用SEQUEST(v.28，Bioworks 3.3軟件包，Thermo Electron)針對人國際蛋白質指數(IPI)數據庫(IPI人v3.45 FASTA，具有71 983個條目)鑒定所有MS/MS數據。

表1 患者腫瘤組織中MTDH表達與臨床病理特征的關系 n(%)

a微血管侵犯：內皮細胞襯覆的血管腔內有癌細胞巢團，當脈管腔內出現懸浮癌細胞數目≥50個時，即可計為微血管侵犯

1.4 統計學處理 采用SPSS 17.0(SPSS, Chicago, IL)進行統計分析。MTDH表達情況與其他臨床病理特征之間關系用Pearson卡方檢驗驗證。隨訪方法參見文獻[10]，總生存期(overall survival, OS)定義為肝癌切除與死亡之間間隔時間，至復發時間定義為肝癌切除與影像學證實的復發/轉移之間間隔時間。繪制總生存和復發的Kaplan-Meier生存曲線，并對其進行log-rank檢驗。采用單因素和多因素分析方法分析各因素對預后的影響。檢驗水準(α)為0.05。

2 結 果

2.1 MTDH表達與肝癌患者臨床病理特征之間的關系 免疫組化染色結果顯示：MTDH主要分布在細胞膜和細胞質中，大部分腫瘤組織表達均高于對應的正常肝臟組織(圖1A～1D)。其中劃分為MTDHHigh的占54.2%。MTDH過表達與微血管侵犯(P<0.001)，衛星結節(P=0.007)，腫瘤低分化(P=0.002)及TNM分期(P=0.001)密切相關(表1)。結果提示在有微血管侵犯、衛星結節、低分化和TNM分期Ⅱ～Ⅲ期的患者中，腫瘤組織更容易高表達MTDH。MTDH表達與其他因素如年齡、性別、肝硬化、血清AFP、腫瘤大小或有無包膜之間無明顯相關。

2.2 MTDH表達與肝癌患者臨床預后的相關性 直到2009年3月的最后隨訪，54.2%(175/323)的患者發生了復發或轉移，51.1%(165/323)死于該病。術后1、3、5年總生存率和復發率在323例患者中分別為85.4%和25.4%，62.2%和50.2%，50.7%和59.7%。結果(圖1E、1F)表明：術后1、3、5年總生存率在MTDHHigh組中明顯低于MTDHLow組(83.0%vs89.7%，52.0%vs75.3%，37.4%vs66.9%,P<0.001)；復發率則明顯高于MTDHLow組(32.4%vs16.8%，61.2%vs38.2%，70.7%vs47.8%,P<0.001)。

單因素和多因素分析結果(表2、表3)顯示：對于總生存時間和復發，MTDH表達與腫瘤大小、有無包膜、微血管侵犯及TNM分期都是肝癌預后的重要影響因素。

圖1 肝癌組織中MTDH的表達

A：正常肝臟組織中MTDH低表達；B，C：肝癌組織中MTDH高表達；D：癌(藍色箭頭)與癌旁組織(紅色箭頭)的MTDH表達情況；E，F：Kaplan-Meier生存曲線顯示，MTDH表達升高的患者，總生存率(E)更短，復發率(F)更高

表2 肝癌患者術后總生存期和疾病復發影響因素的單因素回歸分析

表3 肝癌患者術后總生存期和疾病復發影響因素的多因素回歸分析

a在單因素分析中有統計學意義的因素被納入多因素分析，分析方法為Cox回歸分析的Forward LR法

2.3 Co-IP結合質譜技術尋找MTDH的功能復合體 對過表達MTDH(MTDH組)和對照組(CTRL組)HepG2細胞提取蛋白進行Co-IP，收集能與MTDH結合的蛋白。對這些蛋白進行SDS-PAGE電泳分離后發現，當MTDH含量增加后，多種蛋白含量明顯增加(圖2A)。選取蛋白含量增加最明顯的條帶(相對分子質量72 000處)進一步研究，質譜分析顯示，相對分子質量72 000處變化最明顯的蛋白質為PRMT5，提示MTDH能與PRMT5特異性結合。為了進一步證實MTDH與PRMT5之間的關系，以IgG為對照，分別利用抗MTDH和抗PRMT5抗體進行了Co-IP驗證(圖2B)，進一步證實了MTDH能與PRMT5特異性結合。

圖2 MTDH特異性結合蛋白的篩選及驗證

A：利用抗MTDH抗體進行Co-IP，對提取出的結合蛋白的SDS-PAGE電泳分離結果，當MTDH表達增加后，相對分子質量72 000處條帶增加最明顯；B：對HepG2細胞提取蛋白進行Co-IP，以IgG為對照，分別用抗MTDH抗體和抗PRMT5抗體提取蛋白，然后利用Western印跡檢測結合蛋白. INPUT：總蛋白中的蛋白含量；Co-IP：免疫共沉淀法檢測到的結合蛋白含量

3 討 論

我們的前期研究[11]顯示，miR-302c在內皮細胞中通過抑制MTDH從而抑制細胞的內皮-間質轉化。本研究進一步探討了MTDH在肝癌中的作用。MTDH是一種單鏈跨膜蛋白，其基因定位于8q22[12]，這一區域的異常與許多腫瘤相關[13-14]。MTDH被證明在多種腫瘤中過表達，且與腫瘤的發生和轉移有密切的關系，正日益受到腫瘤學家的關注。

研究證實，MTDH在調節細胞增殖、血管生成、腫瘤耐藥以及干細胞分化中均發揮了重要的作用[15]。本研究利用包含323例肝癌患者腫瘤及正常肝組織的組織芯片評估了MTDH的表達，發現MTDH在很大比例的肝癌組織中表達升高，且與腫瘤分化和分期明顯相關。這一情況在其他腫瘤如乳腺癌[13]、惡性膠質瘤[7]中也能發現。此外，生存分析顯示MTDH過表達預示肝癌患者的總生存期縮短，復發率升高。這些結果均顯示MTDH可以作為提示肝癌侵襲性的指標以及預后的預測因子。

MTDH在惡性腫瘤中發揮作用的機制還未明確。本研究通過免疫共沉淀結合質譜技術首次發現：MTDH能特異性與PRMT5形成功能復合體。PRMT5是一種重要的精氨酸甲基轉移酶(protein arginine methyltransferase, PRMT)[16]。它通過與不同蛋白質結合形成功能復合體，參與包括DNA修復、胞核/胞質轉運、mRNA轉錄、信號轉導等多種細胞活動[17-19]。

PRMT5的異常表達與腫瘤發生發展也具有密切的關系[20-23]。如Pal等[20]發現，PRMT5能通過抑制抑癌基因tumorigenicity 7和nonmetastatic 23的表達，從而促進腫瘤細胞的生長。近來有研究顯示，PRMT5在EMT中也具有一定的作用。Hou等[24]發現，PRMT5能與EMT關鍵轉錄因子snail結合形成功能復合體，從而抑制EMT關鍵蛋白E-cadherin的表達，促進EMT的發生。結果提示MTDH能與PRMT5結合成為功能復合體，從而在肝癌復發及轉移中發揮重要作用，但其詳細機制有待進一步體內及體外實驗證實。

綜上所述，本研究表明MTDH在肝細胞肝癌中過表達提示肝癌侵襲及預后不良，可作為肝癌預后的潛在預測指標及靶向治療的有效靶點。

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[本文編輯] 廖曉瑜， 賈澤軍

Expression and clinical significance of metadherin in hepatocellular carcinoma

ZHU Kai1,2, ZHAN Hao1,2, ZHOU Jian1,2, FAN Jia1,2, DAI Zhi1,2*

1. Department of Liver Surgery, Zhongshan Hospital, Fudan University; Liver Cancer Institute, Fudan University, Shanghai 200032, China2. Key Laboratory of Cancer Carcinogenesis and Invasion of Chinese Ministry of Education, Shanghai 200032, China

Objective： To investigate the expression of metadherin (MTDH) in hepatocellular carcinoma (HCC) and its role in promoting HCC metastasis.Methods： The expression of MTDH in HCC and adjucent normal tissues was detected. Co-Immunoprecipitation (Co-IP) and mass spectrometry was used to investigate the protein complex involving MTDH. Results： The expression of MTDH was significantly higher in HCC tumors than that in corresponding normal liver tissues, and tumors with microvascular invasion, pathological satellites, poor differentiation, or TNM stage Ⅱ-Ⅲ were prone to exhibit higher MTDH expression (P<0.01). The clinical outcome was poorer in the MTDH high group than that in the MTDH low group in both the 1-, 3-, 5-year overall survival rates (OS) and the 1-, 3-, 5-year cumulative recurrence rates (P<0.05). CO-IP results showed that MTDH can form a complex with PRMT5.Conclusions： MTDH can accurately predict the poor outcome of HCC patients after surgery, and is a great independent prognostic indicator.

metadherin; hepatocellular carcinoma; neoplasm metastasis; prognosis

2017-05-09 [接受日期] 2017-06-19

國家自然科學基金(81402376，81472218)，復旦大學附屬中山醫院人才培養計劃-優秀骨干計劃(2015ZSYXGG). Supported by National Natural Science Foundation of China(81402376，81472218)and the Talent Development Program of Zhongshan Hospital, Fudan University (2015ZSYXGG).

朱 凱，博士，住院醫師. E-mail: zhukai1860@outlook.com

*通信作者(Corresponding author). Tel: 021-64041990, E-mail: dai.zhi@zs-hospital.sh.cn

10.12025/j.issn.1008-6358.2017.20170364

R 735.7

A