齊墩果酸-阿司匹林綴合物促骨形成效果研究

吉璐宏 趙庭波

齊墩果酸-阿司匹林綴合物促骨形成效果研究

吉璐宏 趙庭波

目的 探討齊墩果酸-阿司匹林綴合物對血清素合成的抑制活性以及促骨形成活性。方法 采用高效液相色譜和ELISA試劑盒測試齊墩果酸-阿司匹林綴合物對RBL-2H3細胞中血清素合成的關鍵酶色氨酸羥化酶-1(TPH-1)的抑制率及含量。構建去勢大鼠骨質疏松癥模型 (osteoporosis in ovariectomized rats,OVX)，并將骨質疏松大鼠隨機分為齊墩果酸齊墩果酸-阿司匹林綴合物組、齊墩果酸和阿司匹林物理混合組、齊墩果酸組、阿司匹林物組、空白對照組 (OVX組)組、假手術組 (sham組)和陽性藥物對照組，每組5只，給藥35 d后采用高效液相色譜測試血清和小腸中血清素水平。采用MTT法測試綴合物對成骨細胞促進活性。結果 在RBL-2H3細胞中，齊墩果酸-阿司匹林綴合物對于TPH-1的抑制呈劑量依賴性，抑制率為11.9%～87.2%，其中綴合物3在10 μmol/L濃度下展現出了最高抑制率 (87.2%)，并能較空白組 (216 ng/ml)顯著地降低TPH-1含量(65 ng/ml)，甚至略強于陽性藥物組(69 ng/ml)。與假手術組 (sham組)相比，大鼠摘除卵巢 (OVX組)后血清和小腸中血清素的水平明顯增高，而經過給綴合物后的大鼠血清和小腸中血清素的水平卻明顯降低，其中綴合物3降低血清素的活性或較齊墩果酸組和阿司匹林物組的2.3倍以上；此外，齊墩果酸-阿司匹林綴合物能夠促進乳小鼠成骨細胞增殖。結論 本研究為開發齊墩果酸類抗骨質疏松類藥物提供了新的思路。

齊墩果酸-阿司匹林綴合物；血清素；骨質疏松

骨質疏松癥(osteoporosis,OP)是一種在老年人和絕經后女性中最常見的骨科疾病，主要特征是骨量減少、骨密度降低、骨組織微結構退化，從而導致骨強度降低、骨脆性增加和易骨折[1]。與正常的組織一樣，骨組織也存在著穩定的新陳代謝，即由成骨細胞行使骨形成和破骨細胞 (osteoclast,OC)行使骨吸收來維持骨的生理結構。正常情況下，骨形成的速度和骨吸收的速度大致相等，處于動態平衡。一旦這種平衡被打破，使得骨形成的速度低于骨吸收的速度就會導致骨質疏松癥[2]。因此，目前治療骨質疏松的藥物可以分為促骨形成和抑制骨吸收兩類[3]。但當前治療骨質疏松的藥物以骨吸收抑制 (如雙膦酸鹽、雌激素等)為主[3,4]，雖然這些藥物能夠有效的防止骨骼進一步流失，但只停留在改善癥狀，卻沒有達到逆轉病情或治愈的效果。因此，開發出促進骨形成的藥物已經成為抗骨質疏松藥物研究的熱點。然而令人遺憾的是，目前促進骨細胞形成類藥物卻只有甲狀旁腺 (PTH-1)，而該藥物能夠增加患者骨肉瘤發病率的風險[5]。因此，開發出新型、高效、低毒副作用的促成骨細胞形成類藥物具有重要的意義。

從天然產物中尋找和發現先導化合物已成為開發新藥的重要途徑。齊墩果酸 (Oleanolic acid)是一種五環三萜類化合物，以游離或糖苷的形式廣泛的分布在多種植物中，并具有抗腫瘤、抗炎、降血糖等多種藥理活性[6-8]，而且副作用小、毒性低，具有較大的臨床應用價值。通過初步的研究我們發現齊墩果酸能夠抑制腸源血清素(5-羥色胺,5-HT)，而血清素進入血液循環后通過抑制骨細胞分化和增殖進而減少骨形成[9-11]，因此，齊墩果酸是一類促有進成骨細胞形成的新型抗骨質疏松藥物。近年來，老藥新用也是新藥開發的一個重點，例如阿司匹林 (Aspirin)是一個具有100多年歷史的非甾體抗炎藥，并具有較低的副作用，在這100多年里人們發現阿司匹林還能治療偏頭痛、老年癡呆癥、結腸癌等多種新用途。最近研究發現阿司匹林還能夠促進成骨細胞形成，提高骨密度的作用，具有抗骨質疏松的活性[12,13]。

基于齊墩果酸和阿司匹林展現出的促骨形成的藥理活性，根據亞結構拼接和活性疊加的原理，我們將齊墩果酸和阿司匹林進行拼接以期得到活性更強、毒性更低的新型具有促骨形成作用的齊墩果酸衍生物。本研究探討了齊墩果酸-阿司匹林綴合物 (圖 1)對血清素合成的影響以及對骨細胞形成的作用。結果表明，測試的齊墩果酸-阿司匹林綴合物對腸源血清素均有抑制作用，其中綴合物3展現出了最強的活性，并能顯著地促進成骨細胞增值。

圖1 齊墩果酸、阿司匹林以及齊墩果酸-阿司匹林綴合物的化學結構

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 齊墩果酸、阿司匹林均購自北京百靈威科技有限公司，α-MEM培養基、DMEM培養基、胎牛血清購自Hyclone公司；齊墩果酸-阿司匹林綴合物由武漢大學劉遠教授合成和結構確證；色氨酸羥化酶-1 (TPH-1) ELISA檢測試劑盒購自武漢Cusabio公司；5-羥色胺 (5-HT)標準品購自上海生物科技有限公司；甲狀旁腺激素 (PTH) 購自阿拉丁試劑有限公司；二甲基亞砜等其他試劑均為分析純；RBL-2H3細胞株購自上海細胞典藏中心。動物：SD大鼠，體重200～250 g，雌性，由武漢大學實驗動物中心提供，動物使用許可證號：SCXK (鄂) 2008-0004；動物級別：SPF級。

1.2 儀器 Agilent1200高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)；BP211D型電子天平(北京和悅達科技有限公司)；超凈工作臺(北京半導體設備一廠)；BB16/BB5060儀器CO2培養箱(上海力創科學儀器有限公司)；CKX31型倒置顯微鏡(奧林巴斯公司)；ELx800通用酶標儀 (美國BioTek公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 腸源性血清素合成抑制測試：取對數生長期的RBL-2H3細胞株懸浮于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，鋪至48孔細胞培養板，在37℃、5% CO2培養箱中孵育24 h后加入不同濃度的測試藥物，終濃度分別為2.5 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L，對照組僅加入溶劑DMSO (1 μl/ml培養液)，培養2 d后棄去培養液，用PBS洗滌，然后每孔加入100 μl RIPA強裂解液裂解細胞，再加入200 μl PBS稀釋，離心后直接用HPLC測定血清素(5-羥色胺，5-HT)的峰面積，并計算出藥物的對5-HT生物合成的抑制率。抑制率通過積分面積比可得，其計算公式為：抑制率(%)=100%-測試化合物峰面積/對照組峰面積。抑制率數值越大，表明綴合物對血清素的生物合成抑制作用就越強。

1.3.2 綴合物對RBL-2H3細胞毒性的MTT檢測：取對數生長期的RBL-2H3細胞株懸浮于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，鋪至96孔細胞培養板。待細胞完全貼壁后，棄去原培養液，加入100 μl的含有測試藥物的培養液，終濃度分別為2.5 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L，在37℃、5% CO2培養箱中繼續孵育2 d后，每孔加入30 μl 5 mg/ml MTT，繼續孵育4 h，然后每孔加入100 μl二甲亞砜(DMSO)溶解。使用酶標儀在570 nm波長處測定每孔的吸光度(OD)值。

1.3.3 綴合物對TPH-1蛋白量的影響：首先用ELISA試劑盒，繪制TPH-1蛋白量-吸光度的標準曲線，再通過測試三萜類化合物與RBL-2H3細胞相互作用后的吸光度值計算出不同濃度綴合物對應的TPH-1蛋白量，從而確定化合物對TPH-1蛋白量的影響。取對數生長期的RBL-2H3細胞株懸浮于含10%胎牛血清DMEM培養基中，鋪至24孔細胞培養板中。待細胞完全貼壁后，棄去原培養液，加入500 μl的含有測試藥物 (對照組不加藥物)的培養液培養2 d后，棄去培養液，并用PBS洗滌，然后將細胞反復的凍融，收集裂解液用ELISA試劑盒測試，使用酶標儀在450 nm波長處測定每孔的OD值。見圖2。

圖2 TPH-1含量的標準曲線

1.3.4 體內抑制血清素合成測試：將11周大的雌鼠分為給藥組(30 mg·kg-1·d-1組)、空白組、陽性藥對照組和假手術組，每組5只。在摘除卵巢造模術后第4天開始灌胃給藥，其中陽性對照組腹腔注射20 g·kg-1·d-1的PTH，連續給藥35 d后頸動脈取血。將血液在37℃下靜置45 min后得到的血清用HPLC測試其血清素的含量；小腸則在酸化后測試其血清素，并用標準曲線定量。見圖3。

圖3 5-HT含量的標準曲線

1.3.5 促進骨細胞增值：無菌條件下將20只出生 2～3 d的乳小鼠處死，取出其頭蓋并刮去軟組織，PBS清洗，剪碎后轉移到培養瓶中，用混合酶 (0.25%胰酶+0.1%的Ⅱ型膠原酶=1∶1)，37℃消化15 min棄去上清液；再用0.1% 的Ⅱ型膠原酶消化5次，合并上清液并用培養基終止消化，將上清液用200目濾網過濾，2 000 r/min離心5 min收集細胞，將收集到的細胞接種到培養瓶中培養4 d，洗去未貼壁的細胞，剩下的細胞即為成骨細胞；接著，取對數生長期的成骨細胞懸浮于含10%胎牛血清的α-MEM培養基中，鋪至96孔細胞培養板。待細胞完全貼壁后，棄去原培養液，加入不同濃度的測試藥物，終濃度分別為2.5 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L，對照組僅加入溶劑DMSO (1 μl/ml培養液)，置于37℃、5% CO2培養箱中孵育2 d后棄去培養液，每孔加入30 μl 5 mg/ml MTT，繼續孵育4 h，然后每孔加入100 μl二甲亞砜(DMSO)溶解。使用酶標儀在570 nm波長測定每孔的吸光度(OD)值。

2 結果

2.1 體外抑制血清素合成的性 與齊墩果酸、阿司匹林和齊墩果酸+阿司匹林混合組相比，綴合物抑制血清素的能力明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)，呈劑量依賴性；與陽性藥物LP533401相比，綴合物在5 μmol/L和10 μmol/L的濃度下抑制血清素的能力明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2 體外抑制血清素合成的抑制活性 與齊墩果酸、阿司匹林和齊墩果酸+阿司匹林混合組相比，目標綴合物對RBL-2H3細胞均沒有明顯的毒性,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表1 齊墩果酸-阿司匹林綴合物抑制腸源性血清素的合成作用 ±s

注：齊墩果酸+阿司匹林為摩爾比1∶1混合給藥；與OA組比較，*P<0.05；與阿司匹林組比較，#P<0.05；與OA+阿司匹林混合組比較，△P<0.05

組別Inhibition(%)2．5μmol/L5μmol/L10μmol/L空白組0．0±0．030．0±0．040．0±0．02齊墩果酸1．4±0．17?3．2±0．61?5．2±0．78?阿司匹林1．1±0．09?2．4±0．27?4．2±0．45?齊墩果酸+阿司匹林a1．3±0．15?2．8±0．22?4．6±0．69?12．5±0．41?3．1±0．84?3．9±0．82?23．0±0．62?4．2±1．25?5．4±0．93?32．8±1．07?3．5±0．44?4．2±0．51?42．1±0．72?3．9±0．99?4．9±1．36?51．7±0．34?2．9±1．73?5．1±1．65?LP5334014．8±1．81?5．5±1．57?6．2±1．28?

注：齊墩果酸+阿司匹林為摩爾比1∶1混合給藥；與空白組比較，*P<0.05

2.3 齊墩果酸-阿司匹林綴合物對TPH-1蛋白量的影響 與空白對照組相比，綴合物在10 μmol/L的濃度下能明顯地抑制TPH-1蛋白生成，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3,圖4。

組別覽TPH?1含量空白組216±12齊墩果酸177±10?阿司匹林192±15?齊墩果酸+阿司匹林a146±10?1104±9? 2127±6? 365±5# 4112±6? 573±4# LP53340169±3#

注：齊墩果酸+阿司匹林為摩爾比1∶1混合給藥；與空白組比較，*P<0.05，#P<0.01

2.4 綴合物對OVX大鼠血清和腸中血清素的影響 與假手術組(Sham)相比，OVX組血清和小腸中血清素水平均顯著地升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與卵巢切除組相比，綴合物在10 μmol/L的濃度下能明顯地降低血清和小腸中血清素水平，差異有統計學意義(P<0.05或0.01)。見表4,圖5。

2.5 綴合物促進成骨細胞增殖 與空白對照組比較，綴合物顯著地抑促進成骨細胞增殖，差異有統計學意義(P<0.05或0.01)。見表5,圖6。

圖4 齊墩果酸-阿司匹林綴合物對TPH-1蛋白量的影響。每組數據都是平均值±SD,n=3.*P<0.05,#P<0.01 vs 空白對照組

表4 齊墩果酸-阿司匹林綴合物抑制體內血清素的合成 ±s

注：齊墩果酸+阿司匹林為摩爾比1∶1混合給藥；與假手術組比較，*P<0.05；與卵巢切除組比較，#P<0.05，△P<0.01

3 討論

骨質疏松癥是由于骨吸收超過骨形成所致，因此促進成骨細胞的活性是治療骨質疏松癥的重要方法。本研究以色氨酸羥化酶-1(TPH-1)為靶點，探討了齊墩果酸-阿司匹林綴合物抑制腸源性血清素合成的活性以及成骨細胞的活性。從表1中可以看出這些齊墩果酸-阿司匹林綴合物對血清素均有抑制作用，其抑制率為11.9%～87.2%，強于先導化合物齊墩果酸和阿司匹林，并呈劑量依賴關系；與齊墩果酸和阿司匹林的物理混合組相比，這些通過化學合成的綴合物對血清素的抑制作用明顯地高于物理混合組 (抑制率< 9%)，尤其是綴合物3在10 μmol/L的濃度下對血清素的抑制作用最強，抑制率高達87.2%，分別是齊墩果酸 (抑制率7.1%)和阿司匹林 (抑制率4.5%)的12和14倍，甚至高于陽性藥物LP533401(抑制率84.6%)。但是，綴合物之間卻有較大的差異。從結構上看，綴合物1是將阿司匹林的羧基拼接在齊墩果酸的C3位羥基上，其在10 μmol/L的濃度下對血清素展現出了中等的抑制作用，而將阿司匹林的羧基拼接到齊墩果醇C17羥基 (綴合物2)后卻顯著地降低了活性 (綴合物1 vs 2)，然而將阿司匹林的羥基拼接到齊墩果酸C17位羧基 (綴合物3)上卻明顯地增加了活性 (綴合物2 vs 3)，這些說明結果齊墩果酸C17的羰基是一個藥效團，能夠增加對血清素抑制活性；同時，比較綴合物1 和3可以發現，將阿司匹林拼接在齊墩果酸C17位的活性要高于在C3位。繼續將在綴合物2的C3位羥基引入另一分子阿司匹林 (綴合物4)能夠提高活性，但仍然低于綴合物3，同樣地在綴合物3的C3位羥基繼續引入另一分子阿司匹林 (綴合物5)也沒有顯著地提高活性，這些結果說明齊墩果酸C3位羥基不是藥效團，對其修飾并不能顯著地提高活性。進一步研究發現五環三萜類化合物對血清素的抑制活性不是來源于其對RBL-2H3細胞的毒性，而是來源于其對TPH-1的抑制活性，并能夠明顯地抑制TPH-1蛋白含量，并呈劑量依賴性。在動物水平上，大鼠摘除卵巢后血清和小腸中的血清素的水平均顯著地增高(卵巢切除組vs 假手術組)，而經過綴合物給藥后的大鼠血清和小腸中的血清素水平卻明顯地降低，其抑制血清素的作用也強于齊墩果酸、阿司匹林和齊墩果酸與阿司匹林混合物，其中綴合物3抑制血清素作用甚至強于陽性藥物LP533401。這些結果說明綴合物在動物體內也能夠抑制血清素的合成。在促進成骨細胞活性實驗中，目標綴合物也能夠顯著地促進乳小鼠成骨細胞增殖，其中綴合物3展現出了最強的活性。

假手術組(sham)摘除卵巢大鼠

圖5 齊墩果酸-阿司匹林綴合物抑制體內血清素的合成；(A)和(B)分別為假手術組 (Sham)與摘除卵巢大鼠血清和小腸的血清素水平；每組數據都是平均值±SD,n=5；與Sham組比較，*P<0.05；與OVX組比較，#P<0.01;△P<0.01

表5 齊墩果酸-阿司匹林綴合物促進成骨細胞增殖效果 ±s

注：齊墩果酸+阿司匹林為摩爾比1∶1混合給藥；與空白組比較，*P<0.05

圖6 齊墩果酸-阿司匹林綴合物促進成骨細胞增殖效果；每組數據都是平均值±SD,n=3；與空白對照組比較，*P<0.05

綜上所述，齊墩果酸-阿司匹林綴合物能夠有效地抑制腸源性的血清素的合成并促進成骨細胞形成，尤其是綴合物3在體外和動物體內均展現出了對血清素合成最強的抑制活性以及促進成骨細胞增殖活性。對于齊墩果酸-阿司匹林綴合物促進成骨的具體作用機制還有待進一步研究。

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Experimental study of the effects of oleanolic acid-aspirin conjugates on bone formation

JILuhong,ZHAOTingbo.

DepartmentofOrthopaedics,TheFirstHospitalofXiantaoCity,Hubei,Xiantao433000,China

Objective To investigate the effects of oleanolic acid-aspirin conjugateson in inhibiting serotonin biosynthesis and promoting bone formation. Methods The inhibitor rate and contents of oleanolic acid-aspirin conjugates on tryptophan hydroxylase 1 (TPH-1) in RBL-2H3 cells,which was the principal enzyme in biosynthesis of serotonin,were detected by HPLC and ELISA kit. The rat models with osteoporosis were established by ovariectomy (OVX). Then the rats were randomly divided into oleanolic acid-aspirin conjugates group, oleanolic acid+aspirin group, oleanolic acid group (OA group),aspirin group,blank control group (OVX group),sham operation group (sham group) and positive drug control group,with 5 rats in each group. After 35-day medication,the levels of serotonin in serum and small intestine were detected by HPLC method,and the osteoblasts activities of promoting osteoblasts proliferation of oleanolic acid-aspirin conjugates were evaluated by using MTT assay.Results As compared with that in OA group, aspirin group and OA+aspirin group, the inhibitory ability on serotonin in oleanolic acid-aspirin conjugates group was significantly increased (P<0.05),with a dose-dependent manner. As compared with that in positive drug control group (LP533401), the inhibitory ability on serotonin in oleanolic acid-aspirin conjugates group at the concentration of 5μmol/L and 10μmol/L was significantly increased (P<0.05). As compared with OA group, aspirin group,OA+aspirin group, and oleanolic acid-aspirin conjugates group had no obvious toxicity on RBL-2H3 cells (P>0.05). As compared with OVX group,the oleanolic acid-aspirin conjugates group at the concentration of 10μmol/L could obviously inhibit the TPH-1 protein production (P<0.05). As compared with those in sham operation group, the levels of serotonin in serum and small intestine in OVX group were significantly increased (P<0.05). As compared with OVX group, the oleanolic acid-aspirin conjugates group at concentration of 10μmol/L could obviously decrease the levels of serotonin in serum and small intestine of rats (P<0.05).Moreover,as compared with OVX group, the oleanolic acid-aspirin conjugates could significantly inhibit osteoblasts formation (P<0.05). Conclusion The research results provide an new idea for development of anti-osteoporosis drugs like OA.

oleanolic acid;aspirin conjugate; serotonin; osteoporosis

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.15.004

433000 湖北省仙桃市第一人民醫院骨外二科

R 336

A

1002-7386(2017)15-2258-06

2016-11-11)