數字PCR技術在布魯菌病療效判定中的應用價值

郭瑛 韓冰 王麗 孫華麗 劉貴明 蔣榮猛

數字PCR技術在布魯菌病療效判定中的應用價值

郭瑛 韓冰 王麗 孫華麗 劉貴明 蔣榮猛

目的 探討數字PCR技術檢測血清布魯菌含量對療效判定的應用價值。方法 選擇2015年1月至2016年5月首都醫科大學附屬北京地壇醫院收治的15例布魯菌病恢復期患者，即布魯菌病急性期患者經過規范抗生素治療6周后仍有布魯菌病相關臨床癥狀的患者為研究對象，用數字PCR技術檢測血清布魯菌含量，并同時做血培養和布魯菌凝集試驗，比較三種試驗結果。結果 15例患者布魯菌病恢復期患者血清凝集試驗結果均為陽性，14例患者未在血清中檢測出布魯菌DNA，僅有1例患者血清布魯菌DNA定量檢測結果為陽性，并且血培養陽性。剩余14例患者血培養陰性。結論 數字PCR技術為發現和確診布魯菌病現癥感染病例提供了快速、快捷的方法，但仍需大樣本進行驗證。

布魯菌病；數字PCR技術

布魯菌病是一種古老的人畜共患性疾病，由布魯菌感染引起，以長期發熱、肝脾大、關節疼痛和慢性化為特征的人畜共患傳染病，曾被命名為波狀熱和地中海熱。在世界范圍內均有分布。據統計，全世界每年新增約50萬病例[1]。我國主要流行于內蒙古自治區、吉林省、黑龍江省、新疆維吾爾自治區、西藏自治區等。布魯菌病有多種傳播途徑，臨床表現多樣，病程可長達數月至數年。部分布魯菌病患者在治療過程中或治療后，仍有自覺布魯菌病癥狀，如發熱、乏力、盜汗和肌肉關節痛等。此時，早期正確鑒別診斷是治療失敗、復發還是重新感染是后續治療成功的關鍵。目前，布魯菌病實驗室診斷技術缺乏快速、簡便的方法，仍以分離培養和血清凝集試驗、補體結合試驗和酶聯免疫吸附試驗為主要檢測手段。布魯菌分離培養是實驗室診斷的金標準。臨床上主要采用血培養和骨髓培養。但是培養陽性率低，要求條件高，且存在生物安全性風險，臨床因實驗室條件限制不能常規開展。在我國，臨床常規開展的血清凝集試驗主要為虎紅平板凝集試驗(RBT)和試管凝集試驗。RBT主要檢測血清中總抗體，技術簡單，價格便宜，被廣泛作為初篩試驗使用。陽性診斷價值較低，對于沒有布魯菌暴露危險因素患者診斷價值較高，對于反復暴露和既往感染患者診斷價值有限。試管凝集試驗(SAT)常被用作布魯菌病的診斷技術，主要檢測IgG、IgM和IgA。但是各國具有診斷意義的抗體滴度標準不一致，未找到合適的抗體滴度診斷標準，且慢性期敏感性較低。補體結合試驗(Coombs)主要檢測血清中不完全和非凝集抗體，作為SAT的補充。Coombs在慢性期和復發患者中診斷價值優于血清凝集試驗，敏感性和特異性較高。但該項檢測方法操作復雜、耗時，需要一定的設備，難以在臨床常規開展。ELISA能夠檢測血清中IgM和IgG抗體。單獨檢測IgM抗體可為急性期患者提供可靠的診斷，但是，當患者體內存在高滴度的IgG抗體時，干擾對IgM抗體的檢出。不僅如此，類風濕因子也可導致假陰性結果。PCR技術自出現以來，被廣泛應用于感染性疾病的診斷。美國指南推薦PCR技術作為布魯菌病診斷初篩試驗，以IS711為引物的PCR試驗被廣泛應用于檢測血清中布魯菌含量，應用前景廣闊。但普通PCR技術檢測敏感性低，且為相對定量，結果不夠精確。布魯菌血培養技術耗時、陽性率低，且存在生物安全風險。布魯菌血清凝集試驗、補體結合試驗和酶聯免疫吸附試驗和普通PCR技術均存在一定的局限性。本文初步探討利用數字PCR技術檢測血清布魯菌DNA含量對布魯菌病恢復期的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2015年1月至2016年5月首都醫科大學附屬北京地壇醫院收治的15例布魯菌病恢復期患者，即布魯菌病急性期患者經過規范抗生素治療6周后仍有布魯菌病相關臨床癥狀的患者。

1.2 入選標準

1.2.1 符合布魯菌病急性期診斷標準：①流行病學史：發病前與家畜和畜產品、布魯菌培養物等有密切接觸史，或生活在布魯菌病流行區的居民等。②有發熱、乏力、多汗、肌肉和關節痛，或伴有肝、脾和淋巴結腫大等臨床表現。③實驗室分離出布魯菌，試管凝集試驗、補體結合試驗或布魯菌病抗人-球免疫球蛋白試驗陽性。④病史≤6個月。

1.2.2 非急性期：符合布魯菌病急性期診斷標準，并接受抗生素治療6周后，仍有布魯菌病相關臨床癥狀的患者。

1.3 數字PCR試驗方法

1.3.1 主要試劑:血液DNA提取試劑盒購自qiagen公司，QX200 ddPCR EvaGreen Supermix，微滴發生卡(DG8TM Cartridges)，微滴發生油(QX200TM Droplet Generation Oil for EvaGreen)購自伯樂公司，引物在上海生工公司合成。

1.3.2 數字PCR:引物針對IS711基因設計[2]，擴增產物長度252 bp,引物序列如下，BF:CATGCGCTATGTCTGGTTAC；BmR：AGTGTTTCGGCTCAGAATAAT。模板DNA提取按照試劑盒的說明書。布魯菌基因組DNA由中國疾控中心布病室贈予。實驗設計包括空白對照孔，陽性對照孔，陰性對照孔，樣品孔。空白對照孔模板用無菌水替代，陽性對照孔模板是布魯菌的基因組DNA，陰性對照孔模板是健康人基因組DNA，樣品孔模板是15名患者血清提取的DNA。

1.3.3 配制數字PCR反應體系:Eva Green Supermix 12 μl,模板DNA 33 ng，上下游引物2 pmol，加水至24 μl。吸取20 μl轉移至微滴發生卡的sample行(中間行)，油滴行加入70 μl微滴發生油，蓋上膠墊后，平穩放置在微滴生成儀中，開始生產微滴。將生成微滴轉移至96孔PCR板，反應條件：95℃ 變性5 min，95℃30 s，57℃ 60 s，40個循環，4℃ 5 min，90℃ 5 min，4℃保存。將反應完成的96孔板平穩放入微滴讀取儀中，打開quanta soft軟件，輸入樣品信息后，點擊run。

2 結果

2.1 一般情況 15例布魯菌病恢復期患者中，男5例，女10例;年齡21～56歲。布魯菌乳膠凝集試驗由北京地壇醫院完成，本組病例均為陽性。血培養陽性1例。

2.2 流行病學史 15例患者均來自疫區或從事畜牧業相關工作。

2.3 臨床表現 15例患者有明顯的布魯菌病自覺癥狀，主要為發熱、腰痛肌肉和關節痛、乏力等。見表1。

2.4 血清布魯菌定量檢測 有自覺癥狀的15例布魯菌病恢復期患者中，1例血清布魯菌DNA定量明顯升高，2.34拷貝/μl，且血培養陽性。其余患者均未檢測出布魯菌DNA。

表1 15例布魯菌病恢復期患者的臨床癥狀

3 討論

布魯菌病經過規范6～8周抗生素治療后，95%的患者病情有不同程度的好轉，進入恢復期。然而，少部分患者仍自覺有布魯菌病相關臨床癥狀，如發熱、乏力、盜汗、腰痛和關節痛等。此時，需要對布魯菌病恢復期患者進行正確診斷，鑒別是治療失敗、復發還是重新感染，將決定臨床醫生的治療決策。目前，診斷布魯菌病主要依靠分離培養和凝集試驗、補體結合試驗、酶聯免疫吸附試驗和普通PCR技術。

布氏桿菌分離培養是診斷的金標準。臨床上主要采用血培養和骨髓培養。據統計，急性期患者血培養敏感性為18.4%～90%，慢性期敏感性差，30%～70%[3-5]。骨髓培養比血培養靈敏度高，尤其是對已經應用抗生素患者[6]。培養陽性率主要取決于疾病分期、抗生素應用和培養方法等[7]。

布氏桿菌分離培養存在生物安全性問題。據不完全統計，在過去的25年中，實驗室布氏桿菌感染率為18%～31%[8]。目前僅應用于科研，臨床因實驗室條件限制不能常規開展。

RBT主要檢測血清中總抗體，技術簡單，價格便宜，被廣泛作為初篩試驗使用。Skendros等[9]研究顯示，在急性期，RBT敏感性接近100%，特異性87.5%，陰性預測值接近100%，而陽性預測值只有11.4%。然而，Arabaci等[10]對急性期患者研究發現，RBT敏感性48.1%，特異性96.1%,陽性預測值為1，陰性預測值低于0.5。由此可見，不同地區RBT急性期診斷價值存在差異。Al Dahouk等[11]認為，慢性期RBT敏感性差，約70%。總體而言，RBT對于沒有布氏桿菌暴露危險因素患者診斷價值較高，對于反復暴露和既往感染患者診斷價值有限[12]。

SAT常被用作布魯菌病的診斷技術，主要檢測IgG、IgM和IgA。WHO指南推薦其為初篩試驗，我國指南認定為確診試驗。但是，無論作為初篩試驗，還是確診試驗，SAT均存在一定問題：(1)具有診斷學意義的抗體滴度尚未確定。WHO指南推薦SAT≥1∶160為布魯菌病診斷標準。我國指南規定急性期診斷標準為SAT滴度≥1∶100，慢性期≥1∶50。(2)敏感性一般。據統計，SAT在急性期診斷敏感性從37.4%～90%[10,13]不等。慢性期敏感性差，為27.5%[14]。但恢復期SAT滴度較急性期升高4倍或以上，診斷價值較高[15]。

Coombs主要檢測血清中不完全和非凝集抗體，作為SAT的補充。Coombs在慢性期和復發患者中診斷價值優于血清凝集試驗，敏感性和特異性較高。不僅如此，Roushan等[6,10]研究認為，Coombs對于急性期診斷價值優于SAT、RBT和ELISA等。腦脊液Coombs對于合并腦膜炎患者診斷價值較大[14,16]。但該項檢測方法操作復雜、耗時，需要一定的設備，難以在臨床常規開展。

ELISA能夠檢測血清中IgM和IgG抗體。Roushan等[6,10]研究顯示，單獨檢測IgM抗體可為急性期患者提供可靠的診斷，敏感性和特異性與SAT和Coombs相近。但是，單一檢測血清中布氏桿菌抗體，可能會導致假陰性結果[16,17]。例如，當患者體內存在高滴度的IgG抗體時，干擾對IgM抗體的檢出。不僅如此，類風濕因子也可導致假陰性結果，試驗前應將其除去。ELISA對慢性期和復發患者的診斷價值優于SAT，與Coombs相似，但試驗方法更為簡單[15,18]。

當前，用編碼BCSP31設計的B4/B5引物常被用于人布魯菌病診斷。Casanova等[17,19]研究發現，診斷布魯菌病急性期敏感性為98.3%，特異性為100%。對慢性期和復發患者也有一定診斷價值[20]。Fadeel等[18,21]報道了一個多重PCR實驗(Bruce-ladder)用于從種水平上鑒定所有布氏桿菌，包括布氏桿菌的6個陸生種、海洋種和疫苗株S19、RB51、Revl。另有研究對比了分別以IS711、bcsp31、per設計的探針和引物的實時PCR，結果證明依據IS711設計引物和探針的PCR在鑒別布氏桿菌時表現最好的靈敏性、特異性、高效性和重復性[19,22]。Castano等[20,23]研究顯示，在布魯菌病流行地區，用以B4/B5為引物的傳統PCR作為布魯菌病初篩試驗，以IS711為引物的實時PCR作為確證試驗，不僅可用于布魯菌病診斷，還可鑒定種型，具有廣闊應用前景。

目前，我國布魯菌病實驗室診斷主要依靠RBT初篩，SAT進行確診。但是，SAT試驗作為確診試驗存在不足，表現在：(1)無論急性期還是慢性期，具有診斷價值的抗體滴度閾值尚未確定，缺乏大規模樣本驗證。(2)在疾病早期，由于抗體合成需要至少1周時間，SAT滴度可能<1∶160[3,4,23]。因此，對于急性期患者，一份SAT檢測結果滴度<1∶160，不能除外布魯菌病。臨床高度懷疑布魯菌病應在1～2周后復查。(3)SAT對于慢性期診斷特異性一般。32%的患者即使經過正規治療，隨訪1年后，SAT滴度仍≥1∶80[12]。因此，布魯菌診斷必須結合患者病史、臨床表現和實驗室檢查進行綜合判定。當前，開展新型實驗室診斷技術迫在眉睫。

PCR技術作為病原學檢測技術已經開始廣泛應用于臨床。第一代PCR技術通常采用電泳的方法對PCR產物進行分析，存在操作繁瑣，容易出現交叉污染，只適用于定性研究等局限。為了克服傳統PCR的不足，并滿足生物學研究中對核酸定量分析的要求，1992年誕生了第二代PCR，即熒光定量PCR。熒光定量PCR在PCR擴增的同時對反應體系中引入的熒光信號進行實時檢測分析，通過三個參數(熒光信號、-Cq值、DNA模板起始濃度)間的關系，確定靶標基因相對于外部參照(標準曲線或對照樣本)的含量或表達水平。由于熒光定量PCR的結果曲線依賴-Cq值、PCR擴增效率和參照系，2009年由科學家們協商制訂的定量PCR實驗指南明確了定量PCR試驗流程標準化和質量控制的必要性；更具意義的是指南還給出了規范定量PCR流程和質控環節的check-list，其核心目標旨在規范各實驗室的數字PCR技術流程，統一試驗技術思路、保證熒光定量PCR試驗信息的透明度，以確保定量PCR試驗結果的重復性、可靠性。然而對于-Cq值、PCR擴增效率和參照系的依賴仍是定量PCR技術的最大技術瓶頸，在這個意義上的定量也只能是相對的、間接的。而且在靶核酸分子風度低、樣本間模板濃度差異細微的情況下，定量PCR的檢測靈敏度和精確度都受到了限制，已不能滿足臨床實驗室診斷的要求。

在這樣的背景下，第三代PCR技術應運而生。QX200微滴式數字PCR系統屬于第三代PCR技術。QX200微滴發生器可將含有核酸分子的熒光PCR反應體系分割成數萬個納升級的微滴，核酸分子在各微滴中隨機分級，每個微滴或不含特檢核酸靶分子，或者至少一個待檢核酸靶分子，且每個微滴都是一個獨立的PCR反應器。經PCR擴增后，QX200微滴分析儀逐個對每個微滴進行檢測，有熒光信號的微滴判讀為“1”，沒有熒光信號的微滴判讀為“0”，從而將熒光模擬信號數字化，因此該技術被稱為數字PCR。最終根據泊松分布原理及陽光微滴的比例，分析軟件可直接給出待檢靶分子的拷貝數濃度，上述過程中熒光信號產生原理與定量PCR相同，可以采用具有序列特異性TapMan探針，也可以采用成本更低的新型核酸嵌入式染料-EvaGreen，因此，定量PCR與數字PCR的銜接是無縫的。

全新的數字化終點檢測方式和分子技術的定量手段，賦予QX200微滴式數字PCR系統卓越的性能，即無需標準曲線和參照，對影響PCR效率的抑制物不敏感，大大提高了檢測靈敏度、精確度、準確度和重復性，并實現了真正意義上的絕對定量。數字PCR技術較普通PCR技術而言，敏感性更高，且能夠定量，是今后早期快速檢測布魯菌的發展方向。

本研究初步探討分析15例布魯菌恢復期病例的臨床資料和數字PCR檢測血清布魯菌DNA定量檢測結果。本研究結果顯示，15例患者布魯菌血清凝集試驗結果均為陽性，說明凝集試驗抗體可能為既往感染后產生的IgG抗體，并不能區分現癥感染和既往感染。14例患者未在血清中檢測出布魯菌DNA，僅有1例患者血清布魯菌DNA定量檢測結果為陽性，說明部分布魯菌病恢復期患者血清中布魯菌含量很低或不存在。因此，對于規范治療進入恢復期仍然有自覺癥狀的患者，可以利用數字PCR技術檢測血清布魯菌DNA的含量，為布魯菌病的后續治療提供依據。同時，數字PCR檢測血清布魯菌DNA陽性患者，血培養也是陽性，表明數字PCR可以取代血培養作為恢復期是否還有布魯菌存在的一種方法，但只是初步探討，尚需要擴大樣本量驗證。對于血清布魯菌數字PCR檢測陽性的患者，考慮存在現癥布魯菌感染，臨床應繼續給予抗布魯菌治療。

臨床資料顯示，血清布魯菌DNA檢測陽性病例較陰性病例有明顯的高熱癥狀(體溫39.5℃)，且布魯菌血培養陽性，提示存在菌血癥。14例血清布魯菌DNA定量檢測陰性患者有不同程度發熱，但無高熱，體溫37.3～38℃，血培養陰性，提示可能不存在布魯菌菌血癥。14例患者都存在不同程度的腰痛、關節痛和睪丸腫痛等自覺布魯菌病臨床癥狀，分析靶器官損傷可能不是布魯菌直接損傷所致，而是由遲發型免疫反應所致，與文獻報道[9,10]相符。對于布魯菌數字PCR檢測陰性，但仍有自覺癥狀的患者，是否需要繼續治療，需綜合患者臨床表現，紅細胞沉降率、C-反應蛋白、血清凝集試驗結果綜合考慮，評估是否需要繼續治療。

1 Al Dahouk S,Nockler K.Implication of laboratory diagnosis on brucellosis therapy.Expert Rev Anti Infect Ther,2011,9:833-845.

2 Kamal IH1,Al Gashgari B,Moselhy SS,et al.Two-stage PCR assay for detection of human brucellosis in endemic areas.BMC Infect Dis,2013,21:145.

3 Franco MP,Mulder M,Gilman RH,et al.Human brucellosis.Lancet Infect.Dis,2007,7：775-786.

4 Zai X,Yang Q,Liu K,et al.A comprehensive proteogenomic study of the human Brucellar vaccine strain 104M.BMC Genomics,2016,17:402.

5 Gomez MC,Nieto JA,Rosa C,et al.Evaluation of seven tests for diagnosis of human brucellosis in an area where the disease is endemic.Clin Vacc Immunol,2008,15:1031-1033.

6 Roushan MK,Amiri MJ,Larly A,et al.Follow-up standard agglutination and 2-mercaptoethanol tests in 175 clinical cured cases of human brucellosis.International Journal of Infectious Diseases,2010,14:e250-e253.

7 Mantur B,Parande A,Amarnath S,et al.ELISA versus conventional methods of diagnosing endemic brucellosis.Am J Trop Med Hyg,2010,83:314-318.

8 Ko J,Splitter GA.Molecular host-pathogen interaction in brucellosis: current understanding and future approaches to vaccine development for mice and humans.Clin Microbiol Rev,2003,16:65.

9 Skendros P,Pappas G,Boura P.Cell-mediated immunity in human brucellosis.Microbes Infect,2011，13:134.

10 Arabaci F,Oldacay M.Evaluation of serological diagnostic tests for human Brucellosis in an endemic area.Journal of Microbiology and Infectious Diseases,2012，2:50-56.

11 Al Dahouk S,Tomaso H,Nockler K,et al.Laboratory-based diagnosis of brucellosis-a review of the literature.Part Ⅰ: techniques for direct detection and identification of Brucella spp.Clin Lab,2003,49:487-505.

12 Andriopoulos P,Kaloqerakou A,Rebelou D,et al.Prevalence of Brucella antibodies on a previously acute brucellosis infected population: sensitivity,specificity and predictive values of Rose Bengal and Wright standard tube agglutination tests.Infection,2015,43:325-330.

13 Gomez MC,Nieto JA,Rosa C,et al.Evaluation of seven tests for diagnosis of human brucellosis in an area where the disease is endemic.Clin Vacc Immunol,2008,15:1031-1033.

14 Mantur B,Parande A,Amarnath S,et al.ELISA versus conventional methods of diagnosing endemic brucellosis.Am J Trop Med Hyg,2010,83:314-318.

15 Espinosa BJ,Chacaltana J,Mulder M,et al.Comparison of culture techniques at different stages of brucellosis.Am J Trop Med.Hyg,2009,80:625-627.

16 Karsen H,Tekin Koruk S,Duygu F,et al.Review of 17 Cases of Neurobrucellosis: Clinical Manifestations,Diagnosis,and Management.Arch Iran Med,2012,15:491-494.

17 Casanova A,Ariza J,Rubio M,et al.Brucellacapt versus classical tests inthe serological diagnosis and management of human brucellosis.Clin.Vaccine Immunol,2009,16:844-851.

18 Fadeel MA,Hoffmaster AR,Shi J,et al.Comparison of four commercial IgM and IgG ELISA kits for diagnosing brucellosis.J Med Microbiol,2011,60:1767-1773.

19 Queipo-Ortuno MI,Morata P,Ocon P,et al.Rapid diagnosis of human brucellosis by peripheral-blood PCR assay.J Clin Microbiol,1997,35:2927-2930.

20 Castano MJ，Solera J.Chronic brucellosis and persistence of Brucella melitensis DNA.J Clin Microbiol,2009,47:2084-2089.

21 Lopez-Goni I,Garcia-Yoldi D,Marin CM,et al.Evaluation of a multiplex PCR assay (Bruce-ladder) for molecular typing of all Brucella species,including the vaccine strains.J Clin Microbiol,2008,46:3484-3487.

22 Bounaadja L,Albert D,Chenais B,et al.Real-time PCR for identification of Brucella spp: a comparative study of IS711,bcsp31 and pertarget genes.Vet Microbiol,2009,137:156-164.

23 Memish Z,Mah MW,Al Mahmoud S,et al.Brucella bacteraemia: clinical and laboratory observations in 160 patients.J Infect,2000,40:59-63.

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.15.013

項目來源：首都醫科大學附屬北京地壇醫院院內科研基金(編號：DTQL201404)

010000 呼和浩特市，內蒙古醫科大學附屬醫院藥劑部(郭瑛);首都醫科大學附屬北京地壇醫院感染性疾病診療與研究中心，感染病科國家臨床重點專科(韓冰、孫華麗、蔣榮猛);中科院北京基因組研究所(王麗、劉貴明)

蔣榮猛，100015 首都醫科大學附屬北京地壇醫院感染性疾病診療與研究中心，感染病科國家臨床重點專科；

E-mail:13911900791@163.com

R 516.7

A

1002-7386(2017)15-2292-04

2017-02-14)