王晨晨，李一美，孫昊，蔡倩瑩，徐小茜，王耀成，王玉環，閆洪濤，楊新軍

（1.溫州醫科大學 公共衛生與管理學院，浙江 溫州 325035；2.溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院 產科，浙江 溫州 325027）

胎盤FAT/CD36表達與巨大兒發生的相關性

王晨晨1，李一美2，孫昊1，蔡倩瑩1，徐小茜1，王耀成1，王玉環2，閆洪濤1，楊新軍1

（1.溫州醫科大學 公共衛生與管理學院，浙江 溫州 325035；2.溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院 產科，浙江 溫州 325027）

目的：探討胎盤組織中脂肪酸轉位酶（FAT/CD36）表達與巨大兒發生的關系。方法：選擇2014年6月至2016年6月在溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院正常妊娠并足月分娩的89例產婦和新生兒為研究對象，其中44例為巨大兒，45例為正常兒。采用自制調查表收集產婦和新生兒的基本信息，并收集胎盤樣品。采用實時熒光定量PCR（qPCR）技術及Western blot法檢測巨大兒與正常兒胎盤組織中FAT/CD36基因和蛋白的表達水平，采用多因素logistic回歸進行巨大兒發生的影響因素分析。結果：qPCR和Western blot結果顯示，巨大兒組FAT/CD36表達水平高于正常兒（P＜0.05）。多因素logistic回歸分析表明，胎盤FAT/CD36基因mRNA高表達為巨大兒發生的危險因素，且與孕周、孕期體質量增加、新生兒性別共同影響巨大兒的發生。結論：FAT/CD36在胎盤組織中表達上調可能是導致巨大兒發生的機制之一。

FAT/CD36；巨大胎兒；胎盤

巨大兒是指出生體質量≥4 000 g的活產新生兒[1]。一項基于14個省38家醫院的回顧性調查顯示，2011年中國巨大兒發生率為7.3%[1]，且近年來巨大兒的發生率呈增長趨勢[2]。巨大兒不僅會顯著增加死胎、胎兒死亡（出生窒息導致）、出生損傷、胎糞吸入和剖宮產等產科問題[3]，而且會增加其成年后患糖尿病、肥胖等代謝性疾病的風險[4-5]。然而，巨大兒發生的原因和機制仍不清楚。因此，開展巨大兒發生的病因學研究，進一步揭示巨大兒的發生機制，對預防和控制巨大兒及其成年期疾病的發生具有重要的意義。脂肪酸是胎兒生長發育必需的營養物質，是人體細胞重要的能量來源。一項孕期高脂肪膳食導致小鼠肥胖模型的研究顯示，胎盤營養素能高效地運輸給胎兒，從而引起胎兒的過度生長[6]。胎兒脂肪酸水平不僅受母體脂肪酸水平影響，還受胎盤轉運效率的影響[7]。脂肪酸轉位酶（fatty acid translocase，FAT/CD36）作為一種跨膜蛋白，可通過改變長鏈脂肪酸（long-chain fatty acid，LCFA）的轉運和氧化代謝過程來調節胎盤脂肪酸代謝。但是，在巨大兒發生中是否有脂肪酸代謝異常，尚不清楚。因此，本研究通過檢測胎盤FAT/CD36的表達水平，探討其對LCFA轉運的影響及與巨大兒發生的關系。

1 對象和方法

1.1 對象 采用病例對照研究設計，選擇2014年6月至2016年6月于溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院進行常規產前檢查并在該院分娩的89例產婦及單胎足月新生兒。其中，巨大兒組為出生體質量≥4 000 g的新生兒，共44例；對照組為出生體質量在2 500～3 999 g，且與巨大兒分娩時間相差3 d以內的新生兒，共45例。入選標準：正常妊娠、單胎、足月分娩，糖耐量試驗正常，新生兒無先天畸形。排除標準：妊娠合并癥者（如糖尿病、高血壓、心臟病等）、妊娠并發癥者（如胎盤異常、先兆子癇等）和新生兒先天畸形。本研究得到了醫院倫理委員會批準，所有產婦均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 一般資料收集：采用自行設計的調查表收集產婦和新生兒的基本信息，內容包括產婦生產年齡、身高、孕前體質量、孕前體質量指數（body mass index，BMI）、孕期體質量增加、分娩方式、新生兒出生體質量及其他相關信息。

1.2.2 胎盤樣品采集與處理：胎盤娩出后，立即無菌操作取胎盤滋養層組織1 cm×1 cm×1 cm，放入經DEPC處理過的凍存管中，加入RNAlater（美國Ambion公司）保存，液氮運輸，并保存于-80 ℃冰箱。

1.2.3 胎盤RNA提取、反轉錄和qPCR檢測：用Trizol法提取胎盤總RNA，取5 μg總RNA進行反轉錄。采取qPCR法測定胎盤FAT/CD36表達水平，選取GAPDH作為內參基因，設計相應引物進行PCR擴增鑒定，引物至少跨1個內含子，以免基因組DNA污染。所用引物序列如下：FAT/CD36上游：5’-GGGTT ACATTTTCCTTGGCTAGAA-3’，下游：5’-GCAGCAACATTCAA GTTAAGCAA-3’[8]，產物片段長度為76 bp；GAPDH上游：5’-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3’，下游：5’-AGTC CTTCCACGATACCAAAG-3’[9]，產物片段長度為113 bp。 qPCR反應體系為20 μL：SYBR Premix Ex TapTM（2×）10 μL；引物（10 μmol/L）各1 μL；cDNA 1 μL；加去離子水至20 μL。反應條件：95 ℃ 30 s，95 ℃5 s，60 ℃ 30 s共40個循環。PCR產物經溶解曲線與瓊脂糖凝膠電泳分析，以保證產物的特異性。每個樣品做3個平行管，采用2-△△CT法進行數據處理。

1.2.4 Western blot法檢測胎盤組織中FAT/CD36表達水平：取胎盤組織PBS洗滌2次，棄上清，加入RIPA裂解液裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液測定蛋白質濃度，調整濃度一致，蛋白變性后-20 ℃保存。經SDS-PAGE后，電轉移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h，兔抗人抗體一抗（美國Abcam公司）1∶2 000孵育過夜，TBST洗膜3次每次10 min，用山羊抗兔二抗（美國Abcam公司）1∶5 000常溫孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min，使用增強化學發光液顯色，用凝膠成像系統采集圖像，采用Quantity one凝膠圖像分析系統對圖像中蛋白條帶的灰度值進行分析。

1.3 統計學處理方法 問卷調查資料和實驗數據統一錄入EpiData 3.1數據庫，運用SPSS19.0統計軟件進行分析。計量資料如呈正態分布，則以±s表示，若呈非正態分布用中位數（最小值，最大值）表示。計量資料采用成組t檢驗或Mann-Whitney U檢驗；計數資料采用χ2檢驗或秩和檢驗。采用單因素和多因素logistic回歸分析巨大兒的影響因素，以優勢比（odd ratio，OR）和95%可信區間（confidence interval，CI）來估計巨大兒發生危險因素的危險度。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料 2組間產婦生產年齡、新生兒性別、分娩方式、孕期體質量增加，差異有統計學意義（P＜0.05），其他因素如孕前體質量、身高、孕前BMI、孕周、產次在2組間差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

2.2 胎盤FAT/CD36基因mRNA表達 qPCR檢測結果顯示，巨大兒組FAT/CD36的mRNA表達量高于對照組，差異有統計學意義（Z=-3.340，P＜0.001），見圖1。進一步分析顯示，在男性新生兒中，巨大兒組FAT/CD36基因mRNA表達量為1.66（0.42，5.75），高于對照組的1.04（0.26，2.81），差異有統計學意義（Z=-3.202，P＜0.001）。而女性新生兒中，巨大兒組與對照組差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 產婦及新生兒臨床資料比較

圖2 2組胎盤FAT/CD36蛋白表達

2.4 巨大兒發生的影響因素分析 結合基線資料，采用多因素logistic回歸模型，對影響巨大兒發生的因素進行篩選與分析。以是否為巨大兒為因變量，其他因素如新生兒性別、孕周、FAT/CD36基因mRNA表達量等為自變量進行logistic回歸分析。結果顯示，在控制了新生兒性別、孕周、孕期體質量增加之后，胎盤FAT/CD36基因mRNA高表達為巨大兒發生的危險因素，且與孕周、孕期體質量增加、男性新生兒共同影響巨大兒的發生，見表2。

3 討論

FAT/CD36又稱為FAT、GP4、GP3B、PASIV等，是一種可以轉運LCFA的單鏈跨膜細胞表面蛋白。人的FAT/CD36含471個氨基酸殘基，由于糖基化程度不同，在不同的細胞中具有不同的分子量，為78～88 kDa[11]。FAT/CD36屬于B類清道夫受體家族蛋白成員之一，其配體包括低密度脂蛋白、天然脂蛋白、氧化的磷酸和長鏈脂肪酸等，FAT/CD36廣泛分布于脂肪、骨骼肌、胎盤等脂肪酸代謝活躍的組織中[12]。有研究發現，FAT/CD36敲除的小鼠骨骼肌和脂肪組織攝取和利用LCFA的速率顯著下降。當FAT/CD36在小鼠骨骼肌細胞中過量表達時，肌細胞攝取脂肪酸的速率大幅度提高，這說明FAT/CD36在LCFA的轉運過程中發揮著重要作用[13]。還有研究表明，FAT/CD36在調節心臟和骨骼肌中的LCFA利用過程中起到關鍵作用[14]。

由于胎兒自身合成LCFA功能有限，胎兒體內LCFA主要來自胎盤轉運。胎盤LCFA的被動擴散需借助載體蛋白轉運，包括胎盤脂肪酸轉位酶FAT/ CD36、脂肪酸轉運蛋白（fatty acid transportprotein，FATPs）、脂肪酸結合蛋白（fatty acid binding protein，FABPs）等，但只有FAT/CD36和FATP是位于絨毛膜和基底膜上，涉及到LCFA跨過整個胎盤的轉運[15]。本研究發現，胎盤組織中FAT/ CD36的mRNA表達量和蛋白水平在巨大兒組中明顯上調，FAT/CD36可能是通過促進LCFA在胎盤中的轉運，加速胎兒的生長和脂肪沉積，從而參與影響了巨大兒的發生。另外我們還發現在男性新生兒中，巨大兒比對照組FAT/CD36 mRNA表達上升，而女性新生兒中差異無統計學意義。這可能是由于男性胎兒對脂肪酸需求高于女性胎兒[16]，于是FAT/CD36高表達可以轉運更多脂肪酸來滿足男性胎兒的生長發育，這也可以解釋目前研究發現巨大兒中男性新生兒多于女性新生兒的現象。目前關于代謝性疾病與FAT/CD36關系的研究結果顯示，FAT/CD36高表達與胰島素抵抗、脂肪分化都有密切的關系，在肥胖和2型糖尿患者群中，脂肪組織的FAT/CD36表達都高于正常人[17]。而出生為巨大兒的新生兒，其身體脂肪含量高于正常體質量的新生兒[18]，并且巨大兒還可能增加兒童時期肥胖和成年后代謝性疾病的發病風險[19]。本研究發現的巨大兒胎盤FAT/CD36高表達，可能是巨大兒成年后易患代謝性疾病的一個間接證據，但具體機制還需要進一步研究證明。

表2 巨大兒影響因素的logistic回歸分析

本研究還分析了影響巨大兒發生的其他因素，與以往研究[20-21]相一致，男性新生兒、孕周延長、孕期體質量增加為巨大兒發生的危險因素。此外，在控制了新生兒性別、孕周、孕期體質量增加后，胎盤FAT/CD36基因mRNA高表達顯示為巨大兒發生的獨立危險因素，提示脂肪酸轉運參與了巨大兒的發生。

本研究也存在一些不足。由于本研究是一項以醫院為基礎的病例對照設計，可能會存在選擇偏倚，為了控制選擇偏倚，我們連續收集了本院2014 年6月至2016年6月能保證獲得全部信息的巨大兒為研究對象。另外，由于研究的樣本量有限，多因素分析模型中危險度估計的可信區間較寬，可能會影響估計的精確性。

綜上所述，FAT/CD36基因的 mRNA和蛋白表達水平在巨大兒胎盤組織中呈現明顯高表達，提示FAT/CD36基因可能參與了胎盤LCFA的轉運從而調節新生兒出生體質量，影響巨大兒發生。這為尋找巨大兒發生原因及其成年后代謝相關疾病的發生機制，提供了新的理論依據。

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（本文編輯：賈建敏）

Correlation between FAT/CD36 expression in placenta and macrosomia

WANG Chenchen1, LI Yimei2, SUN Hao1, CAI Qianying1, XU Xiaoxi1, WANG Yaocheng1, WANG Yuhuan2, YAN Hongtao1, YANG Xinjun1.
1.Department of Preventive Medicine, School of Public Health and Management, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035; 2.Department of Obstetrics, the Second Affi liated Hospital & Yuying Children’s Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective:To explore the correlation between expression of FAT/CD36 in placenta and macrosomia.Methods:The cases were collected from June 2014 to June 2016 in the Second Affi liated Hospital & Yuying Children’s Hospital of Wenzhou Medical University, including 44 macrosomia newborns and 45 normal birth weight newborns. A self-designed questionnaire was used to collect related information of pregnant women and their neonates, real-time fl uorescent quantitative PCR (qPCR) was used to detect FAT/CD36 mRNA expression in placenta. Western blot was used to detect FAT/CD36 protein expression. The infl uencing factors of macrosomia were analyzed by multivariate logistic regression model.Results:qPCR and Western blot showed FAT/CD36 expression of macrosomia was signifi cantly higher than that of healthy controls (P＜0.05). The result of multivariate logistic regression analysis showed that high expression of FAT/CD36 mRNA expression was a risk factor, and the occurrence of macrosomia was infl uenced by gestational age, gestational weight gain and newborns sex.Conclusion:The up-regulation of FAT/CD36 in placenta may be correlated with macrosomia.

FAT/CD36; fetal macrosomia; placenta

R114

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.06.006

2016-10-31

國家自然科學基金資助項目（81072378）；浙江省自然科學基金資助項目（Y2101185）。

王晨晨（1991-），女，河南洛陽人，碩士生。

楊新軍，教授，Email：xjyang@wmu.edu.cn。