吳茱萸堿對人胰腺癌SW1990細胞株體內外增殖及凋亡的影響

陳輝，王兆洪，陳龍，范恒偉，周斌，徐魯白，童洪飛

（溫州醫科大學附屬第二醫院 肝膽胰外科，浙江 溫州 325027）

吳茱萸堿對人胰腺癌SW1990細胞株體內外增殖及凋亡的影響

陳輝，王兆洪，陳龍，范恒偉，周斌，徐魯白，童洪飛

（溫州醫科大學附屬第二醫院 肝膽胰外科，浙江 溫州 325027）

目的：通過體內外實驗探討吳茱萸堿對人胰腺癌SW1990細胞株增殖及凋亡的影響。方法：人胰腺癌細胞株SW1990在經0、5、10、20、40、80 μmol/L吳茱萸堿分別作用12、24、48 h后，應用CCK-8法檢測吳茱萸堿對SW1990細胞的增殖抑制作用；流式細胞術檢測吳茱萸堿對SW1990細胞周期的影響；Western blot檢測SW1990細胞中Active Caspase-3及Active Caspase-8的表達。建立裸鼠胰腺癌原位移植瘤模型，分別予以0、10、20、30 mg/kg吳茱萸堿腹腔注射處理2周，每周給藥3次后，觀察裸鼠生長情況；處死裸鼠后，檢測原位移植瘤重的變化；Western blot及免疫組織化學法檢測腫瘤組織中Active Caspase-3及Active Caspase-8的表達。結果：吳茱萸堿對SW1990細胞的增殖抑制作用呈濃度和時間依賴性；胰腺癌SW1990細胞在G2/M期的細胞數明顯增加；Western blot檢測示SW1990細胞中Active Caspase-3及Active Caspase-8蛋白的表達明顯升高。在體內，隨著吳茱萸堿濃度的增加，對裸鼠原位胰腺移植瘤的生長抑制更明顯，瘤體中Active Caspase-3及Active Caspase-8蛋白的表達明顯升高。結論：吳茱萸堿可顯著抑制人胰腺癌SW1990細胞增殖，其作用在一定時間內呈濃度和時間依賴性，作用機制可能是將胰腺癌細胞的生長阻滯在G2/M期。同時吳茱萸堿可激活Caspase-8，并活化其下游的Caspase-3，從而促進腫瘤細胞的凋亡。

吳茱萸堿；胰腺癌；細胞增殖；細胞凋亡；細胞周期；Caspase-3；Caspase-8

胰腺癌是一種惡性程度很高，診斷和治療都很困難的消化道惡性腫瘤，其發病率和病死率近年來明顯上升，5年生存率＜1%，是預后最差的惡性腫瘤之一[1]。治療上多采用以外科手術為主的綜合治療，但手術切除率低，復發率高。化療是治療不能手術切除的胰腺癌，以及預防胰腺癌術后復發的主要手段之一。吉西他濱是治療進展期胰腺癌及胰腺癌術后復發的“金標準”化療方案[2]，但是吉西他濱化療的有效率低于10%，故研究一種新的有效的化療藥物迫在眉睫。研究[3-4]表明，中藥姜黃素、百里醌等藥物顯著抑制胰腺癌細胞增殖。

吳茱萸堿（Evodiamine）為中藥吳茱萸的主要成分[5]，對宮頸癌、肺癌、結腸癌等多種腫瘤有抑制作用，其機制可能是通過抑制腫瘤的增殖、轉移、血管形成，并促進其凋亡而發揮抗腫瘤作用[6]。本研究觀察吳茱萸堿對人胰腺癌SW1990細胞增殖及凋亡以及裸鼠胰腺癌原位移植瘤模型的影響，并探討其可能機制。

1 材料和方法

1.1 試劑 吳茱萸堿（藥物純度大于98%）、胰蛋白酶、碘化丙錠（PI）、二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司；RPMI1640培養基購自美國Gibco公司；CCK-8試劑盒（批號：C0038）、Tubulin抗體、FITC標記山羊抗小鼠IgG（H+L）購自上海碧云天生物技術研究所；胎牛血清購自杭州四季青生物工程公司；Caspase-3抗體、Caspase-8抗體和β-actin抗體購自美國Abcam公司。

1.2 細胞培養 人胰腺癌細胞SW1990（購于美國ATCC公司）培養于含10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養液中，置于含5% CO2，37 ℃細胞培養箱中培養，每3 d換液1次。細胞單層貼壁生長，約80%融合時胰蛋白酶消化傳代。

1.3 CCK-8法檢測細胞存活率 收集處于對數生長期的SW1990胰腺癌細胞，接種到96孔板，4×103個/孔，細胞貼壁后，分別加入吳茱萸堿0、5、10、20、40、80 μmol/L作用12、24、48 h，每組重復5孔，同時設置空白組（不加細胞，加入等量PBS）。藥物作用結束前1 h，各孔加入0.01 mL CCK-8，繼續培養1 h，酶標儀（Bio-Tek，ELX800）測A450值，實驗重復3次。細胞抑制率=[1-（試驗組A值-空白組A值）/（對照組A值-空白組A值）]×100%。

1.4 流式細胞術檢測吳茱萸堿對SW1990細胞周期的影響 將細胞濃度為2×105個/mL的SW1990胰腺癌細胞接種于6孔板中，孵育24 h后，以0、5、10、20、40、80 μmol/L的吳茱萸堿繼續孵育12、24、48 h后，收集細胞，以2 000 r/min離心10 min，棄去上清，用70%的冰乙醇，在4 ℃環境下固定過夜，經PI染液（PI 2.5 mg，RNase 0.5 mg及Trtition-X-100 0.25 mL）800 μL，避光染色30 min后，過500目尼龍網過濾，流式細胞儀進行檢測，激發波長為488 nm。

1.5 Western blot檢測SW1990胰腺癌細胞Active Caspase-3及Active Caspase-8蛋白的表達 收集處于對數生長期的SW1990細胞，經0、5、10、20、40、80 μmol/L的吳茱萸堿處理48 h后，RIPA裂解液裂解，提取上清液，測量蛋白濃度。取等量蛋白質樣品（20 μg/孔），8% SDS-PAGE電泳，半干轉膜儀轉膜，5%脫脂奶粉封閉后滴加兔抗人Caspase-3或者Caspase-8抗體為一抗，HRP標記的羊抗兔IgG為二抗，ECL顯色，X線膠片曝光。

1.6 裸鼠飼養 40只4～6周齡健康BALB/c雌性裸鼠購自中國科學院上海實驗動物中心，動物合格證號：SCXK（滬）2012-0002，體質量18～20 g，飼養于SPF屏障系統的潔凈層流架內，室溫控制在（25± 1）℃，相對濕度為40%～60%。

1.7 模型建立及分組 將5×106～10×106個處于對數生長期的SW1990細胞懸浮于50 μL無血清RPMI1640培養基中，細胞存活率＞90%，75%的乙醇消毒裸鼠腹部皮膚，用戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔麻醉裸鼠，取左上腹直肌旁1 cm切口，暴露脾臟和胰腺尾部，用50 μL微量注射器吸取50 μL胰腺癌細胞懸液，在放大鏡下注射到脾臟下面的胰尾部被膜下，以薄膜下出現可鑒別的隆起性液泡而無液體滲漏到腹腔為注射成功的標志[7]，注射成功后分兩層關閉腹壁。隨機分成4組，每組10只，手術后第3周開始給藥，分別予以0、10、20、30 mg/kg腹腔吳茱萸堿處理2周后，每周給藥3次，觀察裸鼠生長情況，2周后脫臼法處死裸鼠，留取荷瘤鼠的心臟、肝臟、腎臟、胃腸道，留取胰腺腫瘤并稱重，測量后將各臟器組織一部分用4%多基甲醛固定，另一部分保存于液氮中備用。

1.8 Western blot檢測裸鼠原位移植瘤組織中Active Caspase-3及Active Caspase-8蛋白的表達從荷瘤裸鼠中取出腫瘤組織，用常規方法提取各

組腫瘤細胞的總蛋白，BCA法定量蛋白濃度。每標本上樣約80 μg蛋白于12% SDS-PAGE凝膠，電壓80 V 約30 min，改電壓為125 V約持續1 h。然后從凝膠中采用半干轉膜法轉移蛋白質至PVDF膜，用含5%無脂牛奶TBST封閉，滴加兔抗人抗體4 ℃孵育過夜，HRP標記的羊抗兔IgG抗體孵育1 h，用ECL發光液顯色。

1.9 免疫組織化學法檢測裸鼠原位移植瘤組織中Ki-67、Active Caspase-3及Active Caspase-8蛋白的表達 取固定好的腫瘤組織，經脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，常規脫蠟水化。按照二步法試劑盒所示的操作步驟進行染色，切片經脫水、透明、封片。在高倍鏡（Olympus BX51，×400）下隨機選擇10個視野，Image-pro plus 6軟件分析平均光密度。

1.10 統計學處理方法 應用SPSS16.0統計軟件進行分析。計量數據以±s表示，組間比較采用重復測量資料方差分析或單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 吳茱萸堿對SW1900胰腺癌細胞增殖的抑制作用 CCK-8法檢測結果顯示：0、5、10、20、40、80 μmol/L吳茱萸堿分別作用12、24、48 h，均能明顯抑制胰腺癌細胞SW1990的生長，且隨著濃度的增加及時間的延長，吳茱萸堿對胰腺癌細胞增殖的抑制率增加，呈明顯的時間依賴性和濃度依賴性（見圖1）。

圖1 吳茱萸堿對SW1990胰腺癌細胞增殖的抑制作用

2.2 吳茱萸堿對SW1900胰腺癌細胞周期的影響流式細胞術檢測結果顯示：0、5、10、20、40、80 μmol/L吳茱萸堿分別作用12、24、48 h，隨著作用時間的延長和藥物濃度的增加，G2/M期細胞比率增加，差異有統計學意義（P＜0.05），呈明顯的時間依賴性和濃度依賴性（見表1）。

2.3 SW1990胰腺癌細胞中蛋白Active Caspase-3 及Active Caspase-8的表達 吳茱萸堿作用于SW1990細胞48 h后Western blot檢測胰腺癌細胞中蛋白Active Caspase-3及Active Caspase-8的表達，結果顯示隨著吳茱萸堿濃度的增加，Active Caspase-3及Active Caspase-8的表達均升高（見圖2）。

表1 吳茱萸堿對胰腺癌細胞SW1990 G2/M周期分布的影響（n= 5，±s，%）

表1 吳茱萸堿對胰腺癌細胞SW1990 G2/M周期分布的影響（n= 5，±s，%）

注：各時間點間、各濃度組間比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）

組別12 h24 h48 h 0 μmol/L10.95±0.8715.69±0.9618.99±0.97 5 μmol/L18.41±0.9922.70±1.1325.03±1.02 10 μmol/L21.67±1.0025.94±0.9228.76±0.96 20 μmol/L24.92±0.9328.68±0.9732.53±1.07 40 μmol/L28.63±1.0133.32±1.0636.71±1.01 80 μmol/L31.13±0.8936.17±0.9441.86±0.99

圖2 吳茱萸堿作用于SW1990細胞48 h后Western blot檢測細胞中Active Caspase-3及Active Caspase-8的表達

2.4 吳茱萸堿對裸鼠胰腺癌原位移植瘤生長的抑制作用 處死裸鼠后稱重瘤體，對照組、10 mg/kg、20 mg/kg、30 mg/kg吳茱萸堿組瘤體質量分別為（1.37±0.11）g、 （1.04±0.08）g、 （0.76±0.07）g、（0.42±0.05）g，顯示隨著吳茱萸堿濃度的增加，其對裸鼠原位胰腺移植瘤的生長抑制作用更加明顯（P＜0.05）。

2.5 胰腺癌原位移植瘤組織中Active Caspase-3及Active Caspase-8的表達 隨著吳茱萸堿濃度的增加，裸鼠胰腺癌原位移植瘤組織中Active Caspase-3及Active Caspase-8的表達均增加（見圖3）。

圖3 吳茱萸堿處理裸鼠后，Western blot檢測裸鼠胰腺癌原位移植瘤組織中Active Caspase-3及Active Caspase-8的表達

2.6 裸鼠胰腺癌原位移植瘤組織中ki-67、Active Caspase-3及Active Caspase-8的表達 處死裸鼠后，免疫組織化學檢測Ki-67、Active Caspase-3及Active Caspase-8在裸鼠胰腺癌原位移植瘤組織中的表達，結果顯示，隨著吳茱萸堿濃度的升高，Ki-67的表達降低，Active Caspase-3及Active Caspase-8的表達升高（見圖4及表2）。

圖4 免疫組織化學法檢測裸鼠胰腺癌原位移植瘤組織中Ki-67、Active Caspase-3及Active Caspase-8的表達（×200）

表2 免疫組織化學法檢測裸鼠胰腺癌原位移植瘤組織中Ki-67、Active Caspase-3及Active Caspase-8的表達（n=10，±s）

表2 免疫組織化學法檢測裸鼠胰腺癌原位移植瘤組織中Ki-67、Active Caspase-3及Active Caspase-8的表達（n=10，±s）

與0 mg/kg組比：aP＜0.05

組別Ki-67Active Caspase-3Active Caspase-8 0 mg/kg 0.18±0.020.09±0.010.08±0.01 10 mg/kg 0.14±0.01a0.12±0.01a0.11±0.01a20 mg/kg 0.12±0.01a0.16±0.02a0.14±0.02a30 mg/kg 0.10±0.01a0.18±0.01a0.17±0.01a

3 討論

中藥抗癌在國際上尚存有爭議，有效治療機制的不明確、中藥聯合及中西藥聯合治療理論依據的匱乏[8-9]，限制了中藥在國際上的認可及應用。盡管如此，一項調查報告顯示，在美國有40%的癌癥患者服用含中藥成分的藥品。近年來，越來越多的中藥單體被提煉出來，此類藥品純度高，化學性質較為單一，便于實驗研究，吳茱萸堿即為其中之一。

在體外實驗中，0～80 μmol/L內的不同濃度的吳茱萸堿均對人胰腺癌細胞株SW1990增殖有抑制作用，且隨著吳茱萸堿濃度的增加及作用時間的延長，細胞增殖的抑制率明顯增加。張醇等[10]研究證實吳茱萸堿可使腫瘤細胞的細胞周期阻滯在G2/M期，而吳茱萸堿引起的腫瘤細胞增殖抑制大部分發生在這一期。本研究流式細胞術檢測結果顯示，隨著吳茱萸堿濃度的增加及作用時間的延長，被阻滯在G2/M期的胰腺癌SW1990細胞的比率也明顯增多。G2/M期主要進行RNA合成和蛋白質準備分裂，這揭示吳茱萸堿可能影響了細胞生存所需蛋白質的合成，從而實現對腫瘤細胞的增殖抑制。我們通過檢測不同濃度吳茱萸堿處理胰腺癌裸鼠原位移植瘤結果顯示，隨著吳茱萸堿濃度的增加，對腫瘤生長的抑制明顯增強，免疫組織化學檢測結果證實，Ki-67隨著吳茱萸堿濃度的升高表達降低。

目前研究認為吳茱萸堿可誘導胃癌細胞SGC-7901細胞發生Caspase蛋白酶依賴性的凋亡[11]。本研究中，Western blot結果示Active Caspase-3、Active Caspase-8在低劑量吳茱萸堿組胰腺癌細胞中高表達，同一作用時間隨著吳茱萸堿濃度的升高而表達升高；在裸鼠原位移植瘤組織中，隨著吳茱萸堿作用時間的延長和濃度的升高，Active Caspase-8、Active Caspase-3的表達也升高，提示吳茱萸堿可以通過促進Caspase-8酶原的激活，從而激活Caspase-3，促進胰腺癌細胞的凋亡。

綜上所述，吳茱萸堿可顯著抑制人胰腺癌SW1990細胞生長，并呈濃度和時間依賴性，其作用機制可能是將胰腺癌SW1990細胞的生長阻滯在G2/M期。同時吳茱萸堿通過激活Caspase-3及Caspase-8等因子，促進胰腺癌SW1990細胞的凋亡，故在胰腺癌的治療上我們可以將Caspase-3及Caspase-8作為靶點。

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（本文編輯：丁敏嬌）

The effects of Evodiamine on the proliferation and apoptosis of pancreatic cancer SW1990 cells in vivo and in vitro

CHEN Hui, WANG Zhaohong, CHEN Long, FAN Hengwei, ZHOU Bin, XU Lubai, TONG Hongfei. Department of Hepatobiliary, the Second Affi liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective:To investigate the effects of Evodiamine on the proliferation and apoptosis of pancreatic cancer SW1990 cells.Methods:Pancreatic cancer SW1990 cells were mixed with different concentrations of Evodiamine (0, 5, 10, 20, 40, 80 μmol/L) after 12, 24, 48 hours respectively. The SW1990 cells’ proliferation was detected by cell counting Kit-8 (CCK-8). The SW1990 cells’ cycle was detected with fl ow cytometry test. Nude mouse models were established with orthotopic transplantation tumor, which were injected with different concentrations of Evodiamine for 2 weeks. The orthotopic transplantation tumor’s weight was measured after sacrifi ced. The expression of Active Caspase-3 and Active Caspase-8 in tumor tissues was detected by Western blot and immunohistochemistry.Results:Evodiamine inhibited the proliferation effect of SW1990 cells by concentration and time dependence. The quantity of pancreatic cancer SW1990 cells in G2/M phase signifi cantly increased. The expressions of Active Caspase-3 and Active Caspase-8 protein signifi cantly increased. With increasing of Evodiamine concentrations, the inhibiting effect on the nude mouse’s growth of pancreas transplantation tumor was more remarkable and the expressions of Active Caspase-3 and Active Caspase-8 increased much more obviously in the tumor tissues.Conclusion:Evodiamine can signifi cantly inhibit human pancreatic cancer SW1990 cells’ proliferation with concentration and time dependence. Its mechanism may retard the growth of pancreatic cancer cells in G2/M phase. In the meantime, Evodiamine can activate Caspase-8 and Caspase-3, then promote the apoptosis of pancreatic cancer cells.

Evodiamine; pancreatic cancer; cell proliferation; apoptosis; cell cycle; Caspase-3; Caspase-8

R735.9

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.06.009

2016-10-13

浙江省中醫藥管理局青年基金資助項目（2014ZQ020）；溫州市公益性科技計劃項目（Y20140694）。

陳輝（1983-），男，浙江溫州人，主治醫師，碩士。

童洪飛，副主任醫師，Email：tonghongfei@163.com。