孕期維生素A缺乏對(duì)大鼠子代肝臟脂質(zhì)合成的影響

魏小平,周 靜,王宏英,陳 潔,肖曉秋,李廷玉△

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院營(yíng)養(yǎng)研究中心，重慶 400014；2.兒童發(fā)育疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400014；3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院門診部，重慶 400014；4.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院脂糖代謝實(shí)驗(yàn)室，重慶 400014)

·論 著·

孕期維生素A缺乏對(duì)大鼠子代肝臟脂質(zhì)合成的影響

魏小平1,2,周 靜3,王宏英4,陳 潔1,2,肖曉秋4,李廷玉1,2△

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院營(yíng)養(yǎng)研究中心，重慶 400014；2.兒童發(fā)育疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400014；3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院門診部，重慶 400014；4.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院脂糖代謝實(shí)驗(yàn)室，重慶 400014)

目的 通過(guò)孕期維生素A(VA)缺乏大鼠模型，探討孕期VA缺乏對(duì)子代肝臟組織中脂質(zhì)合成的影響。方法 建立大鼠孕期VA缺乏模型，分VA正常(VAN)、VA缺乏(VAD)、VA缺乏后補(bǔ)充(VAS)3組，檢測(cè)子代血脂水平；肝臟中乙酰輔酶A羧化酶1(ACC1)、脂肪酸合成酶(FAS)、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP1)等脂質(zhì)合成分子的mRNA表達(dá)變化；觀察子代肝臟組織切片HE染色后脂滴沉積情況。結(jié)果 VAD組的HDL-C水平顯著低于VAN組和VAS組(P<0.05)，而VAN組和VAS組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。TG水平在3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。VAD組ACC1、FAS、SREBP1 mRNA表達(dá)水平顯著增加。VAD組肝臟出現(xiàn)較多的脂滴沉積，細(xì)胞質(zhì)中有部分脂滴空泡；而VAS組和VAN組肝細(xì)胞排列規(guī)則，未見(jiàn)明顯脂滴沉積。結(jié)論 孕期VA缺乏可誘發(fā)大鼠子代肝臟脂質(zhì)合成通路的異常活化，造成質(zhì)脂代謝紊亂。

維生素A；肝臟；脂代謝；大鼠，Sprague-Dawley

維生素A(VA)是一類源于β紫香酮的衍生物，是一種重要的微量營(yíng)養(yǎng)素，VA缺乏(VAD)是全球三大微量營(yíng)養(yǎng)素缺乏性疾病和營(yíng)養(yǎng)公共衛(wèi)生問(wèn)題，尤其在經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)國(guó)家VAD問(wèn)題非常嚴(yán)峻[1]。VAD與各種疾病相關(guān)，VA對(duì)促進(jìn)正常視力、繁殖、免疫功能和細(xì)胞分化的重要性已被普遍證明[2]。近年來(lái)，VA在脂肪組織生物學(xué)、肥胖癥和2型糖尿病方面的重要性也趨于明顯[3-4]。有研究報(bào)道，VA的干預(yù)可以降低肥胖大鼠的肥胖程度[5]，但是具體機(jī)制尚不清楚。肝臟是VA發(fā)揮生理機(jī)能的重要場(chǎng)所，也是人體脂代謝的重要場(chǎng)所。為了進(jìn)一步明確VA與肥胖、代謝紊亂之間的關(guān)系，找到VA影響脂代謝的調(diào)控通路和分子機(jī)制，本研究通過(guò)已建立的孕期VA缺乏大鼠模型，探討孕期VAD對(duì)大鼠子代肝臟脂質(zhì)合成的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雌性SD大鼠60只，購(gòu)于第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體質(zhì)量210～240 g,動(dòng)物隨機(jī)分為3組：VA正常組(VAN組)、VA缺乏組(VAD組)、VA缺乏后補(bǔ)充組(VAS組)。飼料自制，VAN正常組的飼料，加入VA的量為6 500 IU/kg，VAD組的飼料，加入VA的量為400 IU/kg，飼料制作在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院營(yíng)養(yǎng)研究中心完成。檢測(cè)目的基因的引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

1.2 動(dòng)物模型建立及處理 動(dòng)物造模方法來(lái)源于課題組前期專利[6]，VAN組：從母鼠孕期和哺乳期，到仔鼠生后12周齡，母鼠和仔鼠均喂養(yǎng)VA正常飼料，母鼠共10只，仔鼠從每窩中隨機(jī)抽取，雌雄各1只，仔鼠共20只。VAD組：從母鼠孕期和哺乳期，到仔鼠生后12周齡，母鼠和仔鼠均喂養(yǎng)VA缺乏飼料。母鼠共10只，仔鼠從每窩中隨機(jī)抽取，雌雄各1只，共20只。VAS組：母鼠孕期和哺乳期喂養(yǎng)VA缺乏飼料，仔鼠斷奶后到仔鼠12周齡喂養(yǎng)VA正常飼料。母鼠共10只，仔鼠從每窩中隨機(jī)抽取，雌雄各1只，共20只。實(shí)驗(yàn)大鼠喂養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF飼養(yǎng)間，仔鼠均在12周齡時(shí)處死，取血分離血清，并取肝臟組織，部分放入裝有RNA保護(hù)液的EP管中，用于mRNA檢測(cè)，部分用4%多聚甲醛保存，用于HE染色。

1.3 指標(biāo)檢測(cè)及方法 采用反相高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)血清中的VA水平，所用儀器為日本島津LC-20A高效液相色譜儀(流動(dòng)相為甲醇∶水=97∶3)。采用全自動(dòng)血生化分析儀檢測(cè)血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C水平。采用Real time Q-PCR 檢測(cè)大鼠肝臟組織脂代謝相關(guān)分子肝臟中乙酰輔酶A羧化酶1(ACC1)、脂肪酸合成酶(FAS)、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1(SREBP1)的表達(dá)情況。用肝臟組織切片，HE染色后顯微鏡下觀察各組大鼠脂滴沉積和肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。

2 結(jié) 果

2.1 造模后各組仔鼠血清VA水平 VAN組的仔鼠在出生時(shí)、斷奶(3周齡)時(shí)、12周齡時(shí)這3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血清VA水平都顯著高于VAD組和VAS組的仔鼠(P<0.05)，VAD組和VAS組的仔鼠在出生時(shí)和3周齡時(shí)，兩組間血清VA水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而當(dāng)仔鼠12周齡時(shí)，VAS組的血清VA水平顯著高于VAD組仔鼠的血清VA水平(P<0.05)。仔鼠12周齡時(shí)，VAD組血清VA水平處于缺乏狀態(tài)(≤0.7 μmol/L)，VAN組和VAS組的血清VA水平都達(dá)到了正常狀態(tài)(≥1.05 μmol/L)，VAN組和VAS組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組仔鼠從出生到12周齡時(shí)血清VA水平

a：P<0.05，與VAN組比較；b：P<0.05，與VAD組比較。

2.2 血脂水平 3組之間的TC、LDL-C水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。TG水平在3組之間均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，VAD組的TG水平高于VAS組的TG水平高于VAN組的TG水平。VAD組的HDL-C水平顯著低于VAN組和VAS組(P<0.05),VAN組和VAS組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組仔鼠12周齡時(shí)血脂水平

a：P<0.05，與VAN組比較；b：P<0.05，與VAD組比較。

2.3 PCR檢測(cè)大鼠肝臟中脂質(zhì)合成相關(guān)分子的表達(dá)

2.3.1 各組大鼠肝臟中ACC1 mRNA的表達(dá)水平 由圖1可知，VAD組ACC1 mRNA表達(dá)水平顯著高于VAN組和VAS組(P<0.05)，VAS組和VAN組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

*：P<0.05，與VAD組比較。

圖1 大鼠肝臟中ACC1 mRNA的表達(dá)水平

2.3.2 各組大鼠肝臟中FAS mRNA的表達(dá)水平 由圖2可知，VAD組FAS mRNA表達(dá)水平顯著高于VAN組(P<0.05)，VAS組和VAD組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，VAS組和VAN組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

*：P<0.05，與VAD組比較。

圖2 大鼠肝臟中FAS mRNA的表達(dá)水平

2.3.3 各組大鼠肝臟中SREBP1 mRNA的表達(dá)水平 由圖3可知，VAD組的SREBP1 mRNA表達(dá)水平顯著高于VAN組(P<0.01)和VAS組(P<0.05)。VAS組和VAN組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

*：P<0.05，與VAD組比較;**：P<0.01，與VAD組比較。

圖3 大鼠肝臟中SREBP1 mRNA的表達(dá)水平

2.4 各組大鼠肝臟組織切片HE染色后形態(tài)觀察 肝臟組織切片HE染色，在顯微鏡下觀察各組大鼠肝臟組織的形態(tài)學(xué)變化，結(jié)果顯示，VAD組肝臟出現(xiàn)較多的脂滴沉積，胞漿中有部分脂滴空泡，VAS組和VAN組肝細(xì)胞排列規(guī)則，未見(jiàn)明顯脂滴沉積，見(jiàn)圖4。

A:VAN組；B:VAD組；B:VAS組。

圖4 各種大鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)變化(×200)

3 討 論

脂質(zhì)合成是肝臟的脂肪酸代謝的重要部分，其中ACC1和FAS是脂肪酸合成的兩個(gè)十分關(guān)鍵的酶，在調(diào)節(jié)脂肪酸合成中有重要的作用[7-8]。在肥胖等脂質(zhì)紊亂發(fā)生機(jī)制的研究中，脂肪酸的合成是重要的途徑。SREBPs家族在脂質(zhì)合成過(guò)程中起到了一定的轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控作用[9-10]。在本課題中，作者針對(duì)脂質(zhì)合成，對(duì)脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子SREBP1和脂肪酸合成的關(guān)鍵酶ACC1、FAS進(jìn)行了研究。有研究證實(shí)，SREBP1可以直接參與調(diào)控有關(guān)脂肪酸合成酶ACC1和FAS的表達(dá)水平[11-12]。在本研究中發(fā)現(xiàn)VAD組的肝臟中SREBP1基因的表達(dá)，顯著高于VAN組和VAS組，VA補(bǔ)充后SREBP1基因的表達(dá)下降，VA補(bǔ)充后SREBP1基因的表達(dá)水平和VAN組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。因此，作者推測(cè)，SREBP1可能參與到VA對(duì)脂質(zhì)代謝的調(diào)控中，同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)，VA缺乏同時(shí)上調(diào)了肝臟中ACC1和FAS的表達(dá)水平，因此可以證實(shí)，VA缺乏和脂質(zhì)合成紊亂有重要的關(guān)系。在對(duì)VAS組的研究發(fā)現(xiàn)，VA補(bǔ)充后顯著降低了肝臟中ACC1的表達(dá)，而并未顯著降低FAS的表達(dá)。因此，作者推測(cè)VA參與脂質(zhì)代謝調(diào)控，可能是通過(guò)調(diào)節(jié)SREBP1基因的表達(dá)，從而調(diào)控ACC1的表達(dá)，繼而進(jìn)一步調(diào)控脂肪酸合成。而VA是否能調(diào)控FAS的表達(dá)，在本研究中尚不能證明，VA缺乏引起的FAS表達(dá)顯著升高，而VA補(bǔ)充并未顯著下調(diào)FAS水平，可能是存在其他途徑對(duì)FAS表達(dá)造成影響。

目前有關(guān)VA對(duì)SREBP1的影響機(jī)制尚不明確，但有研究發(fā)現(xiàn)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)和SREBP-1有關(guān)聯(lián)，而PPAR和維甲類X受體(RXR)可相互作用[13]。Ronis等[14]發(fā)現(xiàn)，激活PPAR信號(hào)通路與抑制SREBP-1信號(hào)通路可以改善胰島素抵抗(IR)。上述研究中提到的PPAR和VA代謝物有緊密的聯(lián)系，VA及其代謝物的分子作用是通過(guò)包括視黃酸受體(RAR)和維甲類X受體(RXR)在內(nèi)的細(xì)胞核激素受體家族的相互作用反映出來(lái)的，除形成RXR:RXR同源二聚體之外，RXR還會(huì)與RAR形成異質(zhì)二聚體(RAR:RXR)，并與過(guò)氧化物酶體增殖因子活化受體(PPAR:RXR)相搭配[15]，因此作者推測(cè)VA通過(guò)配體受體相互作用，調(diào)控PPAR，然后調(diào)控SREBP1這一途徑可能是VA調(diào)控SREBP1的通路之一。但這僅是推測(cè)，還需進(jìn)一步深入研究證實(shí)。

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Influence of gestational vitamin A deficiency on liver lipid synthesis in offspring of rats*

WeiXiaoping1,2,ZhouJing3,WangHongying4,ChenJie1,2,XiaoXiaoqiu4,LiTingyu1，2△

(1.Children′sNutitionResearchCenter,Children′sHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400014,China;2.MinistryofEducationKeyLaboratoryofChildDevelopmentandDisorders,Chongqing400014,China;3.OutpatientDepartment,Children′sHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400014,China;4.LaboratoryofLipid&GlucoseMetabolism,TheFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400014,China)

Objective To investigate the influence of gestational vitamin A(VA) deficiency on lipid synthesis in offspring liver tissue by using the rat model of gestational vitamin A deficiency.Methods The rat model of gestational VA deficiency was established and divided into the normal AV,VA deficiency and VA deficiency and supplement (VAD) groups.The offspring blood lipid levels were detected.The mRNA expression changes of lipid synthesis molecule ACC1,FAS and SREBP1 in liver were detected;the lipid droplet deposition situation after HE staining in offspring liver tissue section was observed.Results The HDL-C level of the VAD group was significantly lower than that of the VA normal group(VAN group and VAS group,P<0.05),and the difference between the VAN group and VAS group had no statistical difference(P>0.05).The TG level had statistically significant difference among the three groups(P<0.05).The ACC1,FAS and SREBP1 mRNA expression levels in the VAD group were significantly increased.The liver in the VAD group appeared more lipid droplet deposit with partial lipid droplet vacuoles in cytoplasm;while the liver cells in the VAS and VAN groups showed the regular arrangement without obvious lipid droplet deposit.Conclusion Gestational VA deficiency may induce the abnormal activation of liver lipid synthesis pathway in rat offspring and causes lipid metabolic disturbance.

vitamin A;liver;lipids metabolism;rats,Sprague-Dawley

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.16.001

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81602844)；重慶市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(CSTC,2010BB5370)。作者簡(jiǎn)介：魏小平(1981-)，博士，助理研究員，主要從事兒童營(yíng)養(yǎng)研究。△

，E-mail:tyli@vip.sina.com。

R153.2

A

1671-8348(2017)16-2161-03

2017-01-06

2017-03-10)