響應面法優化田艾中總黃酮的提取工藝研究

張玲，梁妍，葉日清，張鐘

（1.廣東石油化工學院廣東高校果蔬加工與貯藏工程技術開發中心，廣東茂名525000；2.廣東石油化工學院環境與生物工程學院，廣東茂名525000）

響應面法優化田艾中總黃酮的提取工藝研究

張玲1，2，梁妍2，葉日清2，張鐘1，2

（1.廣東石油化工學院廣東高校果蔬加工與貯藏工程技術開發中心，廣東茂名525000；2.廣東石油化工學院環境與生物工程學院，廣東茂名525000）

以田艾絨為原料，采用微波輔助乙醇法提取田艾中總黃酮。在單因素試驗基礎上，選擇乙醇體積分數、微波功率、微波時間為自變量，總黃酮得率為響應值，采用響應面法中的Box-Behnken模型對田艾中總黃酮提取工藝進行優化。結果表明，最佳提取工藝條件如下：料液比為1∶50（g/mL），預浸時間為30 min，乙醇體積分數為20%，微波功率為350 W，微波時間為67 s，此條件下田艾總黃酮的實際得率為23.60 mg/g。

田艾；總黃酮；提取；響應面

田艾又名白頭翁，屬菊科艾屬植物，人們經常摘取來制作餅等糕點食用，以達到避邪氣、驅寒毒的效果；另據《食物本草》介紹，田艾還具有祛濕，暖胃，清腸等功效。現代研究表明，艾屬植物大多具有多種生物活性和藥理功能，這些作用使其在醫藥、食品、化妝品等工業中應用廣泛。黃酮類化合物是植物中廣泛存在的一類活性物質，具有抗癌防癌、抗菌殺菌、改善心血管功能、延緩衰老、降血脂血壓等功效[1]。黃酮類化合物在人體內不能直接合成，從植物中提取黃酮類化合物是人類獲得酮類化合物的主要方式[2]。

微波是一種頻率范圍從300 MHz至300 GHz的非電離電磁能量[3]，微波輔助提取技術與傳統提取技術相比，具有選擇性高、操作時間短、溶劑消耗量少、有效成分得率高、不產生噪聲、產物易于純化等優點[4-5]，已廣泛應用于多種天然產物的提取[6]。黃酮類化合物的提取、改性及功能研究是近年來天然產物研究方面的熱點。但查閱大量文獻發現，目前對田艾中黃酮類化合物的研究還鮮有報道。為了更好地開發利用田艾這種藥食兼用的資源，本論文采用微波輔助有機溶劑法提取了田艾總黃酮，并對提取液進行了穩定性研究。研究結果旨在為田艾黃酮在醫藥、食品、化妝品工業中的應用提供理論依據，促進田艾資源的有效開發利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

田艾絨：購自茂名市官渡市場；蕓香葉·三水：國藥集團化學試劑有限公司；其余常規化學試劑均為分析純，均購于天津大茂化學試劑廠。

1.2 儀器

ZF-6型三用紫外分析儀：上海驥輝科學分析儀器有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；DG120型半斤裝中藥材粉碎機：浙江省瑞安市春海藥材器械廠；722G可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；G70D20CNIP-D2（SO）型格蘭仕微波爐：廣東格蘭仕微波爐電器制造有限公司；數顯恒溫水浴鍋KW-1000DC：江蘇金壇市億通電子有限公司；SHB-3循環水多用真空泵：上海正保儀表廠。

1.3 方法

1.3.1 提取工藝流程及操作要點

田艾絨→粉碎→稱取→預浸→微波處理→抽濾→濾液→60%乙醇定容→提取液

將田艾絨粉碎備用，稱取1.000 g田艾絨，放入錐形瓶中，加入40 mL 60%乙醇溶液在常溫下密封浸泡30 min，再在350 W的微波下作用60 s，提取1次，趁熱抽濾，棄去濾渣。將濾液轉入100 mL容量瓶中，用60%乙醇溶液定容至刻度線處備用。

1.3.2 田艾提取液中總黃酮的顯色試驗

1）鹽酸—鎂粉還原反應：取上述濾液5 mL于試管中，加少許鎂粉，振搖，再加幾滴濃鹽酸，1 min～2 min后觀察并記錄實驗現象。

2）鋁鹽絡合反應：在濾紙上滴加1滴濾液，干燥后噴2%三氯化鋁甲醇溶液，烘干，在紫外燈下觀察，記錄實驗現象。

3）鉛鹽絡合反應：取上述濾液5 mL于試管中，加幾滴1%乙酸鉛溶液，觀察并記錄實驗現象。

4）氫氧化鈉反應：取上述濾液5 mL于試管中，加1%氫氧化鈉溶液，觀察并記錄實驗現象。

5）濃硫酸反應：取上述濾液5 mL于試管中，加幾滴濃硫酸，觀察并記錄實驗現象。

1.3.3 黃酮標準曲線的建立

1.3.3.1 最大吸收波長的確定

稱取干燥至恒重的蘆丁標準品10 mg，用體積分數60%乙醇溶液溶解，定容于100 mL容量瓶中，搖勻，得0.100 0 mg/mL的蘆丁標準溶液，置于冰箱貯存，備用。

準確吸取0.0、3.0 mL蘆丁標準溶液于25 mL比色管中，用體積分數60%乙醇溶液稀釋至10.0 mL，再加入1.0 mL的5%的亞硝酸鈉溶液，搖勻，靜置6 min，加入1.0 mL的10%硝酸鋁溶液，搖勻，靜置6 min，加入4.0 mL的10%氫氧化鈉溶液，用60%乙醇溶液定容至刻度。放置15 min后，以不加蘆丁標準液為參比，用可見分光光度計在480 nm～520 nm波長范圍內測定吸收峰，選擇吸光度最大時的波長即為蘆丁標準溶液的最大特征吸收波長。以同樣的方法，確定田艾提取液的最大特征吸收波長。

1.3.3.2 標準曲線的制作

分別取 0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 的蘆丁標準溶液置于25 mL的比色管中，用體積分數60%的乙醇溶液稀釋至10.0 mL，再加入1.0 mL的5%的亞硝酸鈉溶液，搖勻，靜置6 min，加入1.0 mL的10%硝酸鋁溶液，搖勻，靜置6 min，加入4.0 mL的10%氫氧化鈉溶液，用60%乙醇溶液定容至刻度。放置15 min后，以不加蘆丁標準液為參比，用1 cm的玻璃比色皿于蘆丁標準液的最大吸收波長下測定吸光度。以吸光度A為縱坐標，蘆丁標準溶液的濃度c（mg/mL）為橫坐標繪制標準曲線，用最小二乘法進行回歸，得到蘆丁濃度c與吸光度A關系曲線的回歸方程式。

1.3.4 田艾提取液總黃酮測定

將提取、定容備用的田艾提取液精確移取1.00 mL于25 mL比色管中，采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH體系絡合顯色步驟（同標準曲線制作），分別加入各種試劑后定容至刻度。在蘆丁標準溶液的最大特征吸收波長處進行比色測定，以試劑作為空白。測得其吸光度后，由吸光度根據回歸方程計算出濃度c，然后利用以下方程計算田艾總黃酮得率：

式中：y為總黃酮的得率，mg/g；c為經吸光度計算出的總黃酮濃度，mg/mL；V為測定時，移取到25 mL比色管中的體積，mL；n為樣品提取液測定時的稀釋倍數；m為田艾的質量，g；100為提取液定容的體積。

1.3.5 田艾總黃酮提取工藝的優化

用微波輔助乙醇法提取田艾總黃酮，對乙醇體積分數、料液比、微波功率、微波時間、預浸時間等因素進行單因素試驗，找出對總黃酮提取影響顯著的因素，再采用響應面分析試驗優化提取工藝條件。

1.3.5.1 單因素試驗

1）第一組預浸時間為 30 min，料液比為 1∶50（g/mL），微波功率為350 W，微波時間為60 s，改變乙醇體積分數（0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%）進行提取，測定總黃酮濃度，初步確定乙醇體積分數范圍。

2）第二組預浸時間為30 min，乙醇體積分數為60%，微波功率為350 W，微波時間為60 s，改變料液比 1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60、1 ∶70（g/mL）進行提取，測定總黃酮濃度，初步確定料液比范圍。

3）第三組預浸時間為30 min，乙醇體積分數為60%，料液比為 1 ∶50（g/mL），微波時間為 60 s，改變微波功率 210、280、350、420、490、560 W 進行提取，測定總黃酮濃度，初步確定微波功率范圍。

4）第四組預浸時間為30 min，乙醇體積分數為60%，料液比為1∶40（g/mL），微波功率為350 W的條件下，改變微波時間 20、40、60、80、100、120 s進行提取，測定總黃酮濃度，初步確定微波時間范圍。

5）第五組乙醇體積分數為60%，料液比為1∶40（g/mL），微波功率為 350 W，微波時間為 60 s，改變預浸時間 10、20、30、40、50、60 min 進行提取，測定總黃酮濃度，初步確定浸提時間范圍。

1.3.5.2 響應面法優化試驗

根據Box-Behnken中心組合試驗設計原理[7]，結合單因素試驗結果，以乙醇體積分數、微波功率和微波時間為影響因素，以總黃酮得率為響應值，采用三因素三水平的響應面分析法進行試驗設計[8]，建立數學回歸模型，對影響田艾總黃酮提取的工藝條件參數進行優化。因素水平見表1。

表1 Box-Behnken的中心組合因素水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken central component experiments design

2 結果與分析

2.1 田艾提取液的顯色反應

按照1.3.2的提取方法得到的提取液進行顯色反應的結果如表2所示。

表2 田艾提取液進行顯色反應的結果Table 2 Results of Tian Ai extract color reaction

以上5個顯色現象皆與相關文獻記載相符，故可判斷田艾中含有黃酮類化合物，并可能含有較多的異黃酮，可進行下一步試驗。

2.2 標準曲線的繪制

在480 nm～520 nm波長范圍內測定蘆丁標準溶液及提取液的吸光度，蘆丁標準溶液和田艾提取液可見光掃描圖，如圖1所示。

圖1 蘆丁標準溶液和田艾提取液可見光掃描圖Fig.1 Rutin standard solution and Tian Ai extract visible light scan

圖1結果表明，在506 nm處蘆丁標準溶液及提取液吸光度最大，故選擇506 nm為最大特征吸收波長。在此波長下，根據NaNO2-Al（NO3）3-NaOH體系絡合顯色測得蘆丁濃度與吸光度的關系，繪制標準曲線如圖2所示；以蘆丁濃度c（mg/mL）對吸光度A做回歸，得方程為：A=12.564c-0.004 1，R2=0.999 2，結果表明蘆丁濃度在0～0.020 0 mg/mL范圍內線性關系良好。

在506 nm處蘆丁標準曲線，結果如圖2所示。

圖2 蘆丁標準曲線Fig.2 Standard curve of rutin

2.3 單因素試驗

2.3.1 乙醇體積分數對田艾總黃酮提取效果的影響

乙醇體積分數對田艾總黃酮提取效果的影響，結果見圖3。

圖3 乙醇體積分數對總黃酮得率的影響Fig.3 Effects of ethanol concentration on the yield of total flavonoids

由圖3可知，在乙醇體積分數小于20%時，隨著乙醇體積分數的增加，溶于乙醇中的黃酮增加，總黃酮得率也在提高；當乙醇體積分數達到20%時，田艾中總黃酮得率最高；在20%～50%范圍內，隨著乙醇體積分數的增加，總黃酮得率緩慢下降；在乙醇體積分數大于50%時，隨著乙醇濃度的升高，總黃酮得率出現急劇下降趨勢，這可能是由于田艾中其他有機物質與黃酮產生競爭作用，其溶出能力優于黃酮。在提取過程中，乙醇體積分數大于50%時，隨著乙醇體積分數的增加，提取液由原來的棕黃色逐漸變綠，這可能是田艾中的有機色素大量溶出。譬如葉綠素等脂溶性物質的溶出較多，并導致溶液沸點下降，乙醇揮發嚴重導致體系溫度下降從而影響黃酮的提取[9]；也有人用水提法進行總黃酮的提取[10]。綜合考慮乙醇體積分數對總黃酮得率的影響，選10%、20%、30%為進一步優化的范圍。

2.3.2 料液比對田艾總黃酮提取效果的影響

料液比對田艾總黃酮提取效果的影響，結果如圖4所示。

圖4 料液比對總黃酮得率的影響Fig.4 Effects of different ratio of solutions to material on the yield of total flavonoids

由圖4可知，在料液比小于1∶50（g/mL）時隨著乙醇溶液體積的增加，乙醇溶液對黃酮的溶解能力也在增加，總黃酮的得率也在提高；當料液比達1∶50（g/mL）時，總黃酮得率最大；由于田艾中所含黃酮的量是有限的，當田艾中的黃酮被較完全提出后，再增加乙醇體積，黃酮的提取量也不會有明顯的變化了，總黃酮的得率基本趨于穩定。在實際操作中既要考慮總黃酮的充分溶出，同時也為避免溶劑的浪費，綜合兩方面的因素，料液比設置為1∶50（g/mL）時較佳。

2.3.3 微波功率對田艾總黃酮提取效果的影響

微波功率對田艾總黃酮提取效果的影響，結果見圖5。

圖5 微波功率對總黃酮得率的影響Fig.5 Effects of microwave power on the yield of total Flavonoids

由圖5可以看出，當微波功率小于350 W時，隨著微波功率的增大，總黃酮得率升高；當微波功率大于350 W后，隨著微波功率的增大，總黃酮得率反而降低。這是因為微波提供的能量是通過極性分子的偶極旋轉和離子傳導兩種作用直接透過透明的溶劑，傳導到植物物料的細胞內部，使細胞內瞬間升溫，隨著微波能量的增大，加劇其內部壓力超過細胞壁膨脹的能力，致細胞破裂，使細胞內的物質自由流出傳遞至周圍的溶劑中被加速溶解[11-12]；當微波功率超過350 W后由于溫度過高而使部分乙醇溶劑蒸發為氣體減少了與田艾接觸的幾率，所以提取率會有所下降。且功率增大到一定程度，會破壞黃酮類物質，黃酮得率也會降低。故選取微波功率為280、350、420 W作為響應面優化試驗的考察水平[13]。

2.3.4 微波作用時間對田艾總黃酮提取效果的影響

圖6為微波作用時間對田艾總黃酮得率的影響結果圖。

圖6 微波作用時間對總黃酮得率的影響Fig.6 Effects of microwave duration on the yield of total Flavonoids

由圖6可以看出，隨著微波作用時間的增加，總黃酮的得率先升高后降低，在微波作用時間為60 s時最高。這是由于，微波輻射時間過短，黃酮類物質還未充分溶出；隨著微波作用時間的延長，黃酮溶出量逐漸增大；60 s以后，隨著提取時間的增加，體系的溫度會過熱并出現爆沸的現象，一方面高溫可能導致黃酮類物質分解；另一方面，爆沸也會引起部分田艾被沖至容器壁上，影響液固兩相的進一步接觸，也有少部分溶液因爆沸而損失，最終使得率降低。因此，本研究選取微波作用時間為40、60、80 s作為響應面優化試驗的考察水平[14]。

2.3.5 預浸時間對田艾總黃酮提取效果的影響

預浸時間對田艾總黃酮提取效果的影響，結果如圖7所示。

圖7 預浸時間對總黃酮得率的影響Fig.7 Effects of presoaking time on the yield of total flavonoids

由圖7可以看出，在30 min內，隨著預浸時間的延長，總黃酮得率逐漸升高；預浸超過30 min后，總黃酮得率趨于平緩。這可能是由于，預浸時間太短，有部分黃酮來不及溶出，延長預浸時間可使其繼續溶出；而預浸時間太長，在室溫下總黃酮的溶出達到飽和，故趨于平緩。因此，從總體來看預浸時間對田艾總黃酮得率的影響不大。綜合考慮，選擇田艾總黃酮的最佳預浸時間為30 min。

2.4 響應面法優化試驗

2.4.1 響應面法試驗結果及分析

響應面法試驗結果及分析見表3、表4。

表3 試驗設計與結果Table 3 Results of response surface analysis

表4 方差分析Table 4 Variance analysis

由表4可知，二次項乙醇體積分數和微波時間對總黃酮得率的曲面效應顯著；比較各因子間交互作用，微波功率和微波時間之間的交互作用顯著，各因素交互作用的響應面立體分析圖見圖8～圖10。

在本試驗設計范圍內，回歸方程模型顯著性檢測P＜0.05，顯著，模型的相關系數0.033 8，失擬項不顯著，說明該模型能解釋響應值的變化，即該模型與實際試驗擬合較好。比較一次項的P值，可知各因素對總黃酮得率的影響從大到小依次為微波時間、微波功率、乙醇體積分數。

圖8 乙醇體積分數和微波功率對總黃酮得率的交互影響Fig.8 Response surface plot for effects of ethanol concentration and microwave power on the yield of total flavonoids

圖9 乙醇體積分數和微波時間對總黃酮得率的交互影響Fig.9 Response surface plot for effects of ethanol concentration and microwave duration on the yield of total flavonoids

圖10 微波功率和微波時間對總黃酮得率的交互影響Fig.10 Response surface plot for effects of microwave power and microwave duration on the yield of total flavonoids

根據回歸方程得出不同因子的響應面和等高線結果見圖8～圖10所示。3D響應面圖和二維等高線圖可以將回歸模型生動的表現出來。從圖中可以較明顯的分析出多個自變量對響應值的影響，而且還可以分析出響應面對不同自變量變化之間的敏感程度。響應面圖反映出了，保持其中一個自變量不變的前提下，另外兩個自變量對響應面值的影響。等高線圖和響應面圖相對應，響應曲面坡度越陡峭，等高線圖形接近橢圓形，表明響應值對于操作條件的改變越敏感；反之曲面坡度越平緩，等高線圖形接近圓形，表明操作條件的改變對響應值的影響也就越小[1]。圖8～圖10直觀地反映了各因素交互作用對響應值的影響。

圖8顯示了乙醇體積分數和微波功率的交互作用對總黃酮得率的影響。從圖8可以看出，等高線接近圓形，表明它們的交互作用不明顯。從等高線可以看出，但乙醇體積分數不變時，微波功率過高不利于總黃酮的提取，總黃酮得率也隨著微波功率的增加先增大后減少，但減少的幅度較小。

圖9顯示了乙醇體積分數和微波時間的交互作用對總黃酮得率的影響。從圖9可以看出，乙醇體積分數、微波時間對總黃酮得率的影響都比較明顯，因為曲面比較陡峭，而等高線接近圓形，表明它們的交互作用也是不明顯的。當微波時間較短時，總黃酮得率隨乙醇體積分數的提高先增大后趨于平緩；當微波時間較長時，總黃酮得率隨乙醇體積分數的提高先緩慢增大后減少。當乙醇體積分數較低時，總黃酮得率隨著微波時間的增加而增加；當乙醇體積分數較高時，總黃酮得率隨著微波時間的增加先增加后減少。

圖10顯示了微波功率和微波時間的交互作用對總黃酮得率的影響。從圖10可以看出，等高線為橢圓形，表明微波功率和微波時間的交互作用對總黃酮得率的影響明顯。當微波時間較短時，總黃酮得率隨微波功率的增加而增大；當微波時間較長時，總黃酮得率隨著微波功率的增加而減小。當微波功率較低時，總黃酮得率隨著微波時間的增加而增加；當微波功率較高時，總黃酮得率隨著微波時間的增加先增加后快速減少。

2.4.2 最佳提取條件的確定

通過響應面分析優化，Design expert軟件對回歸方程進行計算，得到微波輔助提取田艾總黃酮的最佳工藝條件為：乙醇體積分數為20.80%，微波功率為353.79 W，微波時間為67.30 s；在此條件下模型預測總黃酮提取率為23.67 mg/g。考慮到實際操作條件的局限性，對最佳工藝條件進行如下修正：乙醇濃度20%，微波功率為350 W，微波時間為67 s。

2.5 驗證試驗

通過響應面優化得出最佳提取工藝條件為乙醇濃度20%，微波功率為350 W，微波時間為67s；根據此條件進行了3次平行驗證試驗，結果田艾中總黃酮的平均提取率為23.60 mg/g。說明試驗結果與模型擬合良好，利用響應面分析法優化得到的超聲提取工藝參數較確可靠，具有一定的可行性。

3 結論

以干燥的田艾為原料，以乙醇為提取溶劑，采用微波輔助提取，在單因素試驗基礎上，利用響應面法優化了提取工藝條件，結果為：料液比1∶50（g/mL），預浸時間為30 min，乙醇體積分數20%，微波功率為350 W，微波時間為67 s，田艾中總黃酮的實際得率為23.60 mg/g。結果表明，田艾中含有豐富的黃酮類化合物，具有很好的食用價值和開發利用前景，為田艾的進一步開發利用提供了可靠依據。

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Optimization of Extraction Technology of Total Flavonoids from Tian Ai by Response Surface Methodology

ZHANG Ling1，2，LIANG Yan2，YE Ri-qing2，ZHANG Zhong1，2
（1.Technology Development Center for Fruit&Vegetable Processing and Storage Engineering of Guangdong Colleges and Universities，Guangdong University of Petrochemical Technology，Maoming 525000，Guangdong，China；2.College of Environmental and Biological Engineering，Guangdong University of Petrochemical Technology，Maoming 525000，Guangdong，China）

With Tian moxa as raw material，using microwave auxiliary ethanol method to extract the total flavonoids in Tian Ai.On the basis of single factor experiment，the ethanol concentration，microwave power and time was chose as the independent variable and the total flavonoids yield was used as response value，and the extraction process of total flavonoids in Tian Ai was optimized by response surface methodology of Box-Behnken mode.The results showed that the optimum extraction technology conditions were solid-liquid ratio for 1 ∶50（g/mL），presoak time for 30 min，ethanol concentration for 20%，microwave power was 350 W，microwave time of 67 s.Under the condition，the actual extraction yield of Tian Ai total flavonoids was 23.60 mg/g.

Tian Ai；total flavonoids；extract；response surface methodology

2016-07-27

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.14.008

廣東高校果蔬加工與貯藏工程技術開發中心開放基金（2015A004）

張玲（1979—），女（漢），副教授，碩士研究生，主要從事農產品加工與貯藏。