香菇多糖二段式超聲波輔助提取技術(shù)研究

黃超，王艷萍，張斌

（1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457；2.天士力控股集團(tuán)有限公司，天津300402；3.天津市食品研究所有限公司，天津301609）

香菇多糖二段式超聲波輔助提取技術(shù)研究

黃超1，2，王艷萍1，張斌3，*

（1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457；2.天士力控股集團(tuán)有限公司，天津300402；3.天津市食品研究所有限公司，天津301609）

以香菇為研究對象，研究二段式超聲波輔助提取工藝，通過正交試驗(yàn)與響應(yīng)面分析確定最佳工藝條件，即提取溫度90℃、提取液pH 5.0，料液比1∶30（g/mL），超聲功率400 W，前段超聲時間20 min，恒溫提取時間130 min，后段超聲時間23 min，在此條件下，多糖得率為7.240%。

香菇；多糖；超聲波；提取液

香菇（Lentinus edodes），又名冬菇、厚菇、香蕈等，是一種在我國及亞洲地區(qū)廣泛種植的食用菌，據(jù)記載在我國至今已有近2000年的食用歷史[1]。隨著世界貿(mào)易快速發(fā)展，香菇因其獨(dú)特的香氣，優(yōu)良的口感、豐富營養(yǎng)越來越被世界所接受。日本人將香菇稱為“植物領(lǐng)域里食品的最高端”，歐洲人甚至將香菇稱為“上帝食品”，是集美味與營養(yǎng)一體的健康食物。香菇的主要營養(yǎng)成分包括蛋白質(zhì)類、多糖類、亞油酸、多酚類、核苷酸類、甾醇類、礦物質(zhì)類、維生素類等化合物。其中含蛋白質(zhì)20%、多糖12.5%、多酚類物質(zhì)0.4%[2-3]。

香菇多糖是香菇中重要的活性物質(zhì)，也是國內(nèi)外學(xué)者對于香菇功能研究的熱點(diǎn)，香菇多糖以β-葡聚糖為基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)，分子式為（C6H10O5）n，分子量一般為10 000 Da至100萬Da不等，主要由甘露糖、木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖組成[4-7]。經(jīng)分離純化的香菇多糖是一種白色或棕黃色無味、無臭的粉末物質(zhì)，不具有還原性，在水中溶解，隨溫度上升溶解率上升，不溶于有機(jī)試劑[8-10]。超聲波輔助提取技術(shù)的強(qiáng)震蕩攪拌作用與空化作用，可加快胞內(nèi)糖類物質(zhì)溶出，獲得更佳的提取效果。

1 材料與方法

1.1 材料

干香菇：天津市紅旗農(nóng)貿(mào)市場。

1.2 試劑

檸檬酸、氫氧化鈉、無水葡萄糖、蒽酮、3，5-二硝基水楊酸（分析純）：天津贏達(dá)稀貴化學(xué)試劑廠；香菇多糖標(biāo)品（色譜純）：國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。

1.3 儀器與設(shè)備

食用菌粉碎機(jī)組、提取罐、超聲波發(fā)生器：天津勤德新材料有限公司；XSE150DU分析天平：瑞士梅特勒；全波長紫外分光光度計：天津市泰斯特儀器有限公司；Phs-3C PH計：上海理達(dá)儀器廠。

1.4 方法

1.4.1 二段式超聲波輔助水提工藝研究

1.4.1.1 前段超聲時間對多糖得率的影響

準(zhǔn)確稱取5 g香菇粉數(shù)份，分別按料液比1∶30（g/mL）加入蒸餾水，調(diào)節(jié)pH值至5.0后，置于超聲提取設(shè)備中，提取溫度90℃，超聲功率400 W，前段超聲時間分別為 5、10、15、20、25、30 min，取出后置于恒溫水浴鍋中，90℃條件下恒溫提取60 min，然后置于超聲提取設(shè)備中，與前超聲相同條件下提取10 min，取出冷卻，測定多糖含量、計算提取率，并以多糖提取得率的高低判定提取效率。

1.4.1.2 恒溫時間對多糖得率的影響

準(zhǔn)確稱取5 g香菇粉數(shù)份，分別按料液比1∶30（g/mL）加入蒸餾水，調(diào)節(jié)pH值至5.0后，置于超聲提取設(shè)備中，提取溫度90℃，超聲功率400 W，前段超聲時間10 min，取出后置于恒溫水浴鍋中，90℃條件下分別恒溫提取 20、40、60、80、100、120、140、160、180、200 min，然后置于超聲提取設(shè)備中，與前超聲相同條件下提取10 min，取出冷卻，測定多糖含量、計算提取率，并以多糖提取得率的高低判定提取效率。

1.4.1.3 后段超聲時間對多糖得率的影響

準(zhǔn)確稱取5 g香菇粉數(shù)份，分別按料液比1∶30（g/mL）加入蒸餾水，調(diào)節(jié)pH值至5.0后，置于超聲提取設(shè)備中，提取溫度90℃，超聲功率400 W，前段超聲時間10 min，取出后置于恒溫水浴鍋中，90℃條件下恒溫提取60 min，然后置于超聲提取設(shè)備中，與前超聲相同條件下分別提取 5、10、15、20、25、30 min，取出冷卻，測定多糖含量、計算提取率，并以多糖提取得率的高低判定提取效率。

1.4.2 二段式超聲輔助香菇多糖提取的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計

選取前段超聲時間、恒溫提取時間、后段超聲時間3個變量，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

1.4.3 回歸模型驗(yàn)證和對比試驗(yàn)

按照Design Expert 8.0給出的最優(yōu)參數(shù)進(jìn)行試驗(yàn)，重復(fù)3次。對總超聲提取時間和恒溫提取時間進(jìn)行合理組合，并結(jié)合最優(yōu)參數(shù)結(jié)果設(shè)置3組對照試驗(yàn)：①先進(jìn)行超聲提取，再進(jìn)行恒溫提取，提取時間依據(jù)最優(yōu)參數(shù)。②先進(jìn)行恒溫提取，再進(jìn)行超聲提取，提取時間依據(jù)最優(yōu)參數(shù)。③無超聲波輔助，只進(jìn)行恒溫提取，提取時間依據(jù)最優(yōu)參數(shù)。

1.4.4 多糖含量檢測方法

按照NY/T1676-2008《食用菌中粗多糖含量的測定》所述方法進(jìn)行多糖含量測定。

多糖提取得率/%=提取液中多糖總質(zhì)量（g）/樣品質(zhì)量（g）×100

2 結(jié)果與分析

2.1 前段超聲時間對多糖得率的影響

準(zhǔn)確稱取5 g香菇粉數(shù)份，分別按料液比1∶30（g/mL）加入蒸餾水，調(diào)節(jié)pH至5.0后，置于超聲提取設(shè)備中，提取溫度90℃，超聲功率400 W，前段超聲時間分別為 5、10、15、20、25、30 min，取出后置于恒溫水浴鍋中，90℃條件下恒溫提取60 min，然后置于超聲提取設(shè)備中，與前超聲相同條件下提取10 min，取出冷卻，測定多糖含量，計算提取率，結(jié)果見圖1。

圖1 不同前段超聲時間對多糖得率的影響Fig.1 Effects of different front ultrasonic time on the yield of polysaccharides

由圖1可見，不同前段超聲時間對多糖得率的影響，在恒溫提取和后超聲處理相同條件下，隨著前段超聲時間的延長，多糖得率呈先上升后緩慢下降并逐漸平穩(wěn)的趨勢，當(dāng)前段超聲時間為20 min時，多糖得率最高。因此，初步選擇最佳前段超聲時間為20 min。

2.2 恒溫提取時間對多糖得率的影響

準(zhǔn)確稱取5 g香菇粉數(shù)份，分別按料液比1∶30（g/mL）加入蒸餾水，調(diào)節(jié)pH至5.0后，置于超聲提取設(shè)備中，提取溫度90℃，超聲功率400 W，前段超聲時間10 min，取出后置于恒溫水浴鍋中，90℃條件下分別恒溫提取 60、80、100、120、140、160、180、200 min，然后置于超聲提取設(shè)備中，與前超聲相同條件下提取10 min，取出冷卻，測定多糖含量，計算提取率，結(jié)果見圖2。

如圖2可見，不同恒溫提取時間對多糖得率在40 min之后影響不大，在前超聲和后超聲處理相同條件下，在0～120 min內(nèi)，隨著恒溫提取時間的延長，多糖提取得率逐漸升高，120 min后逐漸趨于平穩(wěn)，并略有下降。這主要是由于長時間的高溫處理，使某些多糖結(jié)構(gòu)遭到破壞。因此，初步確定最佳恒溫提取時間為120 min。

圖2 不同恒溫提取時間對多糖得率的影響Fig.2 Effects of different thermostat extraction time on the yield of polysaccharides

2.3 后段超聲時間對多糖得率的影響

準(zhǔn)確稱取5 g香菇粉數(shù)份，分別按料液比1∶30（g/mL）加入蒸餾水，調(diào)節(jié)pH至5.0后，置于超聲提取設(shè)備中，提取溫度90℃，超聲功率400 W，前段超聲時間10 min，取出后置于恒溫水浴鍋中，90℃條件下恒溫提取60 min，然后置于超聲提取設(shè)備中，與前超聲相同條件下分別提取 5、10、15、20、25、30 min，取出冷卻，測定多糖含量，計算提取率，結(jié)果見圖3。

圖3 不同后段超聲時間對多糖得率的影響Fig.3 Effects of different after ultrasonic time on the yield of polysaccharides

由圖3可知，在前超聲和恒溫提取處理相同條件下，隨著后段超聲時間的延長，多糖得率呈先上升后緩慢下降的趨勢，當(dāng)后段超聲時間為20 min時，多糖得率最高。因此，初步選擇最佳后段超聲時間為20min。

2.4 Box-Behnken響應(yīng)曲面試驗(yàn)

2.4.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果

因素水平表見表1，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果見表2。

表1 因素水平表Table 1 Factor levels table

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果Table 2 Response surface and results

2.4.2 擬合模型的建立

對數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，獲得二元多次回歸方程：

2.4.3 擬合方程方差分析

對模型的方差分析結(jié)果見表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

分析結(jié)果表明，對香菇多糖得率所建立的二次多項(xiàng)式模型具有高度顯著性（P＜0.000 3），方程負(fù)相關(guān)系數(shù)的平方（R2）為 0.964 0，失擬項(xiàng)不顯著（P=0.580 0），R2Adj=0.917 7，說明建立的模型能夠解釋91.77%響應(yīng)值的變化，能很好的描述間歇式超聲輔助香菇多糖提取過程中多糖得率隨提取條件的變化規(guī)律，可以用此模型對多糖得率進(jìn)行分析和預(yù)測。

由表3可知，間歇式超聲輔助提取香菇多糖的工藝參數(shù)中，影響多糖得率的因素按主次順序排列為后段超聲時間＞恒溫提取時間＞前段超聲時間。在所選各因素水平范圍內(nèi)，A、B、C、AB、A2、B2、C2對 Y 的影響顯著。由此可見，試驗(yàn)因素對響應(yīng)值的影響不呈簡單的線性關(guān)系，交互項(xiàng)和二次項(xiàng)對響應(yīng)值也有較大的影響作用。

前段超聲時間與恒溫提取時間的響應(yīng)面圖見圖4。

圖4 前段超聲時間與恒溫提取時間的響應(yīng)面圖Fig.4 The response surface plot of front ultrasonic extraction time and thermostat extraction time

圖4顯示后段超聲時間最佳值為22.44 min時，前段超聲時間與恒溫提取時間對多糖得率的影響。當(dāng)把恒溫提取時間固定在120 min，隨前段超聲時間的增加，在試驗(yàn)范圍內(nèi)多糖得率先增加后減少，在20 min～25 min附近達(dá)到峰值。當(dāng)把前段超聲時間固定在20 min，隨恒溫提取時間的升高在試驗(yàn)范圍內(nèi)多糖得率持續(xù)增加，在120 min～140 min附近達(dá)到峰值。

前段超聲時間與后段超聲時間的響應(yīng)面圖見圖5。

圖5 前段超聲時間與后段超聲時間的響應(yīng)面圖Fig.5 The response surface plot of front ultrasonic extraction time and after ultrasonic extraction time

圖5顯示恒溫提取時間最佳值為128.92 min時，前段超聲時間與后段超聲時間對多糖得率的影響。當(dāng)把前段超聲時間固定在20 min，隨前段超聲時間的增加，在試驗(yàn)范圍內(nèi)多糖得率先增加后減少，在20 min～25 min附近達(dá)到峰值。當(dāng)把后段超聲時間固定在23 min，隨恒溫提取時間的升高在試驗(yàn)范圍內(nèi)多糖得率先升高后降低，在20 min～25 min附近達(dá)到峰值。

恒溫提取時間與后段超聲時間的響應(yīng)面圖見圖6。

圖6 恒溫提取時間與后段超聲時間的響應(yīng)面圖Fig.6 The response surface plot of thermostat extraction time and after ultrasonic extraction time

圖6顯示前段超聲時間最佳值為20.44 min時，恒溫提取時間與后段超聲時間對多糖得率的影響。當(dāng)把恒溫提取時間固定在120 min，隨后聲時間的增加，在試驗(yàn)范圍內(nèi)多糖得率先增加后減少，在20 min～25 min附近達(dá)到峰值。當(dāng)把后段超聲時間固定在20 min，隨恒溫提取時間的升高在試驗(yàn)范圍內(nèi)多糖得率持續(xù)增加，在120 min～140 min附近達(dá)到峰值。

2.4.4 驗(yàn)證與對比試驗(yàn)

通過Design Expert 8.0.6分析得到間歇式超聲輔助香菇根多糖最佳提取條件為前段超聲時間20.44 min、恒溫提取時間128.92 min、后段超聲時間22.44 min，在此條件下多糖得率的預(yù)測值為7.262%。為檢驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，根據(jù)最優(yōu)條件進(jìn)了驗(yàn)證試驗(yàn)，為方便實(shí)際操作，選取前段超聲時間20 min、恒溫提取時間130 min、后段超聲時間23 min，在此條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，實(shí)際測得多糖得率為7.240%，與模型預(yù)測值基本一致，充分說明了該模型能夠較好地模擬和預(yù)測香菇根多糖的間歇式超聲輔助提取條件與多糖得率之間的關(guān)系，同時也說明了間歇式超聲輔助工藝參數(shù)的可行性。

表4為不同超聲輔提方式對多糖得率的影響。

由表4可知，在超聲時間和恒溫提取時間相同條件下，間歇式超聲輔提多糖得率比“超聲輔提+恒溫提取”和“恒溫提取+超聲輔提”分別提高6.3%和5.6%，

表4 不同提取方式對多糖得率的影響Table 4 Effect of different extraction methods on polysaccharide yield

3 結(jié)論

采用二段式超聲輔助提取香菇多糖，通過單因素試驗(yàn)和Box-Benhnken的中心組合設(shè)計響應(yīng)面試驗(yàn)，得到影響香菇多糖得率的工藝因素按主次順序排列為后段超聲時間（C）＞恒溫提取時間（B）＞前段超聲時間（A）。最終確定在工藝條件為提取溫度90℃、提取液 pH 5.0，料液比 1 ∶30（g/mL），超聲功率 400 W 條件下，最佳提取前段超聲時間20 min，恒溫提取時間130 min，后段超聲時間23 min，在此最佳條件下，多糖得率為7.240%。在超聲時間和恒溫提取時間相同條件下，比“前超聲輔提+恒溫提取”方式和“恒溫提取+后超聲輔提”方式分別提高6.3%和5.6%，比直接恒溫水浴提取提高12.76%。

[1]卯曉嵐.中國蕈菌[M].北京：科學(xué)出版社,2009：38

[2]Rao JR,Millar BC,Moore JE.Antimicrobial properties of Shiitake mushroom(Lentinus edodes)[J].International Journal of Antimicrobial Agents,2009,33：591-592

[3]董曉宇,寧安紅,曹婧,等.香菇及其藥理作用研究進(jìn)展[J].大連大學(xué)學(xué)報,2005,26(2)：63-68

[4]汲晨鋒,季宇彬.高效毛細(xì)管電泳法測定香菇多糖中單糖的組成[J].化學(xué)與粘合,2006,28(4)：276-278

[5]Tomati U,Belardinelli M,Galli E,et al.NMR characterization of the polysaccharidic fraction from Lentinula edodes grown on olivemill waste waters[J].Carbohydr Res,2004,339(6)：1129-1134

[6]王國佳,曹紅.香菇多糖的研究進(jìn)展[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報,2011(5)：451-455

[7]Zhou X,Dong L,Li R,et al.Low temperature conditioning prevents loss of aroma-relatedesters from‘Nanguo’pears during ripening at room temperature[J].Postharvest Biologyand Technology,2015,100：23-32

[8]奚灝鏘,袁根良,杜冰,等.超高壓提取香菇多糖的研究[J].現(xiàn)代食品科技,2010(9)：991-993

[9]張楷正,楊躍寰,李光輝,等.香菇多糖提取方法研究進(jìn)展[J].四川理工學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版),2009(6)：63-66

[10]金迪,梁英,孫工兵,等.植物多糖提取技術(shù)的研究進(jìn)展[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報,2011(5)：76-79

Lentinan 2-phase Ultrasonic Assisted Extraction Technology Research

HUANG Chao1，2，WANG Yan-ping1，ZHANG Bin3，*
（1.College of Food Engineering&Biotechnology，Tianjin University of Science&Technology，Tianjin 300457，China；2.Tasly Holding Group，Tianjin 300402，China；3.Tianjin Food Research Institute Co.，Ltd.，Tianjin 301609，China）

This research took Lentinus edodes as the research object studied the 2-phase ultrasonic assisted extraction technology，through the orthogonal experiment and response surface analysis to determine the optimum process conditions，the extraction temperature 90℃，pH 5.0，solid-liquid ratio 1∶30（g/mL），ultrasonic power 400 W，the front ultrasonic time 20 min，constant temperature time 130 min，after ultrasonic time 23 min，in this condition，polysaccharide rate was 7.240%.

Lentinus edodes；polysaccharide；ultrasound；extract

2016-12-06

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.14.011

黃超（1984—），男（漢），工程師，本科，研究方向：食品工程。

*通信作者：張斌（1984—），男（漢），工程師，碩士，研究方向：保健、功能食品加工技術(shù)。