鮮地黃花不同部位環(huán)烯醚萜苷類成分含量測定

于文娜，張振凌，李柯柯，劉艷，王勝超，趙丹

（河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南鄭州450003）

鮮地黃花不同部位環(huán)烯醚萜苷類成分含量測定

于文娜，張振凌*，李柯柯，劉艷，王勝超，趙丹

（河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南鄭州450003）

比較鮮地黃花不同部位梓醇，毛蕊花糖苷，地黃苷D及益母草苷含量，為地黃花的藥用及食用提供一定參考。采用 HPLC法測定，Waters-Symmetry ShieldTMRP18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），梓醇：流動相乙腈-水（1∶99），流速1 mL/min，檢測波長210 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣10 μL。毛蕊花糖苷：流動相乙腈-0.1%醋酸溶液（18∶82），流速1 mL/min，檢測波長 334 nm，柱溫 30 ℃，進(jìn)樣 20 μL。地黃苷 D、益母草苷：SunFireTMC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，乙腈-水（3∶97）為流動相；流速 1 mL/min；柱溫 30℃；檢測波長 203 nm；進(jìn)樣 20 μL。梓醇含量：花瓣>花梗>花托，最高為9.52%；毛蕊花糖苷含量：花瓣>花托>花梗，最高為0.53%；地黃苷D含量：花瓣>花梗>花托，最高為0.09%；益母草苷含量：花托>花梗>花瓣，最高為0.19%。地黃花中不同部位其有效成分含量存在顯著差異。

地黃花；不同部位；梓醇；毛蕊花糖苷；地黃苷D；益母草苷

地黃花為玄參科植物地黃的花蕾，其功效與作用為治消渴，腎虛腰痛[1]?！侗静輬D經(jīng)》記載：“為末服食，功同地黃。”《綱目》曰：“治腎虛，腰脊痛，為末酒服方寸匕，日三。”且《圣濟(jì)總錄》中有地黃花粥的記載。近年來，地黃花也被用于藥膳偏方之中，如地黃花粥可治療消渴癥等。環(huán)烯醚萜苷類化合物梓醇和苯乙醇苷類化合物毛蕊花糖苷是地黃藥材質(zhì)量評價的指標(biāo)性成分。且現(xiàn)代藥理研究表明梓醇具有神經(jīng)保護(hù)、降血糖、利尿、緩瀉、抗癌、抗炎等作用[2]；毛蕊花糖苷具有雄性激素樣作用[3]，以及抗氧化、抗腫瘤、增強(qiáng)心血管活性等作用[4]；地黃苷等環(huán)烯醚萜苷成分研究較多，具有明顯的補(bǔ)血作用，尤其對骨髓造血功能具有促進(jìn)作用[5]。因此本試驗(yàn)通過HPLC法測定地黃花不同部位梓醇，毛蕊花糖苷，地黃苷D及益母草苷含量，并進(jìn)行比較分析，以期為地黃花的藥用及食用提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

FW-200型高速萬能粉碎機(jī)：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；e2695型高效液相色譜儀：美國Waters公司。

1.2 材料與試劑

鮮地黃花采自河南省溫縣宛西地黃種植基地，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)科董誠明教授鑒定為玄參科植物地黃（Rehmannia glutinosa Libosch）的新鮮花蕾（冷凍干燥品）；梓醇標(biāo)準(zhǔn)品（生產(chǎn)批號110808-201210）、毛蕊花糖苷標(biāo)準(zhǔn)品（生產(chǎn)批號111530-201411）：中國食品藥品檢定研究院；地黃苷D標(biāo)準(zhǔn)品（生產(chǎn)批號Y19J6F1）、益母草苷標(biāo)準(zhǔn)品（生產(chǎn)批號L10A6Y2298）：上海源葉生物科技有限公司；乙腈為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

2.1.1 梓醇色譜條件

Waters-Symmetry ShieldTMRP18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以乙腈-水（1 ∶99）為流動相，流速1 mL/min，檢測波長210 nm，柱溫30℃。進(jìn)樣量10 μL，色譜圖見圖1。

圖1 鮮地黃花HPLCFig.1 HPLC of fresh rehmanniae flowers

2.1.2 毛蕊花糖苷色譜條件

Waters-Symmetry ShieldTMRP18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以乙腈-0.1%醋酸溶液（18∶82）為流動相，流速1 mL/min，檢測波長334 nm，柱溫30℃。進(jìn)樣量20 μL，色譜圖見圖2。

圖2Fig.2 HPLC of fresh rehmanniae flowers

2.1.3 地黃苷D、益母草苷色譜條件

SunFireTMC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，乙腈-水（3∶97）為流動相；流速 1 mL/min；柱溫 30℃；檢測波長203 nm；進(jìn)樣量：20 μL，色譜圖見圖3。

圖3 鮮地黃花HPLCFig.3 HPLC of fresh rehmanniae flowers

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取適量梓醇及毛蕊花糖苷對照品于5 mL和10 mL容量瓶中，地黃苷D及益母草苷標(biāo)準(zhǔn)品于2 mL容量瓶中，用流動相溶解并定容至刻度，搖勻，即得0.93 mg/mL的梓醇對照品溶液，1.01 mg/mL的毛蕊花糖苷對照品溶液，0.29 mg/mL的地黃苷D對照品溶液及0.39 mg/mL的益母草苷對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 梓醇及毛蕊花糖苷供試品溶液制備

分別取地黃花瓣，花托及花梗0.8 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流提取1.5 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過濾，精密量取續(xù)濾液（梓醇10 mL，毛蕊花糖苷20 mL）于蒸發(fā)皿中，60℃水浴濃縮至近干，殘?jiān)昧鲃酉嗳芙獠⒍ㄈ葜?0 mL（梓醇）和5 mL（毛蕊花糖苷）容量瓶中，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過濾，備用。

2.3.2 地黃苷D及益母草苷供試品溶液制備

分別取地黃花瓣，花托，花梗約1.0 g，精密稱定，置于150 mL具塞錐形瓶中，精密加入60%甲醇水溶液100 mL，輕輕振搖使其與溶劑充分接觸并混勻，稱定重量，超聲輔助提?。?0 kz，500 W）40 min，取出冷卻至室溫，稱定重量，以提取溶劑補(bǔ)足失重，過濾，棄去初濾液，精密量取20 mL續(xù)濾液于蒸發(fā)皿中，60℃水浴濃縮至近干，以流動相溶解并定容至5 mL容量瓶中，0.22 μm微孔濾膜過濾，備用。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取梓醇，毛蕊花糖苷對照品溶液1、5、10、15、20 μL，地黃苷 D 及益母草苷對照品溶液 1、3、5、7、9 μL，按 2.1 項(xiàng)下色譜條件測定，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，得線性回歸方程分別為Y=260 336X-39 493（R2=0.999 8），Y=2×106X-690 748（R2=0.999 9），Y=513 027X-46 894（R2=1.000），Y=542 565X-71 693（R2=1.000），線性范圍依次為 0.93 μg～18.6 μg、1.01 μg～20.2 μg、0.29 μg～2.61 μg、0.39 μg～3.51 μg。

2.5 精密度試驗(yàn)

取地黃花瓣供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件，計(jì)算梓醇，毛蕊花糖苷，地黃苷D及益母草苷峰面積積分值的RSD分別為0.91%、0.52%、1.47%、1.88%。說明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取地黃花瓣樣品，按2.3項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測定，結(jié)果梓醇，毛蕊花糖苷，地黃苷D及益母草苷峰面積積分值的RSD分別為0.58%、1.72%、0.34%、0.27%。說明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取地黃花瓣供試品溶液，分別在 0、2、4、8、12、24 h按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果梓醇，毛蕊花糖苷，地黃苷D及益母草苷峰面積積分值的RSD分別為1.15%、0.47%、0.46%、0.30%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取地黃花托6份，每份0.4 g，分別精密加入梓醇（4.01 mg/mL）5 mL，毛蕊花糖苷（1.47 mg/mL）對照品溶液1 mL，以2.3.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液；取地黃花托6份，每份0.5 g，分別精密加入地黃苷D（0.26 mg/mL）1 mL，益母草苷（0.97 mg/mL）1 mL對照品溶液，以2.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣測定，結(jié)果梓醇，毛蕊花糖苷，地黃苷D及益母草苷回收率RSD值分別為1.28%、1.23%、0.80%、0.93%，說明回收率良好，該方法準(zhǔn)確可靠。梓醇及毛蕊花糖苷具體結(jié)果見表1。

表1 梓醇及毛蕊花糖苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Recovery tests of catalpol，verbascoside in fresh of rehmanniae flowers

2.9 樣品測定

取地黃花瓣，花托，花梗樣品，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行3份，根據(jù)水分測定結(jié)果換算為干燥品計(jì)算地黃花不同部位中梓醇，毛蕊花糖苷，地黃苷D及益母草苷的含量，取平均值，結(jié)果見表2。

表2 地黃花不同部位梓醇，毛蕊花糖苷，地黃苷D及益母草苷含量測定Table 2 Contents of catalpol，verbascoside ，rehmaionoside D and leonuride in rehmanniae flowers

結(jié)果表明梓醇，毛蕊花糖苷及地黃苷D以地黃花瓣中含量最高，益母草苷在地黃花托中含量為最高。

3 討論

本試驗(yàn)在藥典法的基礎(chǔ)上，對地黃花不同部位梓醇及毛蕊花糖苷進(jìn)行含量測定，對梓醇含量測定流動相進(jìn)行調(diào)整，最終采用乙腈-水（1∶99）；同時調(diào)整毛蕊花糖苷含量測定流動相比例為乙腈-0.1%醋酸（18∶82）。在相關(guān)研究文獻(xiàn)[6-7]的基礎(chǔ)上，采用HPLC法同時測定地黃花中地黃苷D及益母草苷3種有效成分含量，并適當(dāng)調(diào)整流動相比例，最終確立采用乙腈-水（3 ∶97）。

本研究采用的新鮮地黃花樣品，因其不易保存，故均通過本試驗(yàn)室冷凍干燥設(shè)備自制成地黃花冷凍干燥品，以備試驗(yàn)使用。由試驗(yàn)結(jié)果可知，地黃花不同部位梓醇等有效成分含量雖存在很大差異，但其含量均較高。其中梓醇，毛蕊花糖苷及地黃苷D含量在地黃花瓣中為最高，分別為9.52%、0.53%、0.09%，益母草苷含量則在地黃花托中為最高，0.19%。這不僅說明在以地黃花為材料的藥膳偏方對于相關(guān)疾病的輔助治療方面有一定現(xiàn)實(shí)應(yīng)用價值，而且也為地黃花的使用提供理論和科學(xué)依據(jù)。且梓醇，毛蕊花糖苷等是地黃中的主要有效成分，通過比較地黃花不同部位（花瓣，花托及花梗）有效成分含量，發(fā)現(xiàn)均超過相關(guān)文獻(xiàn)[8-9]鮮地黃中梓醇等有效成分含量，可考慮將地黃花入藥或者作為提取物的制備原料，為地黃擴(kuò)大藥源及食品相關(guān)領(lǐng)域提供參考。

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Determination of the Content of Iridoid Glycosidein from Different Parts of the Fresh Rehmanniae Flowers

YU Wen-na，ZHANG Zhen-ling*，LI Ke-ke，LIU Yan，WANG Sheng-chao，ZHAO Dan
（Henan University of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450003，Henan，China）

Compared the contents of catalpol，verbascoside ，rehmaionoside D and leonuride in rehmanniae flowers，for the flower's medicinal and edible aspects provide certain reference.Contents of catalpol，verbascoside ，rehmaionoside D and leonuride were determined by HPLC，Waters-Symmetry ShieldTMRP18 column（4.6 mm × 250 mm，5 μm），catalpol：a mobile phase of acetonitrile-water （1 ∶99）was used，flow rate was 1 mL/min，column temperature was set at 30 ℃ ，a UV detector was applied with wavelength of 210 nm，sample volume10μL.Verbascoside：a mobile phase of acetonitrile-0.1%acetic acid solution （18 ∶82）as mobile phase，flow rate was 1 mL/min，column temperature was set at 30 ℃ ，a UV detector was applied with wavelength of 334 nm，sample volume 20 μL.Rehmaionoside D and leonuride：SunFireTMC18 column（4.6 mm × 250 mm，5 μm），a mobile phase of acetonitrile-water （3 ∶97）was used，flow rate was 1 mL/min，column temperature was set at 30 ℃ ，a UV detector was applied with wavelength of 203 nm，sample volume 20 μL.The content of catalpol content：petals>pedicel>receptacle，as high as 9.52%；verbascoside content：petals>receptacle>peduncle，up to 0.53%；rehmaionoside D levels：petals>pedicel>receptacle，as high as 0.09%；leonuride content：receptacle>pedicel>petals，as high as 0.19%.There are significant differences among different parts of the active ingredient content of rehmanniae flowers.

fresh rehmannine flowers；different parts；catalpol；verbascoside；rehmaionoside D；leonuride

2016-10-24

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.14.028

公益性科研專項(xiàng)項(xiàng)目（201507002）；科研創(chuàng)新基金項(xiàng)目（教科計(jì)[2013]638號）

于文娜（1990—），女（漢），在讀研究生，研究方向：中藥飲片及新藥研究。

*通信作者：張振凌，從事中藥飲片及新藥研究。