黃曲霉毒素免疫親和柱性能評(píng)價(jià)方法及應(yīng)用

徐文遠(yuǎn)，倪新，崔淑華，朱萬(wàn)燕

（1.臨沂出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東臨沂276034；2.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局食品農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)中心，山東青島266002）

黃曲霉毒素免疫親和柱性能評(píng)價(jià)方法及應(yīng)用

徐文遠(yuǎn)1，倪新1，崔淑華2，朱萬(wàn)燕1

（1.臨沂出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東臨沂276034；2.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局食品農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)中心，山東青島266002）

探索建立一種簡(jiǎn)便可靠的黃曲霉毒素免疫親和柱性能評(píng)價(jià)方法并利用該方法對(duì)國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上5個(gè)主流品牌產(chǎn)品進(jìn)行對(duì)比評(píng)價(jià)。依據(jù)評(píng)價(jià)結(jié)果進(jìn)行產(chǎn)品采購(gòu)使用，經(jīng)3年多實(shí)用經(jīng)驗(yàn)證明了方法的可靠性。該性能評(píng)價(jià)方法不僅能夠從確保檢測(cè)質(zhì)量和降低檢測(cè)成本兩方面指導(dǎo)親和柱的采購(gòu)還能夠協(xié)助倒逼生產(chǎn)商不斷提升產(chǎn)品質(zhì)量。

黃曲霉毒素；免疫親和柱；性能評(píng)價(jià)；對(duì)比評(píng)價(jià)

黃曲霉毒素（aflatoxins，AFT）是一類結(jié)構(gòu)和理化性 質(zhì)相似的真菌次級(jí)代謝物，具有強(qiáng)致癌性和免疫抑制性[1-3]。該類毒素廣泛存在于花生及其制品、玉米及其制品、乳與乳制品、動(dòng)物飼料、棉花籽、杏仁、開(kāi)心果等食品中，黃曲霉毒素不僅直接對(duì)人體及動(dòng)物造成毒害，還可以通過(guò)食物鏈從動(dòng)物體轉(zhuǎn)內(nèi)移到人體內(nèi)造成二次危害[4-5]。從環(huán)節(jié)上控制黃曲霉毒素污染有一定的難度，從源頭上消除目前技術(shù)尚未成熟，提高檢測(cè)技術(shù)水平加強(qiáng)對(duì)該類產(chǎn)品的監(jiān)測(cè)監(jiān)管是當(dāng)務(wù)之急。

黃曲霉毒素的檢測(cè)方法有多種，主要有薄層層析法、快速微柱法、酶聯(lián)免疫法、電化學(xué)免疫傳感器法、高效液相色譜法和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等。薄層層析法靈敏度、精密度和重現(xiàn)性較差，微柱法定量差，酶聯(lián)免疫法假陽(yáng)性率較高[6]。免疫親和凈化液相色譜法及液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法是當(dāng)前黃曲霉毒素的主要檢測(cè)方法，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法無(wú)論在定性還是定量上均具有其他方法無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)，但其高昂的儀器價(jià)格限制了其廣泛應(yīng)用。

免疫親和柱凈化-高效液相色譜法（IAC-HPLC）是當(dāng)前最為簡(jiǎn)潔、準(zhǔn)確、快速和常用的黃曲霉檢測(cè)方法[7]。免疫親和柱是該類檢測(cè)方法的主要耗材，其性能的好壞和成本的高低直接關(guān)系到檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和檢測(cè)成本。免疫親和柱性能評(píng)價(jià)方法對(duì)于篩選出性能優(yōu)越的親和柱，提高檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性具有重要意義。為此我們根據(jù)黃曲霉毒素檢測(cè)用免疫親和柱產(chǎn)品特點(diǎn)探索建立了一種快速簡(jiǎn)潔的性能評(píng)價(jià)方法。基于自行建立的方法對(duì)目前市場(chǎng)上國(guó)內(nèi)外5個(gè)主流品牌產(chǎn)品性能進(jìn)行了對(duì)比評(píng)價(jià)活動(dòng)。性能評(píng)價(jià)方法主要從添加回收率、批內(nèi)差、批間差、準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性和柱容量等產(chǎn)品關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 免疫親和柱對(duì)比驗(yàn)證方案

1.1 樣品篩選

依據(jù)GB/T 18979-2003《食品中黃曲霉毒素的測(cè)定免疫親和層析凈化高效液相色譜法和熒光光度法》（液相色譜法）對(duì)多批次花生樣品進(jìn)行檢測(cè)，篩選出陰、陽(yáng)性樣品。

1.2 添加回收試驗(yàn)

在陰性樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)品至濃度分別為2、5、10 μg/kg，按 GB/T 18979-2003（液相色譜法）檢測(cè)，樣品前處理參考各個(gè)廠家親和柱說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。檢測(cè)各個(gè)濃度下B1、B2、G1、G2各個(gè)組分含量并計(jì)算回收率。

回收率/%=洗脫量/上樣量×100。

檢測(cè)數(shù)量：?jiǎn)我慌斡H和柱檢測(cè)數(shù)量隨機(jī)抽取不低于18支。

批內(nèi)差、批間差檢測(cè)。變異系數(shù)=方差/均值×100。評(píng)價(jià)不少于2批產(chǎn)品，批次間隔不少于2個(gè)月，每批至少18根。

1.3 準(zhǔn)確度

采樣標(biāo)準(zhǔn)樣品，按GB/T 18979-2003（液相色譜法）方法進(jìn)行操作。

準(zhǔn)確度/%=檢測(cè)量/實(shí)際量×100，采取雙平行試驗(yàn)方法。

1.4 穩(wěn)定性

將產(chǎn)品放置于冷藏柜內(nèi)（控溫4℃），每2周隨機(jī)抽取3支進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，根據(jù)回收率對(duì)產(chǎn)品穩(wěn)定性進(jìn)行考評(píng)。

1.5 柱容量

一次添加超量的AFT標(biāo)準(zhǔn)品、采用高濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品或天然陽(yáng)性樣品，測(cè)定回收率。

2 試驗(yàn)部分

2.1 主要儀器

Agilent 1200液相色譜儀、G1321A熒光檢測(cè)器：安捷倫科技有限公司；AURA 230V 8W柱后光化學(xué)衍生器：美國(guó)AURA公司；德國(guó)斯蒂芬UM44A粉碎機(jī)：德國(guó)斯蒂芬公司；WARINGCOMMERCIAL8010S均質(zhì)器：美國(guó)WARING公司；IKA T25分散機(jī)：德國(guó)IKA公司。

2.2 材料與試劑

花生仁：國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品安全檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（臨沂）日常檢測(cè)樣品；黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品：純度>99%，Sigma公司；乙腈、甲醇（色譜純）：美國(guó)天地公司；氯化鈉（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；提取用水為蒸餾水；液相流動(dòng)相用水為milli-Q凈化超純水；折疊濾紙、纖維濾紙、玻璃注射器、塑料漏斗和塑料燒杯：中檢維康技術(shù)有限公司。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)品的配制

分別取1 mL濃度為3 μg/mL溶于體積比為2∶98的苯與乙腈的黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2標(biāo)準(zhǔn)品于10mL的棕色容量瓶中用甲醇定容，得到濃度為0.3 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。4種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液等體積（各取1 mL）混合得標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2.4 樣品的提取和凈化

稱取經(jīng)粉碎后的花生仁試驗(yàn)樣品25.0 g，加5.0 g氯化鈉，添加相應(yīng)體積濃度為0.3 μg/mL的B1、B2、G1、G2標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，放置2 h左右，用體積比70∶30的甲醇與水提取液定容至125 mL，均質(zhì)提取2 min，用折疊濾紙過(guò)濾，移取15 mL濾液加30 mL水稀釋，用纖維濾紙過(guò)濾后，準(zhǔn)確移取15 mL上述濾液，注入玻璃注射器中，以自然流速通過(guò)免疫親和柱，流完后吹入空氣進(jìn)入親和柱中，然后用10 mL蒸餾水淋洗免疫親和柱兩次，棄去全部流出液，吹干小柱，在小柱加入1 mL甲醇洗脫，收集全部洗脫液于樣品瓶中供HPLC測(cè)定。

2.5 液相色譜條件

色譜柱：Agilent C18柱（ZORBAX SB-C18 5 μm，250 mm ×4.6 mm）；流速：1.00 mL/min；溫度：30℃；進(jìn)樣體積：10 μL；流動(dòng)相：甲醇 ∶水=45 ∶55（體積比）；檢測(cè)器：熒光檢測(cè)器，波長(zhǎng) λEx=360 nm，λEm=440 nm。

3 結(jié)果與討論

3.1 方法的選擇

免疫親和柱凈化高效液相色譜法檢測(cè)花生中黃曲霉毒素，前處理過(guò)程對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確性影響較大。提取液的配比和洗滌及淋洗速率是影響檢測(cè)準(zhǔn)確性的關(guān)鍵因素。該對(duì)比評(píng)價(jià)試驗(yàn)所采用的提取液甲醇和水的配比為70∶30（體積比）。對(duì)于淋洗速率，GB/T 18979-2003（液相色譜法）方法指出為6 mL/min。實(shí)際批量檢測(cè)操作時(shí)用氣泵加壓，因不同品牌產(chǎn)品填裝工藝差異不易控制每個(gè)柱子流速在同一水平。基于免疫親和凈化為抗體抗原相互作用過(guò)程的原理及實(shí)驗(yàn)室日常檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)，淋洗速率減慢能提高檢測(cè)回收率。本次試驗(yàn)采取親和柱上樣后整個(gè)前處理過(guò)程不再加外壓，完全依靠自然重力凈化。考慮到多次添加和提取批次間的差異，本試驗(yàn)采取將同一批驗(yàn)證親和柱所用多次添加提取液全部混合均勻后再進(jìn)行檢測(cè)，以消除提取差異。

3.2 液相色譜儀校正

樣品液相色譜檢測(cè)采用五點(diǎn)即用標(biāo)準(zhǔn)工作液稀釋 得到 濃 度 分 別 為 15、7.5、3.75、1.875 ng/mL 和0.937 5 ng/mL校正液。經(jīng)HPLC檢測(cè)后相關(guān)系數(shù)均大于0.995。

3.3 添加樣品情況及檢測(cè)結(jié)果

以10 μg/kg濃度添加樣品檢測(cè)過(guò)程為例：稱取試驗(yàn)樣品25.0 g，加5.0 g氯化鈉，用濃度為0.3 μg/mL的B1、B2、G1、G2標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液混合后氮?dú)獯抵? mL左右添加到樣品中，避光靜置2 h后用體積比70∶30的甲醇與水的提取液定容至125 mL，均質(zhì)提取2 min。用折疊濾紙過(guò)濾．將4次提取后的過(guò)濾液全部混合均勻后加提取液體積2倍的水稀釋，用纖維濾紙過(guò)濾后，準(zhǔn)確移取15 mL上述濾液，注入玻璃注射器中，以自然流速通過(guò)免疫親和柱，流完后吹入空氣進(jìn)入親和柱中，再用10 mL蒸餾水淋洗免疫親和柱兩次，棄去全部流出液，吹干小柱。在小柱加入1 mL甲醇洗脫，收集全部洗脫液于樣品瓶中供HPLC測(cè)定。

3.4 10 μg/kg濃度添加的平均回收率及標(biāo)準(zhǔn)偏差

回收率及相對(duì)偏差表見(jiàn)表1。

表1 回收率及相對(duì)偏差表Table 1 Recovery and RSTD data

3.5 柱容量

柱容量驗(yàn)證試驗(yàn)采用50 μg/kg濃度添加水平樣品。經(jīng)3個(gè)平行樣品的檢測(cè)5個(gè)品牌親和柱產(chǎn)品回收率均在73%～113%間，數(shù)據(jù)表明所驗(yàn)證品牌產(chǎn)品在柱容量方面均能滿足日常檢測(cè)需要。

3.6 討論

綜合試驗(yàn)成本和驗(yàn)證周期，添加回收、批間差和批內(nèi)差3個(gè)指標(biāo)同時(shí)做，即每個(gè)品牌的每個(gè)批次同時(shí)做3個(gè)濃度6個(gè)平行驗(yàn)證及3個(gè)天然陽(yáng)性樣品檢測(cè)。本次驗(yàn)證過(guò)程共進(jìn)行了 2、5、10 μg/kg 3個(gè)濃度的添加，其他兩個(gè)濃度添加的結(jié)論同10 μg/kg濃度添加水平一致。因此在實(shí)際驗(yàn)證過(guò)程中可以只選擇一個(gè)濃度值進(jìn)行驗(yàn)證，即提高效率又降低驗(yàn)證成本。通過(guò)試驗(yàn)證明所驗(yàn)證5個(gè)品牌，除其中E品牌批間/內(nèi)差大不易判斷外，其他4個(gè)品牌質(zhì)保期內(nèi)4℃儲(chǔ)存條件下的穩(wěn)定性均較好。

通過(guò)試驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出參加對(duì)比驗(yàn)證試驗(yàn)的5個(gè)不同品牌親和柱除C品牌對(duì)黃曲霉毒素B2和G2，特別是G2的回收不理想外其他4個(gè)品牌均能滿足試驗(yàn)要求。C品牌產(chǎn)品生產(chǎn)廠家再將親和柱進(jìn)行升級(jí)改進(jìn)后性能也能滿足要求。從廠方所提供的兩個(gè)批次看批間和批內(nèi)差別均較好，E品牌批次P1的產(chǎn)品對(duì)黃曲霉毒素G2檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)偏差過(guò)大的原因是其中5個(gè)平行中的一支親和柱對(duì)G2的回收率為41.33%所致，鑒于此次試驗(yàn)為驗(yàn)證試驗(yàn)故保留此數(shù)據(jù)。

5種不同品牌的親和柱性能在前處理過(guò)程中表現(xiàn)出的差別不大，相對(duì)來(lái)說(shuō)A和C兩個(gè)品牌產(chǎn)品柱內(nèi)填料較緊密，過(guò)柱過(guò)程中流暢性差。B品牌產(chǎn)品過(guò)柱時(shí)最流暢，另外A和E兩個(gè)品牌產(chǎn)品的蓋子均過(guò)緊且E品牌的蓋子太小不宜打開(kāi)。總體技術(shù)評(píng)價(jià)優(yōu)良降序排序?yàn)镈、B、A、C和E。基于性能對(duì)比驗(yàn)證目的，本次試驗(yàn)采取了統(tǒng)一的前處理方法。統(tǒng)一的方法可能引起結(jié)果差異，但食品檢測(cè)機(jī)構(gòu)的檢測(cè)活動(dòng)需要標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)，在執(zhí)行相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)時(shí)如GB/T 18979-2003（液相色譜法）測(cè)定花生及制品中黃曲霉毒素，需按標(biāo)準(zhǔn)方法要求進(jìn)行操作。

4 結(jié)論

本文所采用的黃曲霉毒素檢測(cè)用免疫親和柱對(duì)比方法是結(jié)合檢測(cè)實(shí)際著重從產(chǎn)品的回收率、批內(nèi)差、批間差、準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性和柱容量等產(chǎn)品關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)考察。該方法簡(jiǎn)便易行，能夠篩選出性能優(yōu)越產(chǎn)品，保證檢測(cè)質(zhì)量。通過(guò)幾年的實(shí)用驗(yàn)證證明該方法完全可行，可信。參加驗(yàn)證試驗(yàn)的5個(gè)國(guó)內(nèi)外產(chǎn)品品牌在收到驗(yàn)證報(bào)告的同時(shí)也收到了一份產(chǎn)品建議，對(duì)于企業(yè)提高產(chǎn)品質(zhì)量和技術(shù)水平具有重要意義。經(jīng)過(guò)改進(jìn)提高5種產(chǎn)品性能均能滿足日常檢測(cè)基本需要，總體來(lái)說(shuō)此類產(chǎn)品質(zhì)量較好。

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Method of Performance Assessment about Aflatoxin Test Immunoaffinity Columns and Its Application

XU Wen-yuan1，NI Xin1，CUI Shu-hua2，ZHU Wan-yan1
（1.Linyi Entry-Exit Inspecting and Quarantine Bureau，Linyi 276034，Shandong，China；2.The Food and Agricultural Products Testing Agency of Shandong Entry-Exit Inspecting And Quarantine Bureau，Qingdao 266002，Shandong，China）

In this article a performance assessment method for aflatoxin test immunoaffinity columns has been developed and applied to five different products.After years of application the method proved to be completely dependable.The performance assessment result which depend on our method can not only been used for product purchase but also as an enhancement to product manufacture for quality improve.

aflatoxin；immunoaffinity column；performance comparison；performance assessment

2016-11-04

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.14.032

山東出入境檢驗(yàn)檢疫局課題（SK201285）

徐文遠(yuǎn)（1981—），男（漢），工程師，碩士研究生，研究方向：食品及輕工業(yè)品安全檢驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)。