新疆褐牛基因外顯子多態性及其與SCS和泌乳性狀關聯性分析

劉麗元，周靖航，張夢華，李金霞，方季青，譚世新，王愛芳，黃錫霞，王雅春

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新疆褐牛基因外顯子多態性及其與SCS和泌乳性狀關聯性分析

劉麗元1,2，周靖航2，張夢華1，李金霞1，方季青3，譚世新4，王愛芳4，黃錫霞1，王雅春5

（1新疆農業大學動物科學學院，烏魯木齊 830052；2寧夏大學農學院，銀川 750021；3新疆烏魯木齊種牛場，烏魯木齊 830000；4新疆天山畜牧生物工程股份有限公司，新疆昌吉831100；5中國農業大學動物科技學院，北京 100193）

【目的】探索和基因多態性與新疆褐牛體細胞評分及泌乳性狀的相關性，旨在尋找與新疆褐牛體細胞評分及泌乳性狀相關的分子標記。【方法】以新疆烏魯木齊種牛場、新疆天山畜牧生物工程股份有限公司共169頭新疆褐牛母牛為試驗對象，以2008—2015年間的生產性能測定記錄（包括乳脂率、乳蛋白率、總固體含量、乳糖率和體細胞計數等）和305 d產奶量為試驗數據，基于課題組前期15頭中國荷斯坦牛DNA混池重測序的結果篩選外顯子區域10個SNPs，采用基質輔助激光電離飛行時間質譜法（sequenom massArray genotype）分型技術驗證10個SNP位點的遺傳多態性，運用SAS8.1軟件GLM過程對這10個SNP突變與新疆褐牛體細胞評分（SCS）、305 d產奶量、乳脂率、乳蛋白率、乳糖率和總固體的關聯程度進行統計分析。【結果】10個SNP位點均具有多態性，χ2檢驗表明群體中9個SNP位點符合Hardy-Weinberg平衡狀態。關聯分析結果表明基因兩個位點（T98741711C和G98736141A）均與新疆褐牛305 d產奶量達到極顯著關聯（＜0.001），其中TT型和GG型個體的產奶量最高；（C45667492G）位點與新疆褐牛乳糖率達到顯著關聯（＜0.005），其中GG型個體的乳糖率最高；（T14533269A）位點與新疆褐牛乳脂率和總固體含量達到顯著關聯（＜0.005），與SCS達到極顯著關聯（＜0.001），其中TT型個體的乳脂率和總固體含量均最高，AA型個體的SCS極顯著高于AT和TT型；（C26758055G）位點與新疆褐牛乳蛋白率和總固體含量達到極顯著關聯（＜0.001），其中GG型個體顯著高于CC和GC型個體。連鎖不平衡分析與單倍型構建的結果發現10個SNPs構建了兩個單倍型模塊，其中SNP1和SNP2位點之間處于連鎖不平衡狀態（2＞0.3），SNP4和SNP10位點之間處于強連鎖不平衡狀態（2＞0.6），隨后分析了單倍型與SCS和泌乳性狀之間的相關性，發現單倍型與新疆褐牛SCS和泌乳性狀無顯著關聯（＞0.001）。【結論】 初步發現了和與新疆褐牛SCS和泌乳性能相關，結果可為新疆褐牛產奶性狀的分子標記輔助選育提供參考和依據。

新疆褐牛；SCS；泌乳性狀；MassArray；關聯分析

0 引言

【研究意義】分子育種技術在家畜育種中的應用，不僅可以增加選擇強度、提高選擇準確性，同時還可實現早期個體的基因型選擇[1-2]。而分子育種技術應用的前提是找到影響家畜經濟性狀的主效基因，本研究以初步探索、、、、和多態性與新疆褐牛體細胞評分及泌乳性狀的相關性，以期為新疆褐牛產奶性狀的分子標記輔助育種提供理論依據。【前人研究進展】近十年來，遺傳標記育種、轉基因技術、克隆技術等高新生物技術的研究取得了一定的進展，給奶牛育種工作帶來了新機遇。眾多的分子標記中，SNP（single nucleotide polymorphism）標記是當前遺傳標記研究中最多的，作為目前最具發展潛力的分子標記，因其在基因組中數量多、分布廣，已經廣泛應用于基因組制圖、疾病相關性分析、群體遺傳學及藥物研究等眾多領域[3]。目前，越來越多的泌乳性狀QTL和候選基因被相繼報道[4-5]，如王麗娟等[6]發現第4外顯子C8377G位點與產奶量顯著相關，VIILALA等[7]發現上F279Y突變顯著影響乳蛋白率和乳脂率，LEONARD等[8]對13 662頭牛群體進行多態性研究，發現第8 514位點突變與乳脂率和乳蛋白率性狀存在顯著關聯，王杰等[9]研究發現，中國荷斯坦牛內含子上的多態性與乳脂率和乳蛋白率顯著關聯，張曉東等[10]研究發現，外顯子8的多態性與中國荷斯坦牛的乳脂率顯著相關，賈晉等[11]研究發現，不同基因型之間的305 d產奶量和乳脂率有顯著差異外，還發現該基因對乳蛋白率影響顯著。季敏等[12]采用直接測序和PCR-RFLP技術研究檳榔江水牛變異，結果發現多態性與產奶量及乳脂率等產奶性狀具有顯著相關性。研究表明，利用候選基因策略尋找影響產奶性狀的主效基因進而應用于奶牛的遺傳改良，從分子遺傳角度來說是可行的[13]。【本研究切入點】新疆褐牛為乳肉兼用型品種，其作為新疆地區特有的品種資源，具有高乳蛋白、高乳脂、低體細胞數、抗逆性強、適應性好，乳肉平衡等優秀特質。產奶量和乳成分性狀（主要包括乳脂率、乳蛋白率、乳糖率等）作為奶牛生產中的重要經濟性狀，屬典型微效多基因控制的數量性狀，不僅對奶業發展有巨大影響[14]，而且在新疆褐牛產業發展中也占有重要地位。乳房炎是世界奶業的常見疾病，對牛產奶量和乳品質都會造成較大影響，通常以體細胞數為指示性狀，選育提高乳房炎抗性是增加奶牛生產效益的重要措施。基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術（MALDI-TOF-MS）是近年來應用在生物大分子檢測領域的一項新技術，在基因組SNP的分型檢測中具有高精準度、靈敏度高、一次可檢測多個SNPs且成本低和周期短等優點。該分型技術是在單堿基延伸的基礎上與質譜技術相結合從而進行分型，其原理是通過基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術，檢測延伸產物分子量的大小，應用專用的分析軟件進行突變位點的分型。目前，國內外已有很多文獻報道生物質譜技術在SNP分型方面的應用，研究表明，質譜檢測法與其他檢測方法相比，準確性更高[15-17]。【擬解決的關鍵問題】將分子育種技術應用于新疆褐牛育種工作中勢在必行，但目前對新疆褐牛泌乳性狀相關基因的研究還相對較少，因此，本文根據前期中國荷斯坦牛重測序結果選取了10個SNPs位點，探索這些SNPs的遺傳多態性，并分析其與新疆褐牛SCS、305d產奶量、乳脂率、乳蛋白率、乳糖率和總固體數之間的相關性，試圖尋找新疆褐牛體細胞評分和泌乳性狀的有效分子標記，為今后新疆褐牛乳用性能分子育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 本研究以新疆地區新疆烏魯木齊種牛場和新疆天山畜牧生物工程股份有限公司2個牛場169頭具有DHI測定記錄、年齡及胎次等數據的新疆褐牛母牛作為實驗動物，同時采集奶樣和血樣。奶樣自2008年至2015年期間每月采集一次送至新疆維吾爾自治區奶業辦公室進行DHI測定，獲得乳脂率、乳蛋白率、乳糖率、總固體以及體細胞計數等表型數據；血液為2014年分別在兩個牛場采集，EDTA抗凝，用于基因型檢測。

1.1.2 性狀表型記錄 產奶性狀記錄包括305 d產奶量（不足305 d的產奶量根據付雪峰[18]制定的新疆褐牛305 d產奶量校正系數進行校正）、乳脂率、乳蛋白率、乳糖率、總固體和體細胞計數（Somatic cell counts，SCC）。在進行統計分析時，利用公式將體細胞數轉換為呈正態分布的體細胞評分（Somatic cell score，SCS）：SCS=log2(SCC/100000)+3，并保留2位有效數字。對DHI測定記錄的質控遵循以下標準[19]：305 d產奶量為1 000—18 000 kg；乳脂率為2%—7%；乳蛋白率為2%—6%；乳糖率為2%—5.5%；總固體為9%—18%；SCC為1—100 000。

1.1.3 影響因素水平劃分 數據來自新疆烏魯木齊種牛場和新疆天山畜牧生物工程股份有限公司，由于新疆天山畜牧生物工程股份有限公司樣本量較少，在分析時不考慮場效應；年份和季節均以自然產犢年季劃分，以中國氣象數據網公布的新疆地區近30年的平均氣溫記錄，依據候溫法將新疆地區的季節劃分為春季（4—5月）、夏季（6—8月）、秋季（9月）、冬季（10月至次年3月），各月份、各季節平均氣溫見表1和表2；胎次按自然胎次劃分6個水平（1—6胎及以上）；泌乳月劃分為12個水平。

表1 1981-2010年各月份平均氣溫

表2 1981-2010年各季節平均氣溫

1.2 方法

1.2.1 血液基因組DNA提取 利用苯酚-氯仿抽提法進行基因組DNA提取，TE緩沖液溶解后，利用NANODROP2000紫外分光光度計和凝膠電泳檢測DNA提取質量，將合格DNA放置于-20°冰箱保存備用。

1.2.2 DNA池重測序篩選SNP 課題組前期以15頭新疆褐牛為試驗對象，運用DNA混池重測序技術篩選到大量SNPs（表3），為保證后續試驗的可行性和準確性，將對篩選出的SNPs進行進一步的篩選，篩選條件如下：①變異位點位于外顯子區域；②變異類型選取錯義突變；③一個基因出現多個位點變異的SNPs；④樣本基因型為雜合變異；⑤測序深度大于40，測序深度越深，變異位點準確性越高。

表3 10個SNPs相關信息

文中選擇錯義突變SNP的原因：錯義突變是編碼某種氨基酸的密碼子經堿基替換以后，變成編碼另一種氨基酸的密碼子，從而使多肽鏈的氨基酸種類和序列發生改變。而氨基酸是構成蛋白質的基本單位，氨基酸的改變可能會改變其編碼的蛋白質，而蛋白質對基因的表達有調節作用，蛋白質的改變會引起基因的功能變化[20]。

1.2.3 SNP分型 將上一步確定的SNP利用Illumina公司的MassARRAY Genotype分型技術進行SNP分型。主要步驟如下[21]：（1）引物設計：對目的SNP做PCR多重設計，使每一個SNP具有一對擴增引物及一個延伸引物，以便待分型的多個核苷酸片段能夠在相同的反應體系中做多重PCR反應；（2）多重PCR擴增；（3）SAP反應；（4）延伸反應；（5）去鹽。將結束反應的板內均勻填充樹脂并放置10 min晾干，每個孔加入16 μL DEPC水，并在Dimpe板上緩慢扣放樣本板，輕輕敲打使樹脂能夠落入樣本孔中，離心均勻1 h。

根據已知SNP位點序列信息，使用Sequenom MassArray Assay Design軟件對待測SNPs進行引物設計，引物設計中包括PCR擴增引物和單堿基延伸引物。引物設計完成后經軟件測試可以使用后交由生物公司進行引物合成。共設計10對引物，10個SNPs由DNA混池全基因組重測序結果提供，表4為各位點引物信息表。

1.2.4 統計分析 計算基因型頻率、等位基因型頻率并檢測各位點的哈代-溫伯格平衡情況。運用SAS 8.1的GLM過程對基因型與SCS和泌乳性狀進行關聯分析的線性模型為：

Yijklm=μ+Gi+Lj+Sk+Pl+eijklm

式中，Y為產奶性狀表型值（305 d 產奶量、乳脂率、乳蛋白率、乳糖率、總固體數和SCS）；為群體均值；G為基因型效應；L為年季組合效應；S為胎次效應；P為泌乳月效應；e為隨機誤差。

為保證多重比較過程總的I型錯誤概率低于0.05和0.01，將顯著性水平校正為＜0.005（顯著）和＜0.001（極顯著）。

表4 引物信息表

2 結果

2.1 產奶性狀描述性統計

根據2008年至2015年課題組對兩個新疆褐牛牛群進行性能測定數據，統計分析得出SCS和泌乳性狀的簡單統計量，結果見表5。

表5 泌乳性狀及SCS描述性統計量

2.2 基因型檢測

利用MassArray技術對新疆褐牛169個樣本10個SNPs進行基因型分型，通過質譜軟件統計分析得到了分型結果，10個SNPs均具有多態性，且未識別出的堿基數較少，基因多態性以AG、CT基因型為主，可以進行下一步SNP位點多態性與產奶性狀遺傳效應的研究。

2.3 群體等位基因頻率和基因型頻率

利用Excel統計上述10個SNPs的等位基因頻率和基因型頻率，并進行哈代-溫伯格平衡檢驗，結果見表6。χ2檢驗表明SNP1、SNP2、SNP3、SNP4、SNP6、SNP 7、SNP 8、SNP 9和SNP 10這9個位點均處于Hardy-Weinberg平衡狀態（＞0.05）。SNP5、SNP6和SNP9位點的優勢等位基因為C，其等位基因頻率分別為0.985、0.912、0.736，其中SNP5、SNP6、SNP9位點的優勢基因型為CC，其優勢基因型頻率分別為0.975、0.843、0.534；SNP1位點的優勢基因型為CT，優勢基因型頻率為0.435。SNP2、SNP3、SNP4、SNP7位點的優勢等位基因為A，其優勢等位基因頻率分別為0.607、0.801、0.710、0.984，其中SNP3、SNP4、SNP7位點的優勢基因型為AA，其優勢等位基因型頻率分別為0.641、0.503、0.968；SNP2位點的優勢基因型為AG，其基因型頻率為0.448。SNP8和SNP10位點的優勢等位基因為T，其優勢等位基因頻率分別為0.984、0.587，其中SNP8位點的優勢基因型為TT，其基因型頻率為0.968，SNP10的優勢基因型為CT，其基因型頻率為0.439。SNP5、SNP6、SNP7、SNP8位點處于低度多態（PIC＜0.25），其余6個位點均處于中度多態（0.25＜PIC＜0.5）。

2.4 10個SNPs與泌乳性狀及SCS的關聯分析

表7顯示10個SNPs不同基因型對新疆褐牛305 d產奶量、乳脂率、乳蛋白率、乳糖率、總固體數及SCS的影響。由表可知，SNP1和SNP2位點對新疆褐牛305 d 產奶量有極顯著影響（＜0.001），基因型為TT和GG的個體305 d 產奶量最高。SNP3位點對乳脂率和總固體含量有顯著影響（＜0.005），對SCS有極顯著影響（＜0.001），其中純合型TT個體乳脂率和總固體均最高，而雜合型AT個體兩個指標均較低，AA型個體SCS最高。SNP6對乳蛋白率和總固體性狀均有極顯著影響（＜0.001），其中GG型個體具有較高的乳蛋白率和總固體含量。SNP9位點對乳糖率有顯著影響（＜0.005），其中基因型為GG的個體乳糖率顯著高于CC型，而GC型顯著高于CC型。

關聯分析結果表明，SNP1和SNP2與新疆褐牛305 d產奶量達到極顯著關聯（＜0.001）；SNP3與乳脂率和總固體達到顯著關聯（＜0.005），與SCS性狀達到極顯著關聯（＜0.001）；SNP6與乳蛋白率和總固體均達到極顯著關聯（＜0.001）；SNP9與乳糖率達到顯著關聯（＜0.005）。

表6 新疆褐牛10個位點的基因型頻率和等位基因頻率及χ2檢驗

2.5 單倍型與連鎖不平衡分析

運用Haploview軟件對所有SNPs進行了單倍型與連鎖不平衡分析，如圖1所示，得出10個SNP位點的連鎖不平衡檢測結果。圖的上方為標記在基因中的位置，紅色方塊表示D’＞0.8，方塊顏色越淺表示D’值越低，加框的標記處于同一單倍型域中。圖2為單倍型組成，連線表示單倍型域可能的單倍型組合，下方數字是單倍型域間主要的單倍型組合的比例。由圖2可以看出，本研究群體中，10個SNPs共構成2個單倍型模塊，分別命名為Block1、Block2，其中Block2處于強連鎖不平衡狀態（2＞0.6）。Block1包含SNP4和SNP10，其中D’和2值為1.000和0.587，因此Block1為連鎖不平衡狀態，構成3種單倍型，其中TA、CG和CA單倍型頻率分別為0.596、0.292、0.121；Block2包含SNP1和SNP2，其中D’和2值為1.000和0.921，因此Block2為強連鎖不平衡狀態，構成3種單倍型，其中AC、GT和GC單倍型頻率分別為0.607、0.373、0.019，兩個單倍型模塊之間的連鎖不平衡系數D’為0.36（圖2）。

表7 10個SNP與泌乳性狀及SCS的關聯分析（最小二乘均值±標準誤）

同一組數據不同小寫字母表示差異顯著（＜0.005）；同一組數據不同大寫字母表示差異極顯著（＜0.001）

Different letter of small (＜0.005) and capital (＜0.001) letters among the genotypes of the same SNP indicate significant difference

圖1 10個SNPs連鎖不平衡估計

圖2 單倍型域中的單倍型組成

2.6 單倍型與泌乳性狀及SCS關聯分析

運用SAS8.1軟件進行單倍型與新疆褐牛SCS及泌乳性狀的關聯分析，結果如表8可知，共存在5種單倍型（本研究群體中未發現GGCC個體），在進行各單倍型與新疆褐牛泌乳性狀的關聯分析時，均未發現單倍型與泌乳性狀的關聯性，可能是由于樣本量較少，或者是還有其他標記與本研究的SNPs位點緊密連鎖影響著新疆褐牛SCS和泌乳性狀。

表8 單倍型與泌乳性狀和SCS的關聯分析（最小二乘均值±標準誤）

＜0.005表示差異顯著；＜0.001表示差異極顯著

＜0.005 indicate significant difference;＜0.001 indicate highly significant difference

3 討論

3.1 SNPs遺傳多態性分析

采用MassArray技術對運用DNA混池重測序結果篩選的SNPs進行個體基因分型并檢測其多態性。結果得知，10個位點均有多態性，卡方檢驗表明其中9個位點符合哈代-溫伯格平衡狀態，說明新疆褐牛在人工選育、遷移和遺傳漂變等因素作用下，這些位點仍處于動態平衡中，反映了這些位點的選擇壓力不強；僅SNP5位點不符合哈代-溫伯格平衡狀態，說明該位點在新疆褐牛群體中具有較大的選擇潛力。SNP5、SNP6、SNP7和SNP8位點均處于低度多態，且有效等位基因數目較少，即這4個位點在新疆褐牛群體中遺傳變異為低等水平，4個位點位于和基因上，推測新疆褐牛在長期的育種選擇及進化過程中，兩個基因所受的選擇壓力不大；其余6個位點均處于中度多態，遺傳變異較大。因此，綜上所述，在新疆褐牛泌乳性狀的選育過程中應當加強人工選擇的強度。

3.2 SNPs與泌乳性狀及SCS關聯分析

本文涉及的6個基因與牛產奶性狀的關聯性研究鮮有報道，本研究旨在初步探索這些基因與新疆褐牛SCS和泌乳性狀的相關性。其中，SNP1和SNP2位于牛7號染色體上（內質網氨基肽酶2），該基因是氨基肽酶M2家族中的一個多功能酶，是參與ER抗原加工的另一個氨基肽酶，具有高度多態性。有研究表明，與一種以高血壓和蛋白尿為特征的孕期綜合征——先兆子癇有關，在可能發生先兆子癇女性的前三個月胎盤中，表達常發生改變[22]，其次，關于人類鳥槍彈樣脈絡膜視網膜病變、乳腺癌和妊娠高血壓疾病等方面的研究居多[23-25]。本研究初次探索了該基因與新疆褐牛產奶性狀的相關性，結果表明SNP1和SNP2均與新疆褐牛305d產奶量達到極顯著相關，對于SNP1，TT基因型個體的305d產奶量顯著高于CC型個體；對于SNP2，GG基因型個體305d產奶量顯著高于AA基因型個體。

SNP3位于上，位于牛20號染色體上，由24個外顯子組成。蛋白家族與RNA剪接體的功能相關，其表達模式和生物學功能研究至今未見實驗性報道。本文初次研究了T14533269A位點與新疆褐牛泌乳性狀的關聯性，結果表明該位點與乳脂率、總固體和SCS性狀達到顯著或極顯著關聯，對于乳脂率和總固體性狀，TT基因型個體顯著高于AA基因型個體。牛奶中體細胞數與奶牛乳房炎存在顯著的相關性，由于SCC分布是非正態的，通常將SCC轉化為體細胞評分來研究[26]。奶牛乳房炎是一種常見的奶牛疾病，對世界奶業造成的經濟損失極大，目前，已有許多學者開展了奶牛分子抗病育種研究工作，并取得了一定的成果。本研究得出T14533269A位點與新疆褐牛SCS性狀達到極顯著關聯，初次探討了與牛體細胞評分的關聯性。

SNP4和SNP10均位于上，結果表明兩位點與新疆褐牛產奶性狀無顯著性關聯性。為鋅指蛋白基因本研究之前還未有該基因與中國荷斯坦牛產奶性狀的相關報道，2014年，SANTANA和OLIVEIRA等研究結果表明該基因與肉牛干物質采食量有關[27-28]。JIANG等全基因組關聯分析結果表明鋅指蛋白中的一個位點（rs41627764）對北京地區中國荷斯坦牛乳脂率性狀有顯著影響[1]。

SNP5和SNP6位于上，為抗苗勒氏管激素II型受體，也叫苗勒管抑制物，屬于轉化生長因子βII型受體（）之一。最初分別由DI CLEMETE和BAARENDS等所在的兩個實驗室用不同的方法于1994年克隆獲得[29-30]。關于基因大多是關于女性多囊性卵巢綜合征的研究[31-32]，而在牛上的研究相對較少，僅有的幾篇是關于牛卵巢顆粒細胞發育研究[33-35]。CARTER等在瘤牛上研究了RNA表達與卵母細胞數量相關，且該基因與牛繁殖性能相關[36-37]。然而，目前該基因與牛產奶性狀的關聯性研究還未見報道。本研究得出SNP6與新疆褐牛乳蛋白率和總固體性狀達到極顯著關聯，而SNP5與新疆褐牛各產奶性狀未達到顯著關聯。

SNP9與新疆褐牛乳糖率性狀達到顯著關聯。該位點位于牛15號染色體上，ABAL等[38]研究表明，該基因可作為檢測人類子宮內膜癌的分子標記，COLAS等[39]研究結果表明，該基因在人類子宮內膜腫瘤中的差異表達與其在相應子宮液體樣品中的表達水平相關。但目前為止，關于該基因與奶牛產奶性狀的相關研究還未見報道。研究結果顯示，對于遺傳力低、只能在一個性別中表達、不能早期測量或測量難度大、成本高的性狀，標記輔助選擇（MAS）相對于常規選擇法有較大優勢。奶牛的產奶性狀（產奶量、乳脂率、乳蛋白率）具有中等偏下的遺傳力，只在母牛表現且表現時間是在一胎產奶結束之后，因此，奶牛育種中實施MAS大有可為[40]。

3.3 單倍型與連鎖不平衡分析

有研究表明，與單標記SNP相比，單倍型分析對復雜性狀的遺傳變異具有更好的效果[41]。隨著高通量SNPs檢測的出現，發現的SNP量越來越多，需要進行連鎖不平衡分析來估計有效群體的大小，長距離連鎖不平衡可以用來估計近世代的有效群體大小，短距離連鎖不平衡可以用來估計遠世代的有效群體大小[42-43]。本研究群體中，檢測的10個SNPs共構成2個單倍型模塊，且均處于強連鎖不平衡狀態。由圖2可以看出，單倍型模塊與模塊之間連鎖程度較低，這可能是由于各個位點間物理位置相距較遠所致。有研究表明，隨著物理距離的增加，LD呈遞減趨勢，但某些物理位置較遠的SNP之間也可能存在強LD，牛基因組不僅存在近距離的連鎖不平衡，而且遠距離的標記也以一定的模式存在連鎖不平衡[44]。

3.4 單倍型與泌乳性狀及SCS關聯分析

本研究未發現單倍型與新疆褐牛SCS和泌乳性狀的關聯性，可能是由于樣本量較少。何峰等研究結果表明單個位點乳脂量的效應不顯著，而單倍型組合對乳脂量的效應卻達到了顯著水平，由此可見，用多個SNPs構建單倍型，進而分析單倍型對產奶性狀的效應，為以標記輔助選擇為基礎的奶牛分子育種帶來更多的遺傳學信息[45]。

4 結論

本研究基于DNA混池重測序結果獲得的SNPs數據，篩選6個基因的10個SNP位點在169頭新疆褐牛群體中驗證其遺傳多態性，并分析其對新疆褐牛體細胞評分和泌乳性狀的影響。初步發現了與新疆褐牛體細胞評分性狀有關，、和與新疆褐牛305 d產奶量、乳脂率、乳蛋白率、乳糖率和總固體性狀有關，其中A145332691T和C26758055G位點與新疆褐牛多個泌乳性狀達到顯著關聯，提示，這些SNPs可為新疆褐牛產奶性狀的分子標記輔助選育提供參考依據，但各位點的遺傳效應差異及突變對乳汁合成等生理生化反應作用方面值得進一步深入研究。

References

[1] JIANG L, LIU J, SUN D, MA P, DING X, YU Y, ZHANG Q. Genome wide association studies for milk production traits in Chinese Holstein population., 2010, 5(10): e13661-e13661.

[2] 初芹, 李東, 侯詩宇, 石萬海, 劉林, 王雅春. 基于DNA池測序法篩選奶牛高信息量SNP標記的可行性. 遺傳, 2014, 36(7): 691-696.

CHU Q, LI D, HOU S Y, SHI W H, LIU L, WANG Y C. Direct sequencing of DNA pooling for screening highly informative SNPs in dairy cattle.2014, 36(7): 691-696. (in Chinese)

[3] 唐立群, 肖層林, 王偉平. SNP分子標記的研究及其應用進展. 中國農學通報, 2012, 28(12): 154-158.

TANG L Q, XIAO C L, WANG W P. Research and Application Progress of SNP Markers.2012, 28(12): 154-158. (in Chinese)

[4] 奇瑞利, 賴淑靜, 袁陶燕, 何俊, 吳兵兵, 敷衍, 牛冬. 奶牛產奶性狀候選基因的研究進展. 畜牧與獸醫, 2013, 45(4): 94-97.

QI R L, LAI S J, YUAN T Y, HE J, WU B B, FU Y, NIU D. Advances in research on candidate genes for milk production in dairy cows.2013, 45(4): 94-97.

[5] 王榮霞, 袁陶燕, 賴淑靜, 唐軍旺, 杜雪, 趙婉秋, 敷衍, 牛冬. 影響奶牛泌乳性狀的候選基因研究進展. 畜牧與獸醫, 2015, 47(12): 144-146.

WANG R X, YUAN T Y, LAI S J, TANG J W, DU X, ZHAO W Q, FU Y, NIU D. Advances in research on candidate genes affecting milk character of dairy cattle., 2015, 47(12): 144-146. (in Chinese)

[6] 王麗娟, 李秋玲, 王長法, 王洪梅, 李建斌, 侯明海, 高遠東, 仲躋峰. 奶牛PRL基因CRS-PCR多態性與產奶性狀的關聯分析. 畜牧獸醫學報, 2009, 40(3): 303-308.

WANG L J, LI Q L, WANG C F, WANG H M, LI J B, HOU M H, GAO Y D, ZHONG J F. CRS-PCR Polymorphisms of prolactin gene and its relationship with milk production traits in Chinese Holstein Cows.2009, 40(3): 303-308. (in Chinese)

[7] VIITALA S, SZYDA J, BLOTT S, SCHULMAN N, LIDAUER M, M?KI-TANILA A, GEORGES M, VILKKI J. The role of the bovine growth receptor and prolactin genes in milk, fat and protein production in finish ayrshire dairy cattle.2006, 173: 2151-2164.

[8] LEONARD S, KHATIB H, SCHUTZKUS V, CHANG Y M, MALTECCA C L. Effects of the osteopontin gene variants on milk production traits in dairy cattle.2005, 88(11): 4083-4086

[9] 王杰, 原清會, 曾長國, 張明, 賴松家. 中國荷斯坦牛OPN基因內含子4多態性及其與產奶性狀的相關分析. 中國畜牧雜志, 2010, 46(15): 5-8.

WANG J, YUAN Q H, ZENG C G, ZHANG M, LAI S J. Effects of OPN gene on litter size in a Large White and a Landrace Herd.2010, 46(15): 5-8. (in Chinese)

[10] 張曉東. 奶牛DGAT1基因SNPs分析及其與產奶性能關系的研究[D]. 合肥: 安徽農業大學, 2009.

ZHANG X D. Studies on SNPs of DGAT1 gene and its association with milk production traits in dairy cattles[D]. Hefei: Anhui Agricultural University, 2009. (in Chinese)

[11] 賈晉, 馬妍, 孫東曉, 張毅, 張沅. 中國荷斯坦牛DGAT1基因與產奶性狀關聯分析. 畜牧獸醫學報, 2008, 39(12): 1661-1664.

JIA J, MA Y, SUN D X, ZHANG Y, ZHANG Y. Association analysis between DGAT1 gene and milk production traits in Chinese Holstein.2008, 39(12): 1661-1664. (in Chinese)

[12] 季敏, 劉學洪, 余長林, 余選富, 劉定江, 史憲偉. 檳榔江水牛STAT5A基因多態性及其與產奶性狀的關聯性研究. 中國牛業科學, 2013, 39(4): 29-35.

JI M, LIU X H, YU C L, YU X F, LIU D J, SHI X W. Association of STAT5A polymorphism and milk production traits in Binlangjiang Buffalo.2013, 39(4): 29-35. (in Chinese)

[13] 張曉東, 殷宗俊. 奶牛產奶性狀候選基因研究進展. 中國奶牛, 2007(11): 23-27.

ZHANG X D, YIN Z J. Advances in research on candidate genes for milk production of dairy cows.2007(11): 23-27. (in Chinese)

[14] VIGNAL A, MILAN D, SANCRISTOBAL M, EGGEN A. A review on SNP and other types of molecular markers and their use in animal genetics.2002, 34(3): 1-31.

[15] 趙輝, 王威, 張清潤, 高揚, 趙洪斌, 周珺, 林偉, 曾長青. 高通量飛行時間質譜基因分型方法的研究. 生物化學與生物物理進展, 2005(07): 667-672.

ZHAO H, WANG W, ZHANG Q R, GAO Y, ZHAO H B, ZHOU J, LIN W, ZENG C Q. The Study of high throughput MALDI-TOF genotyping assay., 2005(07): 667-672. (in Chinese)

[16] 唐劍頻, 侯一平. 基質輔助激光解吸/離子化飛行時間質譜分析多態性遺傳標記. 中華醫學遺傳學雜志, 2005(02): 185-188.

TANG J P, HOU Y P. Analysis of polymorphic markers by matrix-assisted laser desorption/ionizat ion time-of-flight mass spectrometry.2005(02): 185-188. (in Chinese)

[17] 鄧廷賢, 龐春英, 朱鵬, 段安琴, 陸杏蓉, 楊炳壯, 梁賢威. 飛行時間質譜法檢測水牛黑素皮質素受體4基因多態性. 中國畜牧獸醫, 2015(07): 1800-1806.

DENG T X, PANG C Y, ZHU P, DUAN A Q, LU X R, YANG B Z, LIANG X W. Rapid detection of SNP in buffalo MC4R gene by matrix-assisted laser desorption/Ionization time-of-flight mass spectrometry.2015(07): 1800-1806. (in Chinese)

[18] 付雪峰, 王雅春, 郭俊青, 郭志勤, 程黎明, 周光瑞, 黃錫霞, 徐勇. 新疆褐牛產奶量校正系數的制定. 畜牧獸醫學報, 2010, 41(5): 536-542.

FU X F, WANG Y C, GUO J Q, GUO Z Q, CHENG L M, ZHOU G R, HUANG X X, XU Y. Study of adjustment for standardizing milking record in Xinjiang Brown Cattle., 2010, 41(5): 536-542. (in Chinese)

[19] MAO Y, ZHU X, XING S, ZHANG M, ZHANG H, KARROW N, YANG L, YANG Z. Polymorphisms in the promoter region of the bovine lactoferrin gene influence milk somatic cell score and milk production traits in Chinese Holstein cows.2015, 103: 107-112.

[20] 鄒思湘. 動物生物化學. 北京: 中國農業出版社, 2005: 307-320.

ZOU S X.. Beijing: China Agriculture Press, 2005: 307-320. (in Chinese)

[21] GABRIEL S, ZIAUGRA L, TABBAA D. SNP genotyping using the Sequenom MassARRAY iPLEX platform.2009, 2(2): 2. 12. 1-2. 12. 18.

[22] 郭愛華, 徐滬濟. ERAP1結構與功能研究進展. 分子診斷與治療雜志, 2013, 5(2): 128-133.

GUO A H, XU H J. Structural and functional research progress of ERAP1.2013, 5(2): 128-133. (in Chinese)

[23] KUIPER J J W, SETTEN J V, RIPKE S, T SLOT R V, MULDER F, MISSOTTEN T, BAARSMA G S, LAURENT C. FRANCIOLI, PULIT S L, DE KOVEL C G F, DAM-VAN LOON N T, HOLLANDER A D, HET VELD P H, HOYNG C B, CORDERO-COMA M, MARTíN J, LLOREN? V, ARYA B, THOMAS D, BAKKER S C, OPHOFF R A, ROTHOVA A, BAKKER P W D, MUTIS T, KOELEMAN B P C. A genome-wide association study identifies a functional ERAP2 haplotype associated with birdshot chorioretinopathy., 2014, 23(22): 6081-6087.

[24] GADALLA S E, ?JEMALM K, VASQUEZ P L, NILSSON L, ERICSSON C, ZHAO J, NISTéR M. EpCAM associates with endoplasmic reticulum aminopeptidase 2 (ERAP2) in breast cancer cells., 2013, 439(2): 203-208.

[25] JOHNSON M P, ROTEN LTDYER T D. The ERAP2 gene is associated with preeclampsia in Australian and Norwegian populations.2009, 126(5): 655-666.

[26] 馬裴裴, 俞英, 張沅, 張勤, 王雅春, 孫東曉, 張毅. 中國荷斯坦牛SCC變化規律及其與產奶性狀之間的關系. 畜牧獸醫學報, 2010, 41(12): 1529-1535.

MA P P, YU Y, ZHANG Y, ZHANG Q, WANG Y C, SUN D X, ZHANG Y. The distribution of SCC and its correlation with milk production traits in Chinese Holsteins., 2010, 41(12): 1529-1535. (in Chinese)

[27] SANTANA M H, UTSUNOMIYA Y T, NEVES H H, GOMES R C, GARCIA J F, FUKUMASU H, SILVA S L, JUNIOR G A, ALEXANDER P A, LEME P R, BRASSALOTI R A, COUTINHO L L, LOPES T G, MEIRELLES F V, ELER J P, FERRAZ J B. Genome-wide association analysis of feed intake and residual feed intake in Nellore cattle.2014, 15(1): 1-8.

[28] OLIVEIRA P S, CESAR A S, DO NASCIMENTO M L, CHAVES A S, TIZIOTO P C, TULLIO R R, LANNA D P, ROSA A N, SONSTEGARD T S, MOURAO G B, REECY J M, GARRICK D J, MUDADU M A, COUTINHO L L, REGITANO L C. Identification of genomic regions associated with feed efficiency in Nelore cattle., 2014, 15(1): 1-10.

[29] DI CLEMENTE N, WILSON C, FAURE E, BOUSSIN L, CARMILLO P, TIZARD R, PICARD JY, VIGIER B, JOSSO N. Cat, Cloning, expression, and alternative splicing of the receptor for anti-Mullerian hormone., 1994, 8(8): 1006-1020．

[30] BAARENDS W M, VAN HELMOND M J, POST M, VAN DER SCHOOT P J, HOOGERBRUGGE J W, DE WINTER J P, UILENBROEK J T, KARELS B, WILMING L G, MEIJERS J H. A novel member of the transmembrane serine threonine kinase receptor family is specifically expressed in the gonads and in mesenchymalcells adjacent to the mullerian duct.1994, 120(1): 189-197．

[31] 李鍵, 喬杰, 閆麗盈, 唐榮欣, 甄秀梅. 抗苗勒氏管激素及其Ⅱ型受體的基因多態性與多囊卵巢綜合征發病的關系. 中國婦產科臨床雜志, 2008(03): 206-210.

LI J, QIAO J, YAN L Y, TANG R X, ZHEN X M. Relationship between polymorphism of anti-mullerian hormonr, anti-mullerian hormone receptor typeII and polycystic ovary syndrome.2008(03): 206-210. (in Chinese)

[32] FANG W, NIU W B, KONG H J, SUN Y P. The role of AMH and its receptor SNP in the pathogenesis of PCOS., 2017, 439: 363-368.

[33] POOLE D H, OCON-GROVE O M, JOHNSON A L. Anti-mullerian hormone receptor Type II (AMHR2) expression and activity in Bovine Granulosa Cells., 2010, 82(1): 185-185.

[34] POOLE D H, OCóN-GROVE O M, JOHNSON A L. Anti-Müllerian hormone (AMH) receptor type II expression and AMH activity in bovine granulosa cells.2016, 86(5): 1353-1360.

[35] ILHA G F, ROVANI M T, GASPERIN B G, FERREORA R, DE MACEDO M P, NETO O A, DUGGAVATHI R, BORDIGNON V, GONCALAVES P B. Santa maria, Brazil: Regulation of anti-mullerian hormone and its receptor expression around follicle deviation in cattle.2016, 51(2): 188-194.

[36] CARTER A S, MAHBOUBI K, COSTA N N, GILLIS D J, CARTER T F, NEAL M S, MIRANDA M S, OHASHI O M , FAVETTA LA, KING W A. Systemic and local anti-mullerian hormone reflects differences in the reproduction potential of Zebu and European type cattle.2016, 167: 51-58.

[37] ILHA G F, ROVANI M T, GASPERIN B G, FERREIRA R, DE MACEDO M P, NETO O A, DUGGAVATHI R, BORDIGNON V, GON?ALVES P B. Santa Maria, Brazil: Regulation of anti-müllerian hormone and its receptor expression around fFollicle deviation in cattle.2016, 51(2): 188-194.

[38] Abal Posada M, Doll A, Gil Moreno A, Maes T, Perez C. Markers for endometrial cancer. US:US9046522[P], 2015.

[39] COLAS E, PEREZ C, CABRERA S, PEDROLA N, MONGE M, CASTELLVI J, EYZAGUIRRE F, GREGORIO J, RUIZ A, LLAURADO M, RIGAU M, GARCIA M, ERTEKIN T, MONTES M, LOPEZ-LOPEZ R, CARRERAS R, XERCAVINS J, ORTEGA A, MAES T, ROSELL E, DOLL A, ABAL M, REVENTOS J, GIL- MORENO A. Molecular markers of endometrial carcinoma detected in uterine aspirates.2011, 129(10): 2435-2444.

[40] 張沅, 張勤, 孫東曉. 奶牛分子育種技術研究. 北京: 中國農業大學出版社, 2012: 343-350.

ZHANG Y, ZHANG Q, SUN D X.China Agricultural University Press, 2012: 343-350. (in Chinese)

[41] ZHAO H, PFEIFFER R, GAIL M H. Haplotype analysis in population genetic and association studies.2016, 4(2): 171-178.

[42] HAYES B J, VISSCHER P M, MCPARTLAN H C, GODDARD M E. Novel multilocus measure of linkage disequilibrium to estimate past effective population size.2003, 13(4): 635-643.

[43] 尼桂琰, 張哲, 姜力, 馬裴裴, 張勤, 丁向東. 利用全基因組連鎖不平衡估計中國荷斯坦牛有效群體大小. 遺傳, 2012, 34(1): 50-58.

NI G Y, ZHANG Z, JIANG L, MA P P, ZHANG Q, DING X D. Chinese Holatein Cattle effective population size estimated from whole genome linkage disequilibrium.2012, 34(1): 50-58. (in Chinese)

[44] 何云剛, 金力, 黃薇. 單核苷酸多態性與連鎖不平衡研究進展. 基礎醫學與臨床, 2004, 24(5): 487-490.

HE Y G, JIN L, HUANG W. Advance in the research of single nucleotide polymorphism and linkage disequilibrium., 2004, 24(5): 487-490. (in Chinese)

[45] 何峰, 孫東曉, 俞英, 王雅春, 張沅. 荷斯坦奶牛STAT5A基因的SNPs檢測及其與產奶性狀的關聯分析. 畜牧獸醫學報, 2007, 38(4): 326-331.

HE F, SUN D X, YU Y, WANG Y C, ZHANG Y. SNPs detection of STAT5A gene and association with milk production traits in Holstein Cattle.2007, 38(4): 326-331. (in Chinese)

（責任編輯 林鑒非）

Genetic Effect Analysis of SNPs from 6 genes on SCS and Milk Production Traits in Xinjiang Brown Cattle

LIU LiYuan1,2, ZHOU JingHang2, ZHANG MengHua1, LI JinXia1, FANG JiQing3, TAN ShiXin4, WANG AiFang4, HUANG XiXia1, WANG YaChun5

(1College of Animal Science, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052;2School of Agriculture, Ningxia University, Yinchuan 750021;3Cattle Farm in Urumqi, Urumqi 830000;4Xinjiang Tianshan Animal Husbandry Biological Engineering Co., Ltd, Changji 831100, Xinjiang;5College of Animal Science and Technology, China Agricultural University, Beijing 100193)

【Objective】The association between polymorphisms ofandgeneand somatic cell score (SCS) and milk production traits in Xinjiang brown cattle were studied in order to find out molecular markers association with SCS and/or milk production traits.【Method】Taking 169 Xinjiang brown cattle cows as experimental animals from Xinjiang Urumqi cattle farm and Xinjiang Tianshan Animal Husbandry and Biotechnology Co., Ltd. The experimental data including Dairy Herd Improvement records (including milk fat percentage, milk protein percentage, lactose percentage, total solid content and SCS) and milk yield of 305 d, 10 SNPs were selected from exon area based on the results of DNA sequencing of 15 Chinese Holstein cows in an initial study and genotyped by Sequenom MassARRAY Genotype technology, the association between SNPs or haplotype and SCS and milk yield traits were analyzed by the least squares method in the GLM procedure of SAS8.1.【Result】The results showed that the 10 SNPs were polymorphic, and 9 SNPs were in Hardy-Weinberg equilibrium. Association analysis results showed that two SNPs ingene (T98741711C and G98736141A) had a highly significant association with milk yield of 305 d in Xinjiang brown cattle(＜0.001), the milk yield of TT and GG genotype was the highest in T98741711C locus and G98736141A locus, respectively; C45667492G locus ingene had a significant association with milk lactose percentage (＜0.005), GG genotype was the highest;(T14533269A) had a significant association with milk fat percentage and total solid content(＜0.005) and had a highly significant association with SCS(＜0.001), milk fat percentage of TT genotype was the highest and SCS of AA genotype was higher than AT and TT genotypes;(C26758055G) had a highly significant association with milk protein percentage and total solid content(＜0.001), GG genotype was higher than CC and GC genotypes. The results of linkage disequilibrium analysis and haplotype construction revealed that the 10 SNPs constructed two haplotype blocks, among them, SNP1 and SNP2 were in linkage disequilibrium state(0.3＜2＜0.6), SNP4 and SNP10 in strong linkage disequilibrium state(2＞0.6). Then the correlation between haplotype and SCS and/or milk production traits was analyzed, and the results showed that haplotype had no significant association with SCS and milk production traits(＞0.001).【Conclusion】In this study, it was found that,,andgenes had a significant association with SCS and milk production traits, and the results of the study will provide a theoretical basis and reference for the molecular marker-assisted selection in Xinjiang Brown Cattle.

Xinjiang Brown Cattle; SCS; milk production traits; MassArray; association analysis

2016-11-03；接受日期：2017-04-28

“十二五”國家科技支撐計劃（2011BAD28B02）、現代農業（奶牛）產業技術體系建設專項資金（CARS-37）

劉麗元，E-mail：729124817@qq.com。通信作者黃錫霞，E-mail：au-huangxixia@163.com。通信作者王雅春，E-mail：wangyachun@cau.edu.cn