牦牛CCND2基因的克隆及其在不同發(fā)情時(shí)期卵巢中的表達(dá)

石仙，熊顯榮，蘭道亮，陳偉明，胡嘉嘉，蔡雯祎，李鍵

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牦牛CCND2基因的克隆及其在不同發(fā)情時(shí)期卵巢中的表達(dá)

石仙1，熊顯榮1，蘭道亮2，陳偉明1，胡嘉嘉1，蔡雯祎1，李鍵1

（1西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都610041；2西南民族大學(xué)青藏高原研究院，成都610041）

【目的】研究牦牛細(xì)胞周期蛋白D2（Cyclin D2, CCND2）基因序列特征及其在牦牛不同發(fā)情時(shí)期卵巢中的表達(dá)。【方法】以牦牛為研究對(duì)象，提取卵巢的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA，根據(jù)GenBank中黃牛CCND2的mRNA序列（GenBank登錄號(hào)：NM_001076372.1），使用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物。應(yīng)用PCR方法對(duì)CCND2基因擴(kuò)增克隆，并測(cè)序獲得CCND2基因完整的CDS區(qū)序列及部分5′端和3′端UTR區(qū)。使用Protparam、SOPMA、SWISS-MODEL及SMART分別對(duì)牦牛CCND2蛋白的理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，并進(jìn)行同源性分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建，利用半定量PCR方法對(duì)CCND2基因在牦牛各組織中的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)；同時(shí)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析CCND2基因在牦牛不同發(fā)情時(shí)期（卵泡期、紅體期、黃體期）卵巢中的相對(duì)表達(dá)量。【結(jié)果】克隆獲得牦牛CCND2基因序列為909 bp，其中包含可編碼289個(gè)氨基酸殘基的長為870 bp的CDS區(qū)。與黃牛相比，牦牛CCND2的CDS區(qū)存在5個(gè)堿基突變，導(dǎo)致其中一個(gè)氨基酸改變。牦牛CCND2基因CDs序列與野牦牛、黃牛、印度水牛、綿羊、野豬、馬、家犬、貓、人類的進(jìn)行比對(duì)同源性分別是99.54%、99.31%、99.31%、98.16%、94.81%、90.46%、90.80%、91.49%、88.62%，物種之間同源性較高，與進(jìn)化樹分析顯示的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近一致，表明CCND2基因編碼區(qū)在進(jìn)化中較為保守。對(duì)CCND2蛋白預(yù)測(cè)分析知牦牛CCND2基因編碼蛋白的分子式為C1445H2315N377O440S18，相對(duì)分子質(zhì)量約為32.59kD，理論等電點(diǎn)為4.75，總平均親水性為-0.107，不穩(wěn)定指數(shù)為44.56，屬親水不穩(wěn)定的酸性蛋白，該蛋白無跨膜區(qū)和信號(hào)肽；二級(jí)結(jié)構(gòu)主要包含α-螺旋和無規(guī)卷曲，且與三級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果一致。蛋白含位于第26—152位氨基酸處的Cyclin_N和位于第154—257位氨基酸處的Cyclin_C兩個(gè)結(jié)構(gòu)域。CCND2 基因在牦牛各組織中均有表達(dá)，其中在胃、卵巢和腦中表達(dá)相對(duì)較高；qRT-PCR結(jié)果顯示在牦牛不同發(fā)情時(shí)期卵巢中CCND2 mRNA均有表達(dá)，且卵泡期卵巢中的表達(dá)水平最高（＜0.01），在紅體期和黃體期卵巢中表達(dá)水平無差異（＞0.05）。【結(jié)論】成功獲得了牦牛CCND2基因的CDS區(qū)全長序列和組織表達(dá)譜，對(duì)其進(jìn)行生物信息分析及蛋白功能結(jié)構(gòu)分析為該基因在牦牛繁殖調(diào)控中的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)；在牦牛不同發(fā)情時(shí)期卵巢中CCND2 mRNA表達(dá)水平存在差異，可能與卵泡發(fā)育過程中顆粒細(xì)胞增殖分化、卵泡發(fā)生波及卵巢內(nèi)分泌有關(guān)，為進(jìn)一步研究牦牛卵巢發(fā)育機(jī)制及改善牦牛繁殖效率提供了基礎(chǔ)資料。

牦牛；CCND2；克隆；發(fā)情周期；卵巢；表達(dá)

0 引言

【研究意義】牦牛（）是中國青藏高原及其周圍海拔3 000 m以上高原地區(qū)的重要牛種，能夠很好地適應(yīng)高寒、缺氧的生態(tài)環(huán)境，素有“高原之舟”之稱。牦牛為當(dāng)?shù)鼐用裉峁┤狻⒛獭⒚⑵ぁ⒁哿Α⑷剂系炔牧希钱?dāng)?shù)啬撩褓囈陨娴纳钌a(chǎn)資料。然而牦牛性成熟晚，繁殖和生長性能低下，牦牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展還很有限。雖然牦牛育種改良取得一定的進(jìn)展，但總體仍十分落后[1]。細(xì)胞周期蛋白D（Cyclin Ds，CCNDs）在細(xì)胞周期進(jìn)程中起著重要的作用，是G1期轉(zhuǎn)入S期的限速因子，主要介導(dǎo)細(xì)胞外的信號(hào)分子與細(xì)胞有絲分裂周期之間的傳導(dǎo)，通過與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4/6（cyclin-dependent kinase，CDK4/6）結(jié)合并激活其活性復(fù)合物磷酸化下游的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（retinoblastoma protein，RB），進(jìn)而釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，啟動(dòng)細(xì)胞的DNA復(fù)制[2-4]。CCNDs家族的首次分離是由MOTOKURA等在甲狀旁腺癌的研究中獲得的，包括3個(gè)亞型，即CCND1/CCND2和CCND3[5]。在卵巢中，CCND2主要在顆粒細(xì)胞中表達(dá)，且作為促卵泡素（follicle-Stimulating hormone，F(xiàn)SH）的下游因子之一在卵泡的發(fā)育過程中促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖[6-7]。SHIMIZU等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在牛卵泡不同發(fā)育階段中，雌激素活躍階段及排卵前卵泡中顆粒細(xì)胞CCND2的表達(dá)水平都較CCND1、CCND3的表達(dá)水平高，并且與卵泡顆粒細(xì)胞增殖密切相關(guān)。顆粒細(xì)胞的增殖、分化及黃體化在卵泡的正常生長、優(yōu)勢(shì)卵泡選擇、排卵、黃素化及胚胎著床和發(fā)育起著非常重要的作用[9]。研究發(fā)現(xiàn)通過正向調(diào)節(jié)CCND2的表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，從而加速顆粒細(xì)胞增殖；相反，下調(diào)CCND2的表達(dá)，顆粒細(xì)胞的增殖被抑制[10-11]。因此，對(duì)牦牛CCND2基因的研究為進(jìn)一步探討其在牦牛生殖中的作用具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】早期研究中CCND2作為致癌基因，主要在癌癥的發(fā)生發(fā)展機(jī)制中研究較多，如胃癌[12]等。近幾年研究發(fā)現(xiàn)CCND2參與免疫應(yīng)答，通過調(diào)控淋巴細(xì)胞T和B細(xì)胞周期控制其增殖[13]。CCND2過表達(dá)會(huì)促使乙肝病毒復(fù)制，猜想通過CCND2抑制劑可對(duì)乙肝病毒感染進(jìn)行治療[14]。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)CCND2基因在生殖中也具有非常重要的作用。一方面CCND2作為致癌基因，它的過表達(dá)與男性睪丸生殖細(xì)胞腫瘤和女性顆粒細(xì)胞腫瘤、多囊性卵巢綜合征的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[15-17]。另一方面CCND2基因的表達(dá)與卵泡發(fā)育、排卵、黃體化及胚胎發(fā)育等密切相關(guān)。研究表明抑制有絲分裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）途徑會(huì)使CCND2表達(dá)下調(diào)，降低了生殖細(xì)胞的自我更新能力[18]；相反，CCND2高表達(dá)則可調(diào)控原始生殖細(xì)胞的自我更新[19]。LEI等[9]在研究中發(fā)現(xiàn)，水牛顆粒細(xì)胞中CCND2的表達(dá)影響顆粒細(xì)胞周期進(jìn)行，從而影響優(yōu)勢(shì)卵泡的選擇和排卵。另有研究發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠CCND2基因其顆粒細(xì)胞的增殖將會(huì)受損，致使卵泡發(fā)育受到阻滯，表現(xiàn)出小卵泡狀態(tài)，即不能生成成熟卵泡而無排卵現(xiàn)象[6]。CCND2在顆粒細(xì)胞的增殖過程中作為激素調(diào)節(jié)的媒介，當(dāng)垂體被切除時(shí)，CCND2表達(dá)水平很低，顆粒細(xì)胞對(duì)FSH等激素介導(dǎo)的促增殖反應(yīng)缺乏，卵泡發(fā)育障礙，從而雌性小鼠不孕[20]。WIANNY等[21]研究表明在胚胎附植前后的增殖和分化中CCND2出現(xiàn)上調(diào)。【本研究切入點(diǎn)】目前針對(duì)CCND2基因在生殖方面的研究主要集中在人和小鼠上，在牦牛上的研究尚未見報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過RT-PCR等技術(shù)，克隆得到包含完整CDs區(qū)序列的牦牛CCND2基因，并對(duì)該基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析及蛋白功能結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析；應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)牦牛不同發(fā)情時(shí)期（卵泡期、紅體期和黃體期）卵巢中該基因的表達(dá)水平，為進(jìn)一步研究牦牛CCND2基因及其在牦牛卵巢發(fā)育過程中的作用提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

試驗(yàn)樣品采自四川成都青白江區(qū)向陽鎮(zhèn)屠宰場(chǎng)，試驗(yàn)動(dòng)物為健康的空懷期成年母牦牛，屠宰后立即無菌采集牦牛心臟、肝臟、肺、腎臟、小腸、腦、胃、脾、肌肉和卵巢10個(gè)組織；另外屠宰后立即用無菌剪刀采集卵泡期卵巢、紅體期卵巢和黃體期卵巢，所有樣品放入已編號(hào)的凍存管中，迅速將其投入液氮中保存。

Trizol Reagent購自Invitrogen（美國）公司，PrimeScriptTMRT Reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Premix TapTMDNA聚合酶、pMDTM19-T載體、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒均購自TaKaRa（大連）公司，DNA膠回收試劑盒購自Axygen（北京）公司，DNA Marker、感受態(tài)細(xì)胞DH5α均購于天根生化科技（北京）有限公司，其他無特殊說明均為國產(chǎn)分析純生化試劑。

試驗(yàn)在西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院細(xì)胞胚胎與工程實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，試驗(yàn)時(shí)間為2015年11月至2016年4月。

1.2 總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄

采用Trizol法和液氮研磨法提取樣本總RNA，應(yīng)用核酸分析儀測(cè)其純度和濃度，OD值在1.8—2.0之間符合要求。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT Reagent Kit說明書以O(shè)ligo(dT)為引物對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，分別編號(hào)后-20℃保存。

1.3 牦牛CCND2基因的擴(kuò)增克隆

根據(jù)NCBI中已報(bào)道的黃牛（）CCND2的mRNA序列（GenBank登錄號(hào)：NM_001076372.1），使用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物（表1），由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。以牦牛卵巢cNDA為模板，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增牦牛CCND2基因CDS區(qū)序列。PCR反應(yīng)體系為25 μL：cNDA 1.0 μL，Premix TaqTMDNA聚合酶12.5 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各1.0 μL，最后ddH2O 9.5 μL補(bǔ)至總體積25 μL；PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)，72℃再延伸7 min。用15 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶后，根據(jù)DNA膠回收試劑盒說明書切膠回收目的DNA，然后將回收產(chǎn)物與pMDTM19-T載體16℃條件下連接過夜后轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，并均勻涂于已制備好的LB固體培養(yǎng)基（AMP+）平板上，37℃培養(yǎng)過夜后挑取白色單菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基（AMP+）中搖床培養(yǎng)6 h，菌液PCR鑒定，結(jié)果為陽性的克隆菌液送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.4 牦牛CCND2基因的生物信息分析

利用NCBI中ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih. gov/gorf/gorf.html）對(duì)獲得CCND2序列進(jìn)行開放閱讀框分析，并獲得氨基酸序列，同時(shí)進(jìn)行氨基酸相似性比對(duì)；利用在線軟件ExPASY（http://www.expasy.org/ proteomics）工具包中Protparam、ProtScale、SignalP、TMHMM、NetPhos、NetOGlyc、NetNGlyc、SOPMA、SWISS-MODEL及SMART分別對(duì)牦牛CCND2蛋白的理化性質(zhì)、疏水性、信號(hào)肽、跨膜區(qū)、磷酸化位點(diǎn)、O-糖基化位點(diǎn)、N-糖基化位、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)分析；利用MEGA 5.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建。

表1 引物信息

F：正向引物；R：反向引物

F: Sense primer; R: Antisense primer

1.5 牦牛CCND2基因組織表達(dá)譜

根據(jù)該研究克隆得到的CCND2較保守的ORF序列，采用（GenBank登錄號(hào)：AC000162.1）為內(nèi)參基因，利用Primer 5.0軟件分別設(shè)計(jì)引物（表1），送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行合成。利用半定量PCR檢測(cè)牦牛各組織中CCND2基因的表達(dá)，反應(yīng)體系25 μL：Premix TaqTMDNA聚合酶12.5 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各1.0 μL，各組織cNDA模板1.0 μL，最后ddH2O 9.5 μL補(bǔ)至25 μL；PCR反應(yīng)條件為：94℃4 min，94℃45 s，60℃30 s,72℃30 s，40個(gè)循環(huán)，最后72℃7 min。15 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。

1.6 牦牛CCND2基因在不同發(fā)情時(shí)期卵巢中的表達(dá)

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR, qRT-PCR）檢測(cè)CCND2基因在牦牛卵泡期、紅體期和黃體期卵巢中的表達(dá)。qRT-PCR反應(yīng)體系為15 μL：SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ7.5 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各0.5 μL，cNDA 1.0 μL，最后ddH2O 5.5 μL補(bǔ)至15 μL；PCR擴(kuò)增條件為：95℃3 min，95℃10 s，60℃30 s, 共40個(gè)循環(huán)。引物見表1，每個(gè)樣本進(jìn)行3次重復(fù)。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

定量分析以卵泡期卵巢的Ct值為對(duì)照來計(jì)算，用2-△△Ct方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SD）表示，最后采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行顯著性分析，＜0.05則為差異顯著，＜0.01則為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 牦牛CCND2基因CDS克隆測(cè)序

經(jīng)RT-PCR方法擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得和預(yù)期目的基因CCND2片段大小一致的單一清晰條帶（圖1），進(jìn)一步克隆測(cè)序驗(yàn)證獲得牦牛CCND2基因核苷酸序列為909 bp，包括5′端非編碼區(qū)5 bp，可編碼289個(gè)氨基酸的CDS區(qū)870 bp和3′端非編碼區(qū)34 bp。

M：DL2000 DNA marker；1：PCR 產(chǎn)物；2：陰性對(duì)照（ddH2O）

2.2 牦牛與黃牛CCND2基因核苷酸和氨基酸的比對(duì)

利用NCBI在線軟件BLAST將牦牛CCND2測(cè)定序列（CDS區(qū)及部分5′端和3′端非編碼區(qū)）與黃牛的（GenBank登錄號(hào)：NM_001076372.1）相應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì)顯示，同源性為99%，且測(cè)序所得牦牛CCND2基因序列共被檢測(cè)到9個(gè)堿基突變，其中5個(gè)出現(xiàn)在CDS區(qū)，導(dǎo)致的密碼子變化GAG→GAA、CTG→TCT、GTA→GTG，第二個(gè)密碼子改變使得編碼區(qū)第3位氨基酸變化L→S；4個(gè)在3′-UTR區(qū)，導(dǎo)致的密碼子變化ATG→TGG、GGA→AGG，分別使得氨基酸變化M→W、G→R。

2.3 物種間CCND2基因同源性比較及進(jìn)化樹構(gòu)建

利用DNAMAN軟件將克隆測(cè)序所得的牦牛CCND2基因CDS區(qū)序列與野牦牛（XM_005897940.2）、黃牛（NM_001076372.1）、印度水牛（XM_006069006.1）、綿羊（NM_001127290.1）、野豬（NM_214088.1）、馬（NM_001309189.1）、家犬（XM_849493.4）、貓（XM_003988283.3）、人類（BT019847.1）的進(jìn)行比對(duì)，同源性都較高，分別是99.54%、99.31%、99.31%、98.16%、94.81%、90.46%、90.80%、91.49%、88.62%。使用MEGA 5.0軟件對(duì)10個(gè)物種的CCND2 基因編碼區(qū)序列構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，結(jié)果表明，CCND2基因CDS區(qū)核苷酸具有很高的保守性，牦牛與野牦牛CCND2基因的親緣關(guān)系最近，其次是黃牛、綿羊、野豬等（圖2）。

圖2 不同物種間的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4 CCND2蛋白理化性質(zhì)

采用ExPASY中Protparam在線工具對(duì)該蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，該蛋白分子式C1445H2315N377O440S18，相對(duì)分子質(zhì)量為32.59kD，理論等電點(diǎn)為4.75，總原子數(shù)是4 595，帶負(fù)電殘基數(shù)（Asp + Glu）為44，帶正電殘基數(shù)（Arg + Lys）為28。出現(xiàn)頻率較高的氨基酸殘基有Leu（13.8%）、Glu（8.0%）、Ala（7.3%）、Asp（7.3%），且不包括Pyl和Sec。總平均親水性為-0.107＜0，脂肪系數(shù)為101.56，估計(jì)哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞(體外)半衰期是30 h，不穩(wěn)定指數(shù)為44.56。綜上推測(cè)該蛋白質(zhì)可能是親水不穩(wěn)定的酸性蛋白。

2.5 CCND2蛋白結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測(cè)

疏水性預(yù)測(cè)分析，CCND2蛋白親水性分值在第263位最小為-3.022，第104位最大為2.689，且較大多數(shù)氨基酸殘基具有親水性，推測(cè)該蛋白是親水性蛋白，與所分析的蛋白理化性質(zhì)結(jié)果一致。跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽分析顯示，牦牛CCND2蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽。蛋白修飾磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，該蛋白有絲氨酸（Ser）位點(diǎn)11個(gè)，蘇氨酸（Thr）位點(diǎn)6個(gè)和絡(luò)氨酸（Tyr）位點(diǎn)1個(gè)。糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，該蛋白不存在N-糖基化和O-糖基化位點(diǎn)。CCND2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)知，171個(gè)α-螺旋占59.17%，17個(gè)β-折疊占5.88%，75個(gè)無規(guī)卷曲占25.95%，26個(gè)延伸鏈占9.00%（圖3）。可推測(cè)α-螺旋和無規(guī)卷曲為該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要的組成元件，這與三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示的結(jié)果相符（圖4）。對(duì)該蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白包括2個(gè)結(jié)構(gòu)域。其中Cyclin_N domain為第26—152氨基酸；Cyclin_C domain為154-257氨基酸（圖5）。

圖3 牦牛CCND2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)

2.6 牦牛CCND2基因的組織表達(dá)分析

以為內(nèi)參基因，采用半定量RT-PCR方法，研究牦牛CCND2基因在心臟、肝臟、肺、腎臟、小腸、腦、胃、脾臟、肌肉和卵巢組織中的表達(dá)情況，結(jié)果表明，在牦牛各組織中CCND2基因廣泛表達(dá)，但仍存在差異，其中該基因在胃、腦、卵巢中的表達(dá)相對(duì)較高，肝臟、肺、腎臟、脾臟、肌肉中的表達(dá)次之，心臟和小腸中表達(dá)的相對(duì)較低（圖6）。

2.7 牦牛不同發(fā)情時(shí)期卵巢CCND2基因的表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果顯示，CCND2基因mRNA在牦牛不同發(fā)情時(shí)期卵巢中均有表達(dá)（圖7），其中卵泡期的表達(dá)水平極顯著高于紅體期和黃體期（＜0.01），而紅體期和黃體期中CCND2 mRNA表達(dá)水平無顯著差異（＜0.05）。

圖4 牦牛CCND2蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖5 牦牛CCND2蛋白的結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

1.心臟；2.肝臟；3.肺；4.腎臟；5.小腸；6.腦；7.胃；8.脾臟；9.肌肉；10.卵巢

誤差線上不同的字母表示差異極顯著（P＜0.01）

3 討論

目前，國內(nèi)外針對(duì)CCND2在牦牛上的研究仍未見報(bào)道。本試驗(yàn)首次從牦牛卵巢中成功克隆獲得牦牛CCND2基因，其中包含完整CDS區(qū)的核苷酸序列。與黃牛對(duì)比，發(fā)現(xiàn)編碼區(qū)存在5個(gè)堿基突變，導(dǎo)致氨基酸序列第3位發(fā)生改變，但這種氨基酸的突變是否導(dǎo)致該蛋白的生殖功能差異有待進(jìn)一步研究。同源性分析發(fā)現(xiàn)，該基因與野牦牛、黃牛、綿羊、野豬等的同源性較高，與進(jìn)化樹分析結(jié)果的親緣關(guān)系相符，說明牦牛CCND2基因編碼區(qū)在長期進(jìn)化中具有較高的保守性。

早期WIANNY等[21]發(fā)現(xiàn)，不同的器官和組織中CCND2都有其特異的表達(dá)。本試驗(yàn)中通過半定量RT-PCR對(duì)CCND2基因的組織表達(dá)分析得知，該基因mRNA在牦牛各組織中普遍表達(dá)，這與WIANNY等的研究結(jié)果相似。但各組織間CCND2基因轉(zhuǎn)錄水平差異是否影響翻譯蛋白的表達(dá)水平，從而影響各組織功能的改變有待進(jìn)一步研究，尤其在卵巢中的高表達(dá)提示CCND2基因可能在牦牛生殖中發(fā)揮重要作用。

哺乳動(dòng)物性成熟以后，卵巢就是一個(gè)動(dòng)態(tài)發(fā)育器官，每一個(gè)發(fā)情周期中卵巢上的卵泡都進(jìn)行周期性的生長發(fā)育、排卵、紅體形成、黃體形成及退化的過程，即卵泡期和黃體期的交替變換過程。而在這個(gè)過程中卵泡膜細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞以及顆粒細(xì)胞產(chǎn)生許多因子和激素，周期性地調(diào)節(jié)卵細(xì)胞的發(fā)育[22-23]。有研究表明顆粒細(xì)胞的增殖、分化和凋亡在卵泡發(fā)育、排卵、閉鎖及黃素化中起著重要作用[24-25]。CCND2基因在卵巢發(fā)育中主要表達(dá)于顆粒細(xì)胞中，脊椎動(dòng)物中屬G1期周期蛋白，主要調(diào)控細(xì)胞周期中G1期及G1期向S期的過渡，正性調(diào)節(jié)著細(xì)胞周期的進(jìn)程[2,9]。為了進(jìn)一步研究牦牛CCND2基因在生殖中的作用，本試驗(yàn)使用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)了該基因在牦牛不同發(fā)情時(shí)期卵巢中的表達(dá)差異。結(jié)果指出，CCND2 mRNA在卵泡期、紅體期和黃體期卵巢中均有表達(dá)，但在卵泡期卵巢中的表達(dá)水平極顯著地高于其他兩個(gè)發(fā)情時(shí)期卵巢中的表達(dá)。HAMEL等[26]研究發(fā)現(xiàn)在卵泡發(fā)育的竇卵泡階段，隨著卵泡腔形成顆粒細(xì)胞加速增殖，分化形成卵丘細(xì)胞（cumulus cells，CCs）和壁顆粒細(xì)胞（mural granulose cells，MGCs）。組織學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，CCND2在小鼠卵巢各級(jí)卵泡中顆粒細(xì)胞均有表達(dá)，并且在顆粒細(xì)胞快速增殖的竇前卵泡中表達(dá)較多[27]；在竇卵泡階段，CCND2表達(dá)內(nèi)化，即主要在CCs和MGCs內(nèi)層表達(dá)，并且隨著卵泡不斷生長發(fā)育，顆粒細(xì)胞中CCND2表達(dá)增加[6,28]。在卵泡期即卵泡排卵前時(shí)期，CCND2的高表達(dá)可能與卵泡發(fā)育中顆粒細(xì)胞的快速增殖分化有關(guān)。在紅體期即卵泡排卵后，一方面成熟卵泡CCs及小部分MGCs隨卵母細(xì)胞直接排出卵泡腔[29]；另一方面較多顆粒細(xì)胞周期發(fā)生停滯，大量細(xì)胞凋亡，大部分的從屬卵泡隨之發(fā)生閉鎖[30]。因此，在卵泡期和黃體期之間的過渡期，即紅體期卵巢中CCND2表達(dá)會(huì)出現(xiàn)明顯下降。之后卵巢進(jìn)入黃體期，一方面卵巢中成熟卵泡排卵后顆粒細(xì)胞以快速黃體化為主，增殖減緩，形成粒黃體細(xì)胞；卵泡膜細(xì)胞快速增殖分化，形成小黃體[31-32]。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)在黃體形成小黃體中CCND2的表達(dá)明顯高于粒黃體細(xì)胞中的表達(dá)[33]。由此可見，CCND2與黃體細(xì)胞的增殖和卵巢黃體化密切相關(guān)；另一方面由于每個(gè)發(fā)情周期存在2—3個(gè)卵泡波，在最后一個(gè)卵泡波的優(yōu)勢(shì)卵泡排卵后，卵巢上又有新的卵泡開始發(fā)育，進(jìn)入第一個(gè)卵泡波[34]。所以在黃體期卵巢中CCND2的表達(dá)較紅體期增加而較卵泡期時(shí)顯著降低的原因可能是顆粒細(xì)胞黃體化及新的卵泡發(fā)育緩慢且大多數(shù)處于卵泡波的征集期和選擇期。由此說明牦牛CCND2基因參與牦牛發(fā)情周期的調(diào)控。

卵巢內(nèi)促性腺激素和類固醇激素對(duì)雌性哺乳動(dòng)物的發(fā)情周期有著重要的影響[35-37]。在卵泡發(fā)育早期階段，卵巢通過“雙細(xì)胞-雙促性腺激素”模式合成雌激素和雄激素，即在FSH作用下顆粒細(xì)胞合成雌激素，促黃體素（luteinizing hormone，LH）作用下膜細(xì)胞合成雄激素[32]。HERNANDEZ-GONZALEZ等[38]研究發(fā)現(xiàn)CCND2在顆粒細(xì)胞中的表達(dá)與排卵前促性腺激素峰值有關(guān)。李泰云等[39]發(fā)現(xiàn)FSH受體在發(fā)情期中高表達(dá)，LH受體在發(fā)情后期中高表達(dá)。在母牛的發(fā)情周期中FSH在卵泡波前出現(xiàn)波峰，刺激小卵泡的募集，之后濃度降低刺激優(yōu)勢(shì)卵泡的選擇和發(fā)育，并且隨著發(fā)育的進(jìn)行，小卵泡則會(huì)因不能利用低濃度FSH使其不斷減少和閉鎖[40]。卵泡發(fā)育中CCND2作為調(diào)節(jié)激素的媒介之一，F(xiàn)SH和雌二醇（estradiol，E2）通過cAMP/PKA（cyclin adenosine monophosphate/ protein kinase A）誘導(dǎo)CCND2的表達(dá)，加速顆粒細(xì)胞的增殖[20]。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)首次從牦牛成功克隆獲得了CCND2基因全長870 bp的CDS和部分非編碼區(qū)序列。CCND2基因編碼區(qū)在生物進(jìn)化中具有很高的保守性。牦牛CCND2 mRNA廣泛表達(dá)在各組織中，其中胃、腦、卵巢中的表達(dá)相對(duì)較高。CCND2基因在不同發(fā)情周期卵巢中的表達(dá)水平可能與卵泡發(fā)育過程中顆粒細(xì)胞的增殖、凋亡、黃素化及卵巢的內(nèi)分泌有關(guān)。研究結(jié)果為進(jìn)一步探索CCND2基因?qū)﹃笈Ｉ匙饔玫挠绊憴C(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

References

[1] 蘭道亮, 熊顯榮, 位艷麗, 徐通, 鐘金城, 字向東, 王永, 李鍵. 基于RNA-Seq 高通量測(cè)序技術(shù)的牦牛卵巢轉(zhuǎn)錄組研究:進(jìn)一步完善牦牛基因結(jié)構(gòu)及挖掘與繁殖相關(guān)新基因. 中國科學(xué), 2014, 44(3): 307-317.

LAN D L, XIONG X R, WEI Y L, XU T, ZHONG J C, ZI X D, WANG Y, LI J. RNA-Seq analysis of yak ovary: improving yak gene structure information and mining reproduction-related genes., 2014, 44(3): 307-317. (in Chinese)

[2] MALUMBRES M, BARBACID M. Cell cycle, CDKs and cancer: a changing paradigm.2009, 9(3): 153-166.

[3] ZHANG Q, SAKAMOTO K, WAGNER K U. D-type cyclins are important downstream effectors of cytokine signaling that regulate the proliferation of normal and neoplastic mammary epithelial cells.2014, 382(1): 583-559.

[4] COQUERET O. Linking cyclins to transcriptional control., 2002, 299(1/2): 35-55.

[5] MOTOKURA T, BLOOM T, KIM H G, JüPPNER H, RUDERMAN J V, KRONENBERG H M, ARNOLD A. A novel cyclin encoded by a bcl1-linked candidate oncogene., 1991, 350 (6318): 512-515.

[6] SICINSKI P, DONAHER J L, GENG Y, PARKER S B, GARDNER H, PARK M Y, ROBKER R L, RICHARDS J S, MCGINNIS L K, BIGGERS J D, EPPIG J J, BRONSON R T, ELLEDGE S J, WEINBERG R A. Cyclin D2 is an FSH-responsive gene involved in gonadal cell proliferation and oncogenesis., 1996, 384(6608): 470-474.

[7] PARK Y, MAIZELS E T, FEIGE Z J, ALAM H, PETERS C A, WOODRUF T K, UNTERMAN T G, LEE E J, JAMESON J L, HUNZICKER-DUN M. Induction of cyclin D2 in rat granulosa cells requires FSH-dependent relief from FOX01 repression coupled with positive signals from Smad., 2005, 280(10): 9135-9148.

[8] SHIMIZU T, HIRAI Y, MIYAMOTO A. Expression of cyclins and cyclin-dependent kinase inhibitors in granulosa cells from bovine ovary., 2013, 48(5): e65-e69.

[9] LEI X C, CUI K Q , LI Z P, SU J, JIANG J R, ZHANG H H, LIU Q Y, SHI D. BMP-1 participates in the selection and dominance of buffalo follicles by regulating the proliferation and apoptosis of granulosa cells., 2016, 85(5): 999-1012.

[10] SUMMERS A F, POHLMEIER W E, SARGENT K M, COLE B D, VINTON R J, KURZ S G, MCTEE R M, CUSHMAN R A, CUPP A S, WOOD J R. Altered theca and cumulus oocyte complex gene expression, follicular arrest and reduced fertility in cows with dominant follicle follicular fluid androgen excess.2014, 9(10):e110683.

[11] ZHANG Q, SUN H X, JIANG Y, DING L J, WU S G, FANG T, YAN G J, HU Y L. MicroRNA-181a suppresses mouse granulosa cell proliferation by targeting activin receptor IIA., 2013, 8 (3): e59667.

[12] OSHIMO Y, NAKAYAMA H, ITO R, KITADAI Y, YOSHIDA K, CHAYAMA K, YASUI W. Promoter methylation of cyclin D2 gene in gastric carcinoma.. 2003, 23(6): 1663-1670.

[13] MORITO N, YOH K, MAEDA A, NAKANO T, FUJITA A, KUSAKABE M, HANADA M, KUDO T, YAMAGATA K, TAKAHASHI S. A novel transgenic mouse model of the human multiple myeloma chromosomal translocationt.. 2011, 71(2): 339-348.

[14] SONG C L, REN J H, RAN L K, LI Y G, LI X S, CHEN X, LI W Y, HUANG A L, CHEN J. Cyclin D2 plays a regulatory role in HBV replication., 2014, 8(462/463): 149-157.

[15] CHAGANTI R S, HOULDSWORTH J. Genetics and biology of adult human male germ cell tumors., 2000, 60(6): 1475-1482.

[16] ANTTONEN M, PIHLAJOKI M, ANDERSSON N, GEORGES A, LHOTO D, VATTULAINEN S, FARKKILA A, UNKILA-KALLIO L, VEITIA R A, HEIKINHEIMO M. FOXL2, GATA4 and SMAD3 co-operatively modulate gene expression, cell viability and apoptosis in ovarian granulosa cell tumor cells., 2014, 9(1): e85545.

[17] SHAFIEE M N, MALIK D A, YUNOS R I, ATIMO W, OMAR M H, GHANI N A, HATTA A Z, SEEDHOUSE C, Chapman C, MOKHTAR N M. The effect of Metformin on endometrial tumor-regulatory genes and systemic metabolic parameters in polycystic ovarian syndrome--a proof-of-concept study., 2015, 31(4): 286-290.

[18] SAHARE M, OTOMO A, KOMATSU K, MINAMI N, YAMADA M, IMAI H. The role of signaling pathways on proliferation and self-renewal of cultured bovine primitive germ cells., 2015,14(1): 17-25.

[19] LEE J, KANATSU-SHINOHARA M, MORIMOTO H, KAZUKI Y, TAKASHIMA S. Genetic reconstruction of mouse spermatogonial stem cell self-renewal in vitro by Ras-cyclin D2 activation., 2009, 5(1): 76-86.

[20] ROBKER R L, RIEHARDS J S. Hormone-induced proliferation and differentiation of granulose cells: a coordinated balance of the cell cycle regulators cyclin D2 and p27Kipl., 1998, 12(7): 924-940.

[21] WIANNY F, REAL F X, MUMMERY C L, VAN-ROOIJEN M, LAHTI J, SAMARUT J, SAVATIER P. G1-phase regulators, cyclin D1,cyclin D2, and cyclin D3:up-regulation at gastrulation and dynamic expression during neurulation., 1998, 212(1): 49-62.

[22] ADAMS G P, JAISWAL R, SINGH J, MALHI P. Progress in understanding ovarian follicular dynamics in cattle., 2008, 69(1): 72-80.

[23] 鄭紅飛, 潘陽陽, 劉鵬剛, 彭秀梅, 崔燕, 余四九. 牦牛基因特征分析及其在不同發(fā)情時(shí)期卵巢中的表達(dá). 華北農(nóng)學(xué)報(bào), 2015, 30(5) : 93-99.

ZHENG H F, PAN Y Y, LIU P G, PENG X M, CUI Y, YU S J. Characteristics of yak tumor protein p53 Gene() and its expression in different periods of estrus ovaries., 2015, 30(5): 93-99. (in Chinese )

[24] MASTUDA-MINEHATA F, INOUE N, GOTO Y, MANABE N. The regulation of ovarian granulosa cell death by pro- and anti-apoptotic molecules., 2006, 52(6): 695-705.

[25] MCRAE R S, JOHNSTON H M, MIHM M, O'SHAUGHNESSY P J. Changes in mouse granulosa cell gene expression during early luteinization., 2005, 146(1): 309-317.

[26] HAMEL M, DUFORT I, ROBERT C, GRAVEL C, LEVEILLE M C, LEADER A, SIRARD M A. Identification of differentially expressed markers in human follicular cells associated with competent oocytes., 2008, 23(5): 1118-1127.

[27] SHIINA H, MATSUMOTO T, SATO T, IGARASI K, MIYAMOTO J, TAKEMASA S, SAKARI M, TAKADA I, NAKAMURA T, METZGER D, CHAMBON P, KANNO J, YOSHIKAWA H, KATO S. Premature ovarian failure in androgen receptor-deficient mice., 2006, 103(1): 224-229.

[28] NEGANOVA I, AI-QASSAB H, HEFFRON H, SELMAN C, CHOUDHURY A I, LINGARD S J, DIAKONOV I, PATTERSON M, GHATEI M, BLOOM S R, FRANKS S, HUHTANIEMII, HARDY K, WITHERS D J. Role of central nervous system and ovarian insulin receptor substrate 2 signaling in female reproductive function in the mouse., 2007, 76(6): 1045-1053.

[29] GILCHRIST R B, LANE M, THOMPSON J G. Oocyte-secreted factors: regulators of cumulus cell function and oocyte quality., 2008, 14(2):159-177.

[30] RJCHARDS J S, RUSSELL D L, OCHSNER S, ESPEY L L. Ovulation: new dimensions and new regulators of the inflammatory- like response., 2002, 64: 69-92.

[31] KAYANI A R, GLISTER C, KNIGHT P G. Evidence for an inhibitory role of bone morphogenetic protein(s) in the follicular-luteal transition in cattle., 2009, 137(1): 67-78.

[32] KWINTKIEWICE J, GIUDICE L C. The interplay of insulin-like growth factors, gonadotropins, and endocrine disruptors in ovarian follicular development and function.icine,2009, 27(1): 43-51.

[33] YOSHIOKA S, ABE H, SAKUMOTO R, OKUDA K. Proliferation of luteal Steroidogenic Cells in Cattle., 2013, 8(12): e84186.

[34] GINTHER O J, BERGFELT D R, KULICK L J, KOT K. Selection of the dominant follicle in cattle: establishment of follicle deviation in less than 8 hours through depression of FSH concentrations., 1999, 52(6): 1079-1093.

[35] 應(yīng)詩家, 彭中友, 李燕，蔡柳萍, 施振旦. 綿羊黃體期卵巢類固醇激素調(diào)節(jié)基因的表達(dá)研究. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2013, 44(11): 1775-1780.

YING S J, PENG Z Y, LI Y, CAN L P, SHI Z D. Study on ovarian sterol-regulatory genes expression in sheep during luteal phase., 2013, 44(11): 1775-1780. (in Chinese)

[36] 王鋒. 動(dòng)物繁殖學(xué). 北京: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社, 2012.

WANG F.Beijing: China Agricultural University Press, 2012. (in Chinese)

[37] HILLIER S G, WHITELAW P F, SMYTH C D. Follicular oestrogen synthesis: the 'two-cell, two-gonadotrophin' model revisited., 1994, 100(1/2): 51-54.

[38] HERMANDEZ-GONZALEZ I, GONZALEZ-ROBAYNA I, SHIMADA M, WAYNE C M, OCHSNER S A, WHITE L, RICHARDS J S. Gene expression profiles of cumulus cell oocyte complexes during ovulation reveal cumulus cells express neuronal and immune-related genes: does this expand their role in the ovulation process?, 2006, 20(6): 1300-1321.

[39] 李泰云, 韓小康, 丁彥紅, 王樹迎, 王麗, 石中強(qiáng). 沂蒙黑山羊發(fā)情周期不同階段卵巢中FSHR和LHR基因表達(dá)規(guī)律的研究. 中國獸醫(yī)科學(xué), 2011, 41(09): 954-959.

LI T Y, HAN X K, DING Y H, WANG S Y, WANG L, SHI Z Q. Expression of FSHR gene and LHR gene in the ovary of Yimeng Black goat in different stages of estrous cycle., 2011, 41(09): 954-959. (in Chinese)

[40] 葛利江, 徐常林, 石瑞青, 譚景和, 羅明久. 德州驢發(fā)情周期中卵泡動(dòng)力學(xué)和激素變化規(guī)律的研究. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2011, 42(9): 1256-1263.

GE L J, XU C L, SHI R Q, TAN J H, LUO M J. Ovarian follicular and hormonal dynamics in dezhou jenny during estrous cycle monitored by real-time ultrasonography., 2011, 42(9): 1256-1263. (in Chinese)

（責(zé)任編輯 林鑒非）

Cloning and Expression Analysis ofGene in Yak Ovaries During Different Periods of Estrus

SHI Xian1, XIONG XianRong1, LAN DaoLiang2, CHEN WeiMing1, HU JiaJia1, CAI WenYi1, LI Jian1

(1College of Life Science and Technology, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041;2College of Tibetan Plateau Research, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041)

【Objective】The aim of the study was to investigate the sequence characteristics and expression level of cyclin D2(CCND2) in yak ovary during different periods of estrus. 【Method】Total RNA of yak ovary were extracted and reverse transcribed into cDNA. Specific primers were designed according to mRNA sequence of cattle CCND2 gene in the GenBank(GenBank accession No: NM_001076372.1) by software Primer 5.0. The CDs region and part of 5′UTR and 3′UTR in yak CCND2 gene were cloned from yak ovary by polymerase chain reaction(PCR) amplification and sequencing technology. The physicochemical properties, secondary structure, tertiary structure, domain, homology were analyzed and phylogenetic tree of CCND2 was constructed by online software like Protparam, SOPMA, SWISS-MODEL and SMART. Semi-quantitative PCR was used to examine the expression profiles of CCND2 gene in different tissues. Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) was used to detect the expression level of CCND2 gene in the ovary during different periods of estrus (ovarian follicular phase, red body phase and luteal phase).【Result】The 909 bp length sequences of CCND2 gene in yak, including 870 bp length CDS region encoding 289 amino acids, were obtained. Alignment with cattle CCND2 gene CDS and amino acid, five bases mutations and one amino acid mutation were found. The CDs homology of CCND2 compared yak to wild yak, cattle, Indian buffalo, sheep, wild boar, horse, dog, cat and human was 99.54%, 99.31%, 99.31%, 98.16%, 94.81%, 90.46%, 90.80%, 91.49% and 88.62%, respectively. There was a high homology among different species, and phyletic evolution was the same as their genetic relationship. The research indicated that the CCND2 gene CDs was conservative in the course of evolution. The formula of protein encoded by CCND2 gene in yak was C1445H2315N377O440S18, and the molecular weight was 32.59 kD, the theory isoelectric point was 4.75, the grand average of hydroparthicity was -0.107, and the instability index was 44.56. It was an unstable, soluble and acidic protein without transmembrane regions and signal peptide. Random coil and α-helix were mainly in the secondary structure of CCND2, which were the same as the tertiary structure of CCND2 protein. The amino acids sequence of CCND2 contains Cyclin_N domain in the 26-152 amino acids and Cyclin_C domain in the 154-257 amino acids. The CCND2 gene was expressed in various tissues of yak, and relatively higher in stomach, ovary and brain. qRT-PCR results showed that the mRNA expression level of CCND2 in ovary of follicular phase was the highest (＜0.01), and no difference between the red body phase and luteal phase (＞0.05).【Conclusion】The complete CDs of CCND2 gene was successfully cloned and the tissues expression profiles were clarified, and its bioinformatics and encoded protein function and structure were investigated. These provide a theoretical basis for further study of CCND2 gene in regulation of yak reproduction. The different expressions of CCND2, in different periods of estrus in yak, might be related to proliferation and differentiation of granulose cells, development process of follicular wave, and ovarian endocrine. These indicated that CCND2 plays an important role during the reproductive cycle, and these results of study will provide basic information for further study on the ovarian development mechanism and improving reproductive competence in yak.

yak; CCND2; cloning; estrous cycle; ovary; expression

2016-09-09；接受日期：2017-04-28

四川省科技支撐計(jì)劃（2014NZ0114）、西南民族大學(xué)中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（2016NZYQN38）

石仙，E-mail：shixian_900824@163.com。通信作者李鍵，E-mail：lijian_1967@163.com