草甘膦對草地早熟禾愈傷組織生長及生理指標的影響

李慧萍，徐海鵬，金 寧，金小煜，牛奎舉，馬暉玲

(1.甘肅農業大學 草業學院/草業生態系統教育部重點實驗室/甘肅省草業工程實驗室/中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070； 2.甘肅農業大學 園藝學院，甘肅 蘭州 730070)

草甘膦對草地早熟禾愈傷組織生長及生理指標的影響

李慧萍1，徐海鵬1，金 寧2，金小煜1，牛奎舉1，馬暉玲1

(1.甘肅農業大學 草業學院/草業生態系統教育部重點實驗室/甘肅省草業工程實驗室/中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070； 2.甘肅農業大學 園藝學院，甘肅 蘭州 730070)

以草地早熟禾午夜Ⅱ號愈傷組織為試驗材料，采用間接接種的方法在草甘膦濃度為0、0.02、0.04、0.06、0.08和0.10 mmol/L的MS培養基上繼代培養。20 d后對愈傷組織進行存活率、相對生長率、褐化情況、電導率、丙二醛、可溶性蛋白、游離脯氨酸含量和抗氧化酶(SOD，POD和CAT)活性的測定。結果表明：愈傷組織的存活率隨草甘膦濃度的增大而逐漸下降，相對生長率呈先上升后下降的趨勢。電導率、游離脯氨酸含量及SOD，POD和CAT活性呈先上升后下降的趨勢，臨界點處的草甘膦濃度為0.04 mmol/L。丙二醛和可溶性蛋白的臨界點草甘膦濃度是0.06 mmol/L。說明草地早熟禾午夜Ⅱ號愈傷組織可耐受較小濃度的草甘膦(<0.04 mmol/L)。

草甘膦；草地早熟禾；愈傷組織；生理指標

近年來，伴隨我國經濟的迅速發展，草地綠化越來越受到政府和市民的關注。我國西北地區氣候冷涼，雜草眾多，草坪草在長勢、草齡、抗寒、抗除草劑等方面存在較多問題，不容樂觀[1]，所以我國西北地區的草坪壽命普遍較短。

草甘磷是由美國孟山都公司研制開發的一種廣譜性和非選擇性除草劑，其除草活性很強[2]，在田間使用時具有廣譜、高效，對人畜安全和無環境污染等優點[3-5]，不會影響土壤的菌落結構，能有效去除多年生雜草，對優質草種種苗的生長具有廣泛的使用價值。在草坪管理中使用草甘膦，具有清除雜草，增加經濟效益，美化環境的作用。

用離體方法來篩選抗除草劑突變體的研究愈來愈受到育種工作者的重視，體細胞無性系變異及其篩選已應用到多種農作物[6-7]。現已得到了番茄、胡蘿卜、小麥[8]、油菜[9]、棉花等多種作物的抗除草劑細胞系，部分已誘導培養成再生植株[6-7,10]。在草坪草上，Heckart等[11]通過對海濱雀稗愈傷組織進行定向篩選，獲得了具有稀禾定(Sethoxydim)抗性的再生植株。以草地早熟禾午夜Ⅱ號愈傷組織為試驗材料，通過測定其愈傷組織在不同濃度草甘膦下的生長及生理生化指標，分析不同濃度草甘膦處理下午夜Ⅱ號愈傷組織生理響應效果，以期為抗草甘膦突變體的篩選奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 愈傷組織的誘導及繼代培養

以草地早熟禾(Poapratensis)午夜Ⅱ號的種子為試驗材料，按文獻[12]的方法高壓滅菌后接種在誘導培養基上，誘導培養基成分為：MS+2,4-D(1 mg/L)+6-BA(0.3 mg/L)+3%蔗糖+0.7%瓊脂，50 d后將誘導出的愈傷組織轉入繼代培養基，繼代培養基同誘導培養基，此后每隔25～30 d繼代1次，每次繼代時去掉水漬化和褐化的愈傷組織。

1.2 草甘膦處理

經5～6次繼代培養后，挑選生長均勻、快速且疏松的愈傷組織接種于含不同濃度草甘膦(0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mmol/L)的MS培養基上，并在121℃,101.1 kPa壓力下高溫高壓滅菌26 min[13]。以草甘膦濃度0 mmol/L為空白對照，每個濃度設置3個重復。每皿接種25塊愈傷組織，并且稱取愈傷鮮重，處理20 d，取樣進行相關生理指標及生長情況的測定。

草地早熟禾午夜Ⅱ號愈傷組織相對生長率=(草甘膦處理20 d后愈傷組織重量-未處理前愈傷組織重量)/未處理前愈傷組織重量×100%。

1.3 生理指標的測定

采用電導儀法測定電導率；采用硫代巴比妥酸比色法測丙二醛含量[14]。采用考馬斯亮藍G-250染色法測可溶性蛋白含量[15]；采用茚三酮比色法測定游離脯氨酸含量；采用氮藍四唑(NBT)光化學還原反應法測SOD活性；采用氧化愈創木酚比色測POD活性；采用紫外分光光度法測CAT活性[16]。為使所測不同生理指標的材料所處狀態一致，將每次用過后剩余的愈傷組織及時放入液氮中冷凍保存。

1.4 數據處理

對所有數據采用SPSS 19.0進行單因素方差分析，數據結果采用標準誤和平均值表示，使用Excel 2010軟件進行處理及制圖。

2 結果與分析

2.1 不同濃度梯度下的草甘膦對午夜Ⅱ號愈傷組織生長的影響

不同濃度草甘膦處理后愈傷組織的生長情況各不相同。與對照相比，高濃度的草甘膦處理對愈傷組織生長的抑制效果比較強。在草甘膦濃度為0.02 mmol/L，愈傷組織的生長效果最好，但隨草甘膦濃度的繼續增大，愈傷組織的生長受到抑制作用，且程度隨草甘膦濃度的增大而增強。當草甘膦濃度>0.06 mmol/L，相對生長率變小(表1)。

愈傷組織在不含草甘磷的培養基上長勢最好，愈傷組織明顯增殖，并且產生了大量新鮮的愈傷組織。而在加有草甘膦的培養基上隨著草甘膦濃度的逐漸增加，長勢越來越差，存活率也愈來愈低。當草甘膦濃度達到0.08 mmol/L時,愈傷組織存活率僅為草甘膦濃度為0.06 mmol/L的一半，但卻為對照組的0.14倍。試驗結果表明，在對照及低草甘膦濃度處理下愈傷組織有新愈傷長出，但隨著草甘膦濃度的增大，愈傷組織長出新愈傷的能力越來越低(表2)。

表1 不同濃度草甘膦處理下愈傷組織的相對生長率Table 1 Effect of different concentrations of glyphosate on relative growth rate of callus

表2 不同濃度草甘膦處理下愈傷組織生長Table 2 Effect of different concentrations of glyphosate on callus growth

草地早熟禾午夜Ⅱ號愈傷組織接種到不同濃度的草甘膦培養基上，統計培養1、2周其愈傷組織的褐化狀況。隨著草甘膦濃度的增加和培養時間的增加，愈傷組織的褐化情況也越來越嚴重。當草甘膦濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mmol/L時，培養1周愈傷組織的褐化情況分別為對照組的2.5倍、4.5倍、5.5倍、7倍、8倍，培養2周愈傷組織的褐化情況分別為對照組的3.7倍、6.3倍、7.3倍、8倍、8倍(表3)。

表3 不同濃度草甘膦愈傷組織的褐化Table 3 Effect of different concentrations of glyphosate on callus browning rate

2.2 不同濃度梯度下的草甘膦對午夜Ⅱ號愈傷組織細胞膜相對透性的影響

電解質外滲反映了逆境脅迫下細胞膜透性增強的程度。并反映了愈傷組織在不同濃度的草甘膦處理下所對應電導率的大小。隨著草甘膦濃度的逐漸增加，愈傷組織的電導率值呈先上升后下降的趨勢，最后低于對照。當草甘膦濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mmol/L時，愈傷組織的電導率值分別為對照組的1.11倍、1.23倍、1.07倍、0.97倍、0.93倍。且與對照相比均具有顯著性差異(P<0.05)。當草甘膦濃度>0.08 mmol/L時，電導率值基本趨于穩定(圖1)。

圖1 不同濃度草甘膦處理下愈傷組織細胞膜 相對透性Fig.1 Effect of different concentrations of glyphosate on the conductivity of callus

2.3 不同濃度梯度下的草甘膦對午夜Ⅱ號愈傷組織丙二醛含量的影響

丙二醛含量的變化隨草甘膦濃度的增加呈先上升后下降的趨勢。當草甘膦濃度為0.06 mmol/L時，其丙二醛含量達到了峰值，為1.16 μmol/g FW。與對照相比，丙二醛含量在草甘膦濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mmol/L時分別為對照的1.02倍、1.04倍、1.03倍、1.00倍、0.99倍。當草甘膦濃度高于0.08 mmol/L時，丙二醛含量低于對照組(圖2)。

2.4 不同濃度梯度下的草甘膦對午夜Ⅱ號愈傷組織游離脯氨酸的影響

隨著草甘膦濃度的逐漸增加，所測愈傷組織中游離脯氨酸的含量呈先上升后下降的趨勢，但都高于對照組。當草甘膦濃度<0.04 mmol/L時，其游離脯氨酸的含量上升趨勢較快(圖3)。當草甘膦濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mmol/L時，愈傷組織游離脯氨酸含量分別為對照組的1.26倍、3.79倍、3.43倍、2.74倍、1.95倍。

圖2 不同濃度草甘膦處理下愈傷組織丙二醛的含量Fig.2 Effect of different concentrations of glyphosate on malondialdehyde content of callus

圖3 不同濃度草甘膦處理下愈傷組織 游離脯氨酸的含量Fig.3 Effect of different concentrations of glyphosate on free proline content of callus

2.5 不同濃度梯度下的草甘膦對午夜Ⅱ號愈傷組織可溶性蛋白的影響

隨草甘膦濃度的逐漸增加，不同濃度的草甘磷對愈傷組織合成可溶性蛋白的影響不同。不同濃度草甘膦處理下愈傷組織可溶性蛋白含量呈先上升后下降的趨勢，且分別為對照組的1.06倍、 1.19倍、1.20倍、1.14倍、1.11倍(圖4)，與對照相比可溶性蛋白含量的變化基本趨于穩定。

2.6 不同濃度梯度下的草甘膦對午夜Ⅱ號愈傷組織抗氧化酶活性的影響

隨著草甘膦濃度的逐漸增加，不同濃度處理下愈傷組織SOD的活性各不相同。當草甘膦濃度<0.04 mmol/L時，其愈傷組織SOD的活性隨草甘膦濃度的增加上升趨勢較明顯(圖5)。當草甘膦濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mmol/L時，愈傷組織的SOD活性分別為對照組的1.01倍、1.04倍、1.01倍、1.01倍、0.99倍。當草甘膦濃度為0.10 mmol/L時，愈傷組織SOD的活性變化與對照差異不顯著(P>0.05)。

圖4 不同濃度草甘膦處理下愈傷組織的 可溶性蛋白含量Fig.4 Effect of different concentrations of glyphosate on soluble protein content of callus

圖5 不同濃度草甘膦處理下愈傷組織的SOD活性Fig.5 Effect of different concentrations of glyphosate on SOD activity of callus

與對照相比，不同濃度的草甘膦處理后愈傷組織的POD活性均高于對照組(圖6)。愈傷組織的POD活性在草甘膦濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mmol/L時，分別為對照的1.36倍、1.72倍、1.45倍、1.14倍、1.12倍。當草甘膦濃度0.04 mmol/L時，其POD活性最高。

隨著草甘膦濃度逐漸增加，不同濃度處理下愈傷組織CAT活性高低各不相同。草甘膦濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mmol/L時，愈傷組織CAT活性分別為對照組的1.05倍、1.13倍、1.04倍、0.47倍、0.44倍。當草甘膦濃度>0.08 mmol/L時，愈傷組織CAT活性都低于對照組，與對照相比其CAT活性維持在一定的水平，其活性變化基本趨于穩定(圖7)。

圖6 不同濃度草甘膦處理下愈傷組織的POD活性Fig.6 Effect of different concentrations of glyphosate on POD activity of callus

圖7 不同濃度草甘膦處理下愈傷組織 的CAT活性Fig.7 Effect of different concentrations of glyphosate on CAT activity of callus

3 討論

3.1 不同濃度梯度下草甘膦對愈傷組織的生長的影響

通過對愈傷組織相對生長率的測定，發現不同濃度草甘膦對愈傷組織細胞的分裂生長有不同程度的抑制作用[10]。試驗研究表明，低濃度草甘膦(<0.04 mmol/L)對愈傷組織的生長有促進作用，0.04 mmol/L草甘膦處理對愈傷組織的增重效果最顯著。高濃度(>0.06 mmol/L)對愈傷組織的生長有明顯的抑制作用，并且隨著篩選濃度和繼代時間的逐漸增加，愈傷組織的生長減緩，水漬化現象和褐化現象也愈來愈嚴重，在高濃度0.10 mmol/L下繼代2周后，愈傷組織甚至部分變成黑色。說明了午夜Ⅱ號愈傷組織對低濃度的草甘膦(0.04 mmol/L)有一定的抵抗能力和耐受能力，在高濃度的草甘膦脅迫下，其生理活性喪失。

3.2 不同濃度梯度下的草甘膦對愈傷組織膜系統的損壞程度的影響

受細胞膜保護，隔離在細胞內的電解質在細胞膜受到傷害時會外泄，電解質激增會破壞細胞膜保護，植物受到逆境脅迫時細胞內代謝平衡被破壞，有利于自由基產生，過量自由基會引發或加劇膜質過氧化作用，植物膜質過氧化的產物造成生物膜系統的損傷，嚴重時會導致植物細胞的死亡[17-18]。丙二醛是膜脂過氧化的最終產物，能夠抑制細胞保護酶的活性并降低抗氧化物的含量[19]。因此，常把電導率及丙二醛作為反映膜脂過氧化程度的指標。研究表明，隨著草甘膦濃度的增大，愈傷組織電導率及丙二醛含量呈先上升后下降的趨勢，說明愈傷組織可適應低濃度的草甘膦脅迫，在高濃度處理下，隨著脅迫濃度的增加，愈傷組織的生理活性逐漸衰退甚至喪失，因而愈傷組織膜系統的受損程度沒有繼續增加。

3.3 不同濃度梯度的草甘膦對愈傷組織滲透調解物質的影響

脯氨酸、可溶性蛋白是植物體內的主要滲透調解物，能增加膜脂濃度，降低細胞冰點，防止細胞過度脫水，維持蛋白質水合度，從而減輕滲透脅迫對細胞的傷害[19]。蛋白質是植物體內重要的有機物質，通過蛋白質含量的測定，可反映出植物體生長代謝的強弱，也可通過蛋白質含量的多少反映植物光合作用能力的大小[20]。不同濃度的草甘膦對愈傷組織的滲透調解能力也有影響，其趨勢是先上升后下降。上升是因為愈傷組織能耐受較低濃度的草甘膦脅迫，所以其生長代謝能力也逐漸增強，愈傷組織通過增強滲透能力來保持水勢力。高濃度草甘膦處理下其滲透調解能力及生長代謝能力減弱，說明高濃度的草甘膦會使愈傷組織的生理活性降低甚至喪失。

3.4 不同濃度梯度的草甘膦對愈傷組織抗氧化酶活性的影響

SOD是膜脂過氧化防御系統的主要保護酶，其活性強弱與植物的抗氧化能力密切相關，該酶能夠清除超氧陰離子自由基，同時也是植物抗氧化系統的第一道防線[21]。測定植物內SOD活性可以判斷植物器官組織細胞的損傷程度，預防生物體免受超氧陰離子自由基損傷。過氧化氫酶也是植物體內一種重要的活性氧，通過其活性的變化情況也可以推測活性氧產生的情況。作為植物對不良環境脅迫相應的敏感指標之一，POD對多種生理功能起到保護作用，它可以清除植物體內大量活性氧并阻止植物體內自由基對生物大分子的質膜的破壞，能減輕細胞由于質膜過氧化作用而引起的傷害[17]。其值高低決定了植物對干旱，鹽堿，重金屬，低溫，紫外線等逆境脅迫的抵抗能力。不同草甘膦濃度處理下，SOD，POD和CAT活性總體呈先上升后下降的趨勢。酶活性上升可能是愈傷組織在低濃度草甘膦處理下增加酶活性以此來適應不良環境。當草甘膦濃度超過0.06 mmol/L時，其酶活性呈下降趨勢，可能是酶合成速率低于其分解速率，也可能是高濃度脅迫使愈傷組織喪失了其生理活性。

4 結論

通過對草甘膦脅迫下草地早熟禾午夜Ⅱ號愈傷組織的生長、抗氧化和滲透性調節能力的分析，發現0.04 mmol/L草甘膦脅迫可顯著提高草地早熟禾午夜Ⅱ號愈傷的電導率、丙二醛、可溶性蛋白、游離脯氨酸含量和抗氧化酶SOD,POD和CAT的活性，而當草甘膦濃度>0.06 mmol/L時，其電導率、丙二醛、可溶性蛋白、游離脯氨酸含量以及SOD，POD和CAT活性均呈現降低趨勢。說明午夜Ⅱ號愈傷組織可以耐受0.04 mmol/L草甘膦脅迫。因此，在篩選抗草甘膦除草劑突變體時，其草甘膦濃度應不低于0.04 mmol/L。此條件可為離體篩選草地早熟禾抗草甘膦突變體和草地早熟禾抗草甘膦新品種提供科學理論依據。

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Effect of glyphosate on growth and physiological index of kentucky bluegrass callus

LI Hui-ping1,XU Hai-peng1,JIN Ning2,JIN Xiao-yuv1,NIU Kui-ju1,MA Hui-ling1

(1.CollegeofPrataculturalScience,GansuAgriculturalUniversity/KeyLaboratoryofGrasslandEcosystem，MinistryofEducation/PrataculturalEngineeringLaboratoryofGansuProvince/Sino-U.S.CentersforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China;2.HorticulturalCollege,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China)

The callus of kentucky bluegrasses (midnight Ⅱ) was cultured on MS medium which contained different concentrations of glyphosate (0,0.02,0.04,0.06,0.08 and 0.10 mmol/L).After 20 days,the callus was exploited for measuring physiological indexes (survival rate,relative growth rate,brown case,electrical conductivity,contents of MDA,soluble protein,free proline,SOD,POD and CAT).The result showed that the survival rate of the callus gradually decreased with the increase of glyphosate,but the relative growth rate increased first and then decreased.0.04 mmol/L of glyphosate concentration was the turning point.While MDA and soluble protein of critical concentrations of glyphosate was 0.06 mmol/L.The tolerable concentration of glyphosate was 0.04 mmol/L.

glyphosate;kentucky bluegrass;callus;physiological index

2016-04-18；

2016-11-02

甘肅農業大學大學生科研訓練計劃(SRTP)項目(20150225)，甘肅農業大學國家級大學生創新創業訓練計劃項目(201510733001)，國家自然科學基金“草地早熟禾種間體細胞雜交的研究(31160482)”資助

李慧萍(1994-)，女，甘肅武威人。 E-mail：1529711658@qq.com 馬暉玲為通訊作者。

S 688.4

A

1009-5500(2017)03-0042-06