具有菲環骨架的高分子載體固定淀粉酶交聯聚集體

黎克純，盧建芳,2,3,*，周菊英,2,3，許海棠,2,3，趙彥芝,2,3

具有菲環骨架的高分子載體固定淀粉酶交聯聚集體

黎克純1，盧建芳1,2,3,*，周菊英1,2,3，許海棠1,2,3，趙彥芝1,2,3

（1.廣西民族大學化學化工學院，廣西 南寧 530006；2.廣西林產化學與工程重點實驗室，廣西 南寧 530006；3.廣西高校協同創新中心，廣西 南寧 530006）

用80%異丙醇溶液將淀粉酶沉淀聚集，隨后用戊二醛交聯制備交聯淀粉酶聚集體（cross-linked amylase aggregates，CLEAs-A），最后將CLEAs-A共價固定在具有大孔的菲環骨架的載體上，制備固定化CLEAs-A。探討各種優化條件，研究固定化CLEAs-A的酶學性質，結果顯示固定化酶的熱穩定性和儲存穩定性明顯提高，重復反應7 批次后，相對活性仍保留63.29%。此外，掃描電子顯微鏡和孔徑測量展現了固定化CLEAs-A的表面和孔徑結構。此法可作為一種通用方法，制備出工業生產中所需要的具有高生物催化性能的固定化酶。

淀粉酶；交聯酶淀粉酶聚集體（CLEAs-A）；固定化CLEAs-A；菲環骨架

固定化酶指在一定的空間范圍內起催化作用，并能反復和連續使用的酶。酶的固定化方法可分為載體固定化和無載體固定化兩類[1-2]。其中載體固定化引入了沒有催化功能的載體（載體約占固定化酶總量的90%～99%），“稀釋”了單位體積的催化活性，酶活性嚴重損失。有些酶運用載體固定，通常酶活性損失超過50%，還有一個顯著的缺陷就是產率低[3-5]。相對載體固定化酶來說，非載體固定化酶技術尤其是交聯酶聚集體（cross-linked enzyme aggregates，CLEAs）具有對酶純度要求低、無需載體、酶活性保持率高、操作簡便等優點[6-7]，然而，CLEAs本身存在機械強度較差，在反復使用過程中易破碎，造成酶泄漏、回收困難等問題[8-10]。因此，提高固定化酶單位體積活性、機械強度及其操作穩定性是當今研究的一個熱點[11-12]。

圖1 固定化CLEAs-A制備過程Fig. 1 Flowchart for the preparation of immobilized CLEAs-A

本研究在CLEAs技術基礎上進行改進，先將游離淀粉酶通過沉淀劑聚集，再用交聯劑制成交聯淀粉酶聚集體（cross-linked amylase aggregates，CLEAs-A），CLEAs-A和菲環骨架的高分子載體均有—NH2基團，再利用戊二醛的2 個—CHO基團分別與酶和載體的—NH2基團反應生成—N=CH—基團，即酶聚集體固定在了載體上（圖1），并對其制備條件、結構特征、酶學性質進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

淀粉酶 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；3,5-二硝基水楊酸（化學純） 廣東臺山化工廠；可溶性淀粉（分析純） 國藥集團上海化學試劑有限公司；麥芽糖（生物試劑） 上海潤捷化學試劑有限公司；戊二醛（分析純） 天津市大茂化學試劑廠；異丙醇（分析純） 天津市富宇精細化工有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

SYC-15超級恒溫水浴鍋 南京桑力電子設備廠；SP-752紫外-可見光分光光度計 上海光譜儀器有限公司；Scientz-10N冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司；SUPRA 55 Sapphire場發射掃描電子顯微鏡 德國卡爾蔡司公司；ASAO2010微孔分析儀 美國Micromertics公司。

1.3 方法

1.3.1 CLEAs-A的制備

取2 mL淀粉酶原液（購買后未經過任何處理的淀粉酶溶液），置于冰浴中，緩慢加入一定體積的蒸餾水與沉淀劑沉降，酶聚集1 h，8 000 r/min離心20 min，再懸浮于5 mL的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，測定酶聚集體活力，確定聚集條件。

取適當濃度的酶聚集體懸浮液5 mL置于冰水浴中，加入0.05 mol/L CaCl2的溶液若干，以50 r/min的振蕩速率放置1 h，再向其中緩慢滴加一定體積的戊二醛溶液并輕微攪拌，交聯120 min，6 000 r/min離心10 min，棄去上清液，經緩沖液洗滌數次，得到CLEAs-A[12]，測定酶活力，確定交聯條件。

1.3.2 固定化CLEAs-A的制備

將1.3.1節制得的CLEAs-A離心去除上清液，用緩沖液沖洗CLEAs數次，直到洗液中檢測不到任何的活力，收集沉淀用檸檬酸鈉緩沖液懸浮。加入一定量預處理的具有菲環結構的松香基樹脂和戊二醛，在0 ℃條件下交聯2 h，8 000 r/min離心20 min，用10 mL乙醇沖洗2 次，10 mL蒸餾水沖洗2 次，-20 ℃冷凍干燥。

1.3.3 游離酶活力測定

[13]的方法，在1 mL pH 5.6檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液中，加入1 mL酶溶液，于（40.0±0.5） ℃恒溫水浴中預熱15 min，加入1 mL 1%淀粉溶液準確反應5 min后，迅速加入4 mL 0.4 mol/L NaOH溶液，終止酶反應。從混合液中量取2.0 mL溶液，加2.0 mL 3,5-二硝基水楊酸顯色液，顯色反應后在波長520 nm處測定吸光度，表示麥芽糖的生成量。用麥芽糖同步作標準曲線，以5 min內轉化麥芽糖的量表示酶的活力單位/（mg/（mL?5 min））。

1.3.4 固定化酶活力回收率及相對活力測定

參考文獻[13]的方法，分別稱取一定質量的固定化淀粉酶于帶過濾膜的反應器中，加入檸檬酸鈉緩沖溶液，測定方法與游離酶相同，以1 mg的固定化酶在5 min內水解淀粉生成麥芽糖量表示酶活力單位/（mg/（mL?5 min））。固定化酶的活力回收率和相對活力分別按公式（1）、（2）計算。

1.3.5 制備條件的確定

1.3.5.1 交聯劑濃度對CLEAs的影響

將原酶溶液稀釋2 倍，以80%異丙醇為沉淀劑，聚集3 h。再分別加入不同體積分數的戊二醛，考察戊二醛體積分數對CLEAs的酶活力回收率的影響。

1.3.5.2 交聯時間對CLEAs的影響

將原酶溶液稀釋2 倍，以80%異丙醇為沉淀劑，3 h后加入體積分數1%的戊二醛，考察不同交聯時間對CLEAs-A的酶活力回收率的影響。

1.3.5.3 鈣離子濃度對固定化CLEAs-A的影響

向均勻分散淀粉酶聚集體懸浮液中分別加入0.021 8、0.029 2、0.035 3、0.039 6、0.043 8、0.044 7、0.046 4 mol/L CaCl2溶液，50 r/min振蕩1 h，分別測定不同Ca2+濃度下制備的CLEAs-A的酶活力回收率。

1.3.5.4 交聯劑體積分數對固定化CLEAs-A的影響

分別選擇0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的交聯劑（戊二醛），測定戊二醛體積分數對固定化酶活力的影響。

1.3.5.5 交聯時間對固定化酶活力的影響

交聯時間分別選擇1、2、3、4、5、6 h，考察交聯時間對固定化酶活力的影響。

1.3.5.6 載體與CLEAs-A質量比對固定化酶活力的影響載體與CLEAs-A的質量比為0.3∶1、0.8∶1、1.3∶1、1.8∶1，考察其對固定化酶活力的影響。

1.3.6 固定化酶性質的測定

1.3.6.1 最適溫度和pH值的測定

分別將固定化酶和游離酶置于30～80 ℃水浴中和pH值為3.0～7.0緩沖溶液中按照1.3.3節和1.3.4節進行酶活力檢測。

1.3.6.2 熱穩定性的測定

將固定酶和游離酶分別置于60 ℃水浴中，每隔30 min取1 g固定化酶和1 mL游離酶，測其活力。

1.3.6.3 儲存穩定性的測定

將固定化酶與游離酶同時放在4 ℃冰箱保存，每隔7 d測定活力，以最高的酶活力為100%。

1.3.6.4 操作穩定性的測定

將1 g固定化CLEAs-A放入1 mL pH 7.6的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液中，于50 ℃恒溫水浴中預熱15 min，加入1%淀粉溶液1 mL準確反應5 min后，迅速加入4 mL，0.4 mol/L NaOH溶液，令酶反應停止，按1.3.3節和1.3.4節方法測定酶活力。考察固定化CLEAs在催化反應中的重復使用性。即每次催化完成后，回收固定化酶，用于下一次反應，把第1次使用時酶活力定義為100%。

2 結果與分析

2.1 聚集條件的確定活力

2.1.1 沉淀劑對CLEAs-A活力的影響

按1.3.1節的方法，分別加入不同體積分數的丙酮、硫酸銨、異丙醇、乙醇、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）600聚集酶蛋白，測聚集體的活力和酶活力回收率，結果見表1。

表1 不同沉淀劑對CLEAs-A活性的影響Table 1 Effects of different precipitators on the activity of CLEAs-A

考察不同沉淀劑對淀粉酶的聚集效果，以最終CLEAs-A酶活力回收率為指標，選擇最優沉淀劑。由表1可知，以80%異丙醇為沉淀劑時酶活力回收率最高，為87.61%。通過加入沉淀劑來改變酶溶液或水溶液的靜電參數，使其形成蛋白質沉淀物。這一過程通常伴隨著蛋白質分子內非共價鍵（如氫鍵）的破壞，造成其空間結構的變形，當這種變形影響到酶分子的活性中心時，酶催化活性降低，表現為完全或部分失活，不同沉淀劑對酶分子三維結構的影響不同，造成的失活程度也有所差異[14-15]。高濃度的沉淀劑能使酶蛋白從溶液中快速聚集并沉淀出來，有助于酶活性中心結構的維持；而濃度越低，聚集沉淀的速率越慢，對酶活性中心的損害就越大。與此同時，沉淀劑濃度過高，也會造成酶空間結構變形，酶活性中心受損，致使酶完全或部分失活[16]。

2.1.2 酶濃度對CLEAs-A活力的影響

以80%異丙醇為沉淀劑，將原酶溶液稀釋不同倍數，分別考察其對酶活力回收率的影響，結果見表2。

表2 酶濃度對聚集體活性的影響Table 2 Effects of amylase concentration on the activity of amylase aggregates

由表2可知，將酶溶液稀釋2 倍和原酶液得到的酶活力回收率相差不大，對比原酶液，稀釋后的酶溶液的濃度降低，若要單位體積得到相同的酶活回收率，單位體積原酶液需要更多的沉淀劑，從節約的角度分析，選用稀釋后的酶溶液更合理。同樣，當沉淀劑量一定時，酶的濃度過大時，酶不能完全沉淀下來，酶活力回收率小，造成浪費。酶濃度過低時，單位量的酶對應的沉淀劑量大，沉淀劑沉降酶蛋白分子，這一過程會造成酶的空間結構發生變形，酶分子的活性中心會遭到破壞，酶活力下降。本實驗中酶濃度稀釋2 倍時，酶聚集體酶活力回收率最大。

2.1.3 沉淀時間對CLEAs-A活力的影響

圖2 沉淀時間對CLEAs-A活力的影響Fig. 2 Effects of aggregation time on the activity of amylase aggregates

將原酶溶液稀釋2 倍，以80%異丙醇為沉淀劑，分別考察沉淀1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 h對酶聚集體的酶活力回收率的影響，結果見圖2。酶蛋白沉淀需要一定的時間，在這個過程中時間越長，沉淀的酶蛋白越多，但與此同時，沉淀劑對酶蛋白的三維結構又有破壞作用，會引起酶失活，沉淀劑和酶蛋白接觸的時間越長，破壞性越大。由圖2可知，3 h時酶聚集體的酶活力回收率最大。

2.2 交聯條件的確定

2.2.1 交聯劑戊二醛體積分數對CLEAs-A活力的影響

戊二醛與酶分子上的基團發生化學反應時會改變酶的三維空間結構，進而影響到酶的活性中心，使酶活力發生改變。戊二醛體積分數較低，酶聚集體交聯不充分，部分酶聚體重新溶解，活性基團暴露于環境中，極易受外界因素影響造成酶失活。戊二醛體積分數過高時，因交聯劑有更多機會進攻酶的活性位點，也會造成酶活力的降低[17]。由圖3可知，當戊二醛體積分數為1%時，CLEAs-A的酶活力回收率最大。

圖3 戊二醛體積分數對CLEAs-A活力的影響Fig. 3 Effect of glutaradehyde concentration on CLEAs-A activity

2.2.2 交聯時間對CLEAs-A活力的影響

圖4 交聯時間對CLEAs-A活力的影響Fig. 4 Effect of cross-linking time on CLEAs-A activity

由圖4可知，5 h前CLEAs-A的酶活力回收率逐漸增加。由于酶聚體與戊二醛發生交聯反應需要一定的時間，在這個過程中時間越長交聯反應越徹底，因而交聯在一起的酶蛋白也越多，酶活力回收率越大。但是，當該反應過程超過5 h時，隨著時間的延長，CLEAs-A的酶活力回收率反而降低，由于時間越長過多的戊二醛反而會有更多的機會交聯酶活性部位致使CLEAs-A活性下降；同時戊二醛不僅是酶的交聯劑也是一種變性劑，隨著反應時間的延長，戊二醛將有更多機會影響酶的活性中心結構，使淀粉酶自身的活性降低。2 個原因共同導致了酶活力回收率的降低[18]。

2.3 固定條件的確定

2.3.1 CaCl2濃度對CLEAs-A活力的影響

圖5 CaCl 2對CLEAs-A活力的影響Fig. 5 Effect of CaCl2 concentration on immobilized CLEAs-A activity

游離淀粉酶生成CLEAs-A后，酶活性基團中的N再與Ca2+發生配位反應。其中Ca2+作為酶活性中心的催化基團起到參與催化反應、傳遞電子；連接酶與底物，便于酶與底物作用；穩定酶的構像；同時可以中和催化反應中的陰離子，有效降低反應中的靜電斥力的作用。由圖5可知，CaCl2的濃度越低，酶活力回收率越小，是由于低濃度的鈣離子不能激活淀粉酶的活性中心；CaCl2的濃度越高，酶活力回收率也越小，是由于高濃度的鈣離子阻礙酶固定化反應的進行，過多的鈣離子周圍形成的電子云團會對酶與底物結合有影響，同時對酶的結構改變比較大，所以表現為對酶活性有抑制作用[19]。因此當CaCl2的濃度為0.04 mol/L時，交聯聚集體的酶活力回收率最大。

2.3.2 交聯劑戊二醛體積分數對CLEAs-A活力的影響

圖6 戊二醛體積分數對CLEAs-A活力的影響Fig. 6 Effect of glutaradehyde concentration on immobilized CLEAs-A activity

由圖6可知，隨著戊二醛體積分數的增加，固定化酶活力先增大后減小，當戊二醛體積分數為1%時，所得固定化酶活力最高。這是因為交聯劑濃度較低時，交聯劑不能將CLEAs-A完全交聯在載體上，制備的固定化酶活力不高。但是隨著交聯劑濃度的增大，不僅成功連接了載體與CLEAs-A，而且酶分子內部、更多的酶分子與酶分子之間也會發生交聯反應，因此阻礙了載體與

CLEAs-A的交聯，使酶活力降低。

2.3.3 交聯時間對CLEAs-A活力的影響

圖7 交聯時間對CLEAs-A活力的影響Fig. 7 Effects of cross-linking time on immobilized CLEAs-A activity

由圖7可知，4 h時固定化酶的活力為最大值。這可能是因為固定化時間太短，載體與CLEAs-A結合還沒有達到飽和狀態，而固定化時間過長，戊二醛分子將進入酶聚體內部并與酶表面基團反應，同時，當載體負載的酶量達到過飽和狀態就加大了CLEAs-A分子之間的擁擠程度，使得它與底物結合的空間阻礙加大，導致固定化酶活力下降[20-21]。

2.3.4 載體與CLEAs-A質量比對固定化酶活力的影響

圖8 CLEAs-A與載體的質量比對CLEAs-A活力的影響Fig. 8 Effect of mass ratio of carrier to CLEAs-A on the activity of immobilized CLEAs-A

由圖8可知，當載體與CLEAs-A的質量比為1.3∶1時，酶活力回收率最大。當投入過多的交聯酶時，過多的酶會堆積在載體表面和孔道里將孔道阻塞或封堵，與底物作用不夠充分，此時雖然加入的酶量大但是其酶活力回收率很低，即有效利用的酶量小，不經濟環保[22]。

2.4 固定化酶的性質

2.4.1 最適溫度和pH值

圖9 固定化酶和游離酶的最適溫度（a）和pH值（b）Fig. 9 Optimal temperature (a) and pH (b) for free amylase and immobilized CLEAs-A

由圖9a可知，固定化酶的最適溫度比游離酶提高了約10 ℃。可能是因為在較低溫度下，載體沒有舒張開，孔道內部酶的活性中心不能完全與底物接觸；而在較高溫度下，CLEAs-A被釋放出；同時載體的框架結構以及酶分子自身的聚集、交聯可以保護酶分子結構伸展變形，故固定化酶的最適溫度比游離酶的高，耐熱性提高[23]。由圖9b可知，固定酶的最適pH值比游離酶的最適pH值向堿性方向移動1.0 個單位。可能是由于菲環結構載體上的氨基阻礙氫離子在載體表面及緩沖溶液中的均勻分布，從而使固定化酶和反應液之間產生濃度梯度的變化，即酶的微環境發生變化，導致最適pH值改變[24]。

圖10 固定化酶和游離酶的熱穩定性Fig. 10 Effect of temperature on the activities of free amylase and immobilized CLEAs-A

2.4.2 熱穩定性由圖10可知，酶聚集體交聯以及將其固定在菲環結構的載體上，都有利于抑制酶分子的折疊和反轉，從而減少對酶分子三維結構的破壞作用。增強酶分子結構的剛性，因而抗熱變性能力增加。游離酶在60 ℃條件下保溫，酶活力下降明顯，210 min后殘余活力僅為最初的19.4%。而固定化酶在相同條件下活力下降緩慢，210 min后活力為初始的74%，可見固定化酶具有更好的熱穩定性。

2.4.3 儲存穩定性

圖11 固定化酶和游離酶的儲存穩定性Fig. 11 Storage stability of free amylase and immobilized CLEAs-A

由圖11可知，游離酶的活力下降很快，28 d已經沒有活性。固定化酶儲存35 d，活力仍保持在63.05%，說明淀粉酶被固定化以后其壽命明顯增長。可能原因是：1）將CLEAs-A固定在載體上，使酶分子與酶分子多點連接，可防止酶分子伸展變性[25]；2）酶分子交聯結合后，由于酶失去了分子間相互作用的機會，從而抑制了酶降解[26]。

2.4.4 操作穩定性

由圖12可知，固定化酶連續使用7 個批次后其相對酶活力仍保持63.29%。固定化酶重要的應用優勢就是從反應媒介中回收方便，重復利用，可以簡化后續工藝過程，降低耗酶費用。

圖12 固定化酶的操作穩定性Fig. 12 Reusability of immobilized CLEAs-A

2.4.5 米氏常數

米氏常數表示酶和底物之間的親和能力。配制質量分數分別為1%、2%、3%、4%、5%的底物溶液（可溶性淀粉溶液），同時測定固定化酶與游離酶的活力。以淀粉酶濃度的倒數（1/S）為橫坐標，以反應速率的倒數（1/v）為縱坐標，按Linewaver-Burk法作圖求得游離酶的Km為37.2 g/L，固定化酶的Km為44.8 g/L。固定化酶Km偏高可能是由于通過酶分子聚集交聯，然后再利用戊二醛將其交聯在具有菲環骨架的載體上的方法制備固定化酶，酶分子之間高度聚集交聯，CLEAs-A進入到載體孔徑內，不利于底物進出酶的活性作用中心，減弱了其與底物的誘導契合反應，親和力降低。

2.4.6 微量熱反應

圖13 固定化酶催化反應過程中的熱流曲線Fig. 13 Heat flow curve for the catalytic reaction process of immobilized CLEAs-A

298.15 K、pH 6.0條件下，測定固定化酶催化淀粉生成麥芽糖過程中的能量變化。由面積歸一化方法得出每克固定化酶催化反應淀粉需吸熱553.819 mJ，由圖13可見，整個催化過程有2 個熱量變化區域，一個是較強的吸熱區域，一個是相對較弱的放熱區域。當固定化酶與底物接觸時，淀粉分子掙脫分子間引力，向固定化酶表面擴散、進出載體孔徑和CLEAs-A內部均需要從外界吸收能量轉化為動能，而淀粉酶催化淀粉分子轉化成麥芽糖，是放熱反應[27-28]。歸一化方法外推直線與熱流曲線交叉點為此刻體系吸熱量和放熱量相互抵消。之前放出的熱量數值上小于吸收的熱量，圖中顯示吸熱峰。此后放出的熱量數值上大于吸收的熱量，圖中顯示放熱峰。當反應達平衡，熱流曲線開始平穩，最終得到平穩曲線。

2.4.7 物理特性

2.4.7.1 孔徑及比表面積

載體的平均孔徑及比表面積分別為97 nm和3.17 m2/g。同時，固定化酶的平均孔徑減小到32 nm，可能是由于CLEAs-A進入到載體孔道內占據了位置。比表面積增加到3.71 m2/g，可能是因為CLEAs-A尺寸相對較小，但是比表面積大，堆積在載體的表面，增大了固定化酶的比表面積。

2.4.7.2 微球粒徑與粒徑分布

圖14 載體和固定化酶的粒徑分布Fig. 14 Particle size distribution of carrier and immobilized CLEAs-A

任何非均向催化劑在工業生產應用過程中，粒徑大小是一個重要的特性，是因為它能直接影響傳質和過濾能力。CLEAs-A的粒徑范圍通常在5～50 μm，由于其相對小的尺寸，批次操作不易過濾[23,29]。由圖14可知，固定化酶的粒徑分布在1 400～4 200 μm，比載體粒徑更大、分布更均一，有利于回收重復使用。

2.4.7.3 掃描電子顯微鏡

圖15 載體（a）和固定化酶（b）的電子顯微鏡圖Fig. 15 SEM images of carrier (a) and immobilized CLEAs-A (b)

由圖15可見，載體表面粗糙，凹凸不平，有大量的孔洞和凹陷，增大了載體的比表面積，有利于酶固定化。相對固定化酶，其表面大部分被CLEAs-A覆蓋，且分布較均勻，表面的孔洞明顯減少，表明通過戊二醛的“手臂”作用將CLEAs-A連接在了載體表面及孔道內。由于，酶聚集體粒徑范圍通常在5～50 μm，在這個范圍之內粒徑的比表面積較大[30]。通過戊二醛“手臂”將酶聚集體接在載體上，實質上是增加了載體的比表面積。

3 結 論

本研究通過將CLEAs-A固定在具有菲環結構的載體上，制得固定化CLEAs-A。與游離淀粉酶相比，固定化CLEAs-A顯示出更好的儲存穩定性、可重復使用性及耐熱性。此外，粒徑大小、孔隙大小和形態特征測定結果表明，固定化CLEAs-A的物理特性發生了很大的變化，可能促進催化反應。研究結果表明，新開發的固定化CLEAs-A是一種有效的生物催化劑，同時制備固定化CLEAs-A方法可以作為一般方法，為有效發展各種基于多孔載體的固定化酶提供借鑒。

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Immobilization of Cross-Linked Amylase Aggregates on Polymer Containing Phenanthrene Skeleton

LI Kechun1, LU Jianfang1,2,3,*, ZHOU Juying1,2,3, XU Haitang1,2,3, ZHAO Yanzhi1,2,3
(1. School of Chemistry and Chemical Engineering, Guangxi University for Nationalities, Nanning 530006, China; 2. Guangxi Key Laboratory of Chemistry and Engineering of Forest Products, Nanning 530006, China; 3. Collaborative Innovation Center in Guangxi, Nanning 530006, China)

Amylase was precipitated with 80% isopropanol followed by cross-linking with glutaraldehyde to obtain crosslinked amylase aggregates (CLEAs-A). Then CLEAs-A was covalently immobilized on a macroporous polymer carrier containing a phenanthrene skeleton to obtain immobilized CLEAs-A. Herein, various process parameters were systematically evaluated. Moreover, the enzymatic properties and physical structure of immobilized CLEAs-A were investigated. The thermal and storage stability were improved remarkably as compared with those of the free amylase. After seventh repeated use, the activity recovery of immobilized CLEAs-A was still as high as 63.29%. Furthermore, scanning electron microscopy and porosity measurements indicated the surface and pore structure of immobilized CLEAs-A. The proposed immobilization strategy would provide a general approach for preparing immobilized enzymes with robust and high bio-catalytic properties for use in industrial production.

amylase; cross-linked amylase aggregates (CLEAs-A); immobilized CLEAs-A; phenanthrene skeleton

10.7506/spkx1002-6630-201714017

Q814.2

A

1002-6630（2017）14-0112-08

黎克純, 盧建芳, 周菊英, 等. 具有菲環骨架的高分子載體固定淀粉酶交聯聚集體[J]. 食品科學, 2017, 38(14): 112-119.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714017. http://www.spkx.net.cn

LI Kechun, LU Jianfang, ZHOU Juying, et al. Immobilization of cross-linked amylase aggregates on polymer containing phenanthrene skeleton[J]. Food Science, 2017, 38(14): 112-119. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714017. http://www.spkx.net.cn

2016-07-01

國家民委項目（14GXZ012）；廣西高校科學技術研究項目（KY2015LX069；KY2015YB080）；

廣西民族大學科研項目（2016MDQN019；2016MDYB025）

黎克純（1984—），男，工程師，碩士，研究方向為天然產物改性及應用。E-mail：127606314@qq.com

*通信作者：盧建芳（1979—），女，實驗師，博士研究生，研究方向為天然產物改性及應用。E-mail：18578992008@163.com