蜂蜜中原蜜黃酮類化合物HPLC圖譜比較分析

王 琴，李 治，黨曉群，周澤揚，王林玲*

（重慶師范大學生命科學學院，重慶 401331）

蜂蜜中原蜜黃酮類化合物HPLC圖譜比較分析

王 琴，李 治，黨曉群，周澤揚，王林玲*

（重慶師范大學生命科學學院，重慶 401331）

利用高效液相色譜比較分析不同蜂種、不同產地、加工與否以及不同蜜源蜂蜜中原蜜黃酮類化合物的種類及含量差異。結果表明，意大利蜜蜂油菜原蜜和中華蜜蜂油菜原蜜總峰數和峰形都比較相似，意大利蜜蜂油菜原蜜的總黃酮含量比中華蜜蜂油菜原蜜總黃酮含量高。不同產地的意大利蜜蜂油菜原蜜的圖譜峰形整體相似，總黃酮含量和黃酮類化合物種類大致相同。加工后的商品蜜總黃酮含量減少，黃酮類化合物的種類也減少，商品蜜的高效液相色譜圖顯示其黃酮類化合物的出峰時間靠前，主要密集分布在水溶性的分離相中。3 個不同蜜源蜂蜜原蜜黃酮類化合物高效液相色譜圖的總峰數和峰形都有較大差異，油菜原蜜、洋槐原蜜及柑橘原蜜的總峰數分別為65、58、 70 個，柑橘原蜜的總黃酮含量最高，達161.62 μg/100 g。單花蜂蜜原蜜黃酮類化合物的高效液相色譜圖峰形具有一定的特異性，可以作為指紋圖譜用于蜂蜜蜜源的鑒定。

油菜原蜜；高效液相色譜；意大利蜜蜂；中華蜜蜂；黃酮類化合物；蜜源

蜂蜜具有廣泛的營養價值和生理調節功能[1]，營養價值和它的化學成分[2]相關，蜂蜜由于蜂種、蜜源、環境的不同，其化學組成存在差異[3]，蜂蜜中的黃酮類化合物既是重要的營養因子，又是藥理因子，被認為是蜂蜜中一類具有藥用活性的主要物質之一[4-6]，具有防癌抗癌[7-8]、抗腫瘤[9]、抗菌抗氧化[10-13]、抗抑郁[14]、類雌激素效應[15]等作用。黃酮類化合物的種類和含量可以在一定程度上評價蜂蜜營養價值。

蜂蜜黃酮類化合物的研究越來越受到各國學者的重視，盧煥仙等[16]測定了不同花期石榴花蜂蜜中總黃酮類化合物含量。孫崇臻等[3]用高效液相色譜-二極管陣列檢測法測定了8 種單花蜜中的脫落酸以及14 種多酚化合物。梁鋮等[17]對云南地區5 種特色蜂蜜中蘆丁、楊梅酮、槲皮素、莰菲醇4 種黃酮化合物含量的差異進行比較。Schievano等[18]研究了意大利地區的洋槐蜜，發現白楊素可作為洋槐蜜的植物源標記物。Tomás-Barberán等[19]用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）測定了歐洲52 種單花蜂蜜，發現橙皮素可以作為柑橘的植物源標記物。已有研究表明黃酮類可作為蜂蜜的植物種屬鑒定及真偽鑒別的標識物質[20]。不同蜂種單花蜂蜜黃酮類化合物有無差別，不同產地對單花蜂蜜黃酮類化合物的含量有無影響，蜂蜜原蜜和加工商品蜜黃酮化合物是否相同，鮮見此方面的研究文獻，因此對蜂蜜中黃酮類化合物的研究還需進一步完善。

本研究通過HPLC法分析蜂蜜中蘆丁、槲皮素、山柰酚[21]等10 種黃酮類化合物，研究不同蜂種、不同產地、天然和加工油菜原蜜以及不同蜜源蜂蜜之間的黃酮類化合物組分的差別，為油菜原蜜產品質量和成分檢測提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油菜原蜜主要采集于重慶地區，其中N1為重慶市南川意大利蜜蜂油菜原蜜，N2和N3為重慶市南川中華蜜蜂油菜原蜜，T為重慶市潼南意大利蜜蜂油菜原蜜，GY為貴州省桐梓縣意大利蜜蜂油菜原蜜，YY為重慶市云陽意大利蜜蜂油菜商品蜜，G為重慶市長壽意大利蜜蜂柑橘原蜜，Y為甘肅省意大利蜜蜂洋槐原蜜。除了商品蜜YY，其余蜂蜜為蜂農養殖場的自然原蜜，采集時間為2016年4月。

兒茶素、楊梅素、蘆丁、槲皮素、柚皮素、木犀草素、山柰酚、芹菜素、黃芩素、白楊素標準品（HPLC級，純度＞98%） 重慶塞米克生物科技有限公司。

XAD-2大孔樹脂 美國Sigma公司；甲醇（色譜純，純度99.9%） 美國Fisher公司；甲酸（色譜純，純度＞98%） 美國Fluka公司；氫氧化鈉（純度99%）天津永大化學試劑有限公司；鹽酸（純度95.5%）重慶川東化工（集團）有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

LC-20A型HPLC儀（包括SPD-20A紫外檢測器、LC-20AT泵、自動進樣器） 日本島津公司；KH-100B型超聲波清洗器 昆山禾創超聲儀器有限公司；抽濾裝置 天津津騰實驗設備有限公司；旋片真空泵臺州正空泵業有限公司；ATSrese純水儀 重慶安特生環保設備有限公司；FA1004A電子天平 上海精天電子儀器有限公司；TG16-W微量高速離心機 德國Eppendorf公司；QL-866旋渦混合器 海門其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 HPLC條件

色譜分離柱：C18色譜柱（150 mm×4.6 mm， 5 μm）；流動相：流動相A為0.25%甲酸溶液，流動相B為甲醇；梯度洗脫[22-24]：0～8 min，20%～30% B；8～15 min，30%～45% B；15～25 min，45%～60% B；35～40 min，60%～75% B；40～45 min，70% B；45～47 min，70%～25% B；47～50 min，25% B。流速0.60 mL/min；進樣量30 μL；色譜柱溫度35 ℃；檢測波長254 nm。

1.3.2 HPLC方法學考察

精密度：取混合標品原液稀釋6 倍，按照HPLC條件，進樣量10 μL，連續進樣6 次，計算蘆丁峰的相對峰面積，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為0.32%，儀器設備的精密度良好。

重復性：取混合標品原液稀釋6 倍，平行制備6 份進樣溶液，按照HPLC條件，進樣量10 μL，計算蘆丁的相對峰面積，RSD為0.21%，實驗方法重復性良好。

穩定性：將提取的蜂蜜樣品，分別于0、4、8、12、16、24 h進樣，按照HPLC條件，進樣量10 μL，計算3 個共有峰的相對峰面積，RSD分別為0.80%、0.74%、0.85%，進樣溶液在24 h內穩定，達到色譜分析要求。

1.3.3 標準品溶液的制備及標準曲線的繪制

精密稱取10 種黃酮類化合物標準品各20.00 mg，分別加入1 mL甲醇溶液配制成質量濃度為20 mg/mL的標準品原液。移取10 個標品原液各5 μL于1.5 mL離心管中，加入950 μL甲醇配制成0.2 mg/mL的標品混合液，置于4 ℃冰箱中避光儲存備用。

精密移取標準品混合原液，加入甲醇，依次稀釋成6、8、12、16、24、32 倍的一系列質量濃度標準品混合溶液，用0.45 μm微孔濾膜過濾后，依照色譜條件進樣10 μL。以質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.4 蜜蜂樣品溶液的制備

分別精確稱取8 種蜂蜜樣品2.0 g，用10 mL蒸餾水充分溶解，3 000 r/min離心5 min，除去固體雜質，移取上清液，測量溶液的pH值，用NaOH和HCl調節pH值為4.0。上清液與10 mL的XAD-2[25-26]大孔樹脂混合，充分攪拌混勻，將樹脂液裝入玻璃柱中，用10 mL蒸餾水漂洗柱子除去糖類物質及其他雜質，按洗脫液甲醇用量與樹脂的體積比為1∶1，最后用10 mL 100%甲醇溶液[13]洗脫出黃酮類物質，收集甲醇洗脫液，置于4 ℃冰箱保存備用。

2.0 g蜂蜜用10 mL甲醇洗脫，進樣液質量濃度為0.2 g/mL。精密移取100 μL洗脫液，用0.45 μm濾膜[27]過濾后作為進樣液，進樣量30 μL，重復3 次進樣。

2 結果與分析

2.1 同一產地中華蜜蜂和意大利蜜蜂油菜原蜜黃酮類組分的比較分析

圖1 南川中華蜜蜂和意大利蜜蜂油菜原蜜HPLC圖譜Fig. 1 Chromatograms of Chinese honeybee and Italy honeybee rapehoney from Nanchuan

通過HPLC分析10 種黃酮類化合物的混合標準品溶液，制定標準曲線，蜂蜜樣品的分析結果，根據標準品相對保留時間選取樣品峰，用外標法統計分析各個黃酮類化合物的含量。如圖1所示，統計樣品重復3 次進樣后的平均總峰數，南川意大利蜜蜂油菜原蜜N1、南川中華蜜蜂油菜原蜜N2和南川中華蜜蜂油菜原蜜N3的總峰數為分別為65、67、65 個，3 種油菜原蜜的總峰數相近，峰形整體相似，黃酮類化合物的種類也大致相同。但中華蜜蜂油菜原蜜在保留時間12.5、41.2 min有出峰，意大利蜜蜂油菜原蜜卻沒有。意大利蜜蜂油菜原蜜在保留時間為15.0 min有一個中華蜜蜂油菜原蜜沒有的峰。

同一產地中華蜜蜂和意大利蜜蜂油菜原蜜中黃酮化合物的HPLC圖譜相似，黃酮類化合物的種類大致相同，在總黃酮和單個黃酮化合物的含量上有一定差異。如表1所示，意大利蜜蜂油菜原蜜的總黃酮含量比中華蜜蜂油菜原蜜高，意大利蜜蜂油菜原蜜中蘆丁含量約是中華蜜蜂油菜原蜜的2.5 倍，兒茶素含量也比中華蜜蜂油菜原蜜高近一倍，另外意大利蜜蜂油菜原蜜比中華蜜蜂油菜原蜜含有更豐富的山柰酚、黃芩素、楊梅素和白楊素。中華蜜蜂油菜原蜜的柚皮素含量比意大利蜜蜂油菜原蜜高，中華蜜蜂油菜原蜜中檢測出微量的芹菜素，意大利蜜蜂油菜原蜜中均未檢測出。中華蜜蜂油菜原蜜黃酮類化合種類比意大利蜜蜂油菜原蜜豐富。這可能與蜜蜂的采蜜習慣相關，意大利蜜蜂喜歡采集大量集中的蜜源，而中華蜜蜂除了采集大量蜜源外，還喜歡就近采集零星的蜜源，所以中華蜜蜂蜂蜜的黃酮類化合物的種類有可能比意大利蜜蜂采集蜂蜜稍多一些。意大利蜜蜂的生產能力較中華蜜蜂強，且扇去蜂蜜水分的能力也較中華蜜蜂強，所以相同情況下意大利蜜蜂蜂蜜的含水量比中華蜜蜂蜂蜜低，總黃酮含量比中華蜜蜂蜂蜜高。

表1 南川油菜原蜜10 種黃酮類化合物含量（n=3）Table 1 The contents of 10 flavonoids in raw rape honey from Nanchuan (n=3)

2.2 不同產地意大利蜜蜂油菜原蜜黃酮類組分的比較分析

圖2 不同產地意大利蜜蜂油菜原蜜HPLC圖譜Fig. 2 Chromatograms of Italy honeybee rape honey samples from different producing areas

重慶南川、重慶潼南和貴州桐梓的意大利蜜蜂油菜原蜜在254 nm波長處的HPLC圖譜的總峰數分別為65、66、64 個，3 個產地的意大利蜜蜂油菜原蜜的峰形整體相似，如圖2所示，表明黃酮類化合物種類大致相同。

表2 意大利蜜蜂油菜原蜜10 種黃酮類化合物含量（n=3）Table 2 The contents of 10 flavonoids in Italy honeybee rape honey (n =3)

3 個產地意大利蜜蜂油菜原蜜總黃酮的含量差別小，但單個黃酮化合物的含量卻有一定的差異，如表2所示。油菜原蜜中含量最豐富的兒茶素和蘆丁因產地不同含量有所不同，貴州桐梓意大利蜜蜂油菜原蜜兒茶素含量最豐富，達到了（55.73±1.32）μg/100 g，南川意大利蜜蜂油菜原蜜的蘆丁含量最高（39.99±2.84）μg/100 g，100 g原蜜的蘆丁含量比貴州桐梓意大利蜜蜂油菜原蜜的蘆丁含量高了0.35%。潼南意大利蜜蜂油菜原蜜中槲皮素和山柰酚含量比南川和貴州桐梓高，潼南意大利蜜蜂油菜原蜜含有柚皮素是重慶南川和貴州桐梓地區的1.5 倍。而貴州桐梓意大利蜜蜂油菜原蜜比其他產地原蜜有更豐富的兒茶素，但槲皮素和山柰酚含量較少，3 個產地的意大利蜜蜂油菜原蜜均未檢測出芹菜素。黃酮含量與蜜源產地有關，蜜源植物的生長土壤、氣溫、地勢地形和蜜源植物品種[28]等都會影響原蜜中黃酮類化合物的含量。

2.3 意大利蜜蜂油菜原蜜和加工商品蜜的黃酮類組分的比較分析

圖3 意大利蜜蜂油菜原蜜和云陽商品蜜的HPLC圖譜Fig. 3 Chromatograms of raw Italy honeybee rape honey from Tongnan and commercial rape honey from Yunyang

如圖3所示，意大利蜜蜂商品蜜峰形與油菜原蜜存在較大的差異，商品蜜的黃酮類物質的出峰時間靠前，主要密集分布在水溶性的分離相中。南川意大利蜜蜂油菜原蜜和潼南意大利蜜蜂油菜原蜜總峰數為65 個和66 個，而商品蜜YY的總峰數只有60 個，其中黃酮類化合物的種類比原蜜少，商品蜜缺少保留時間在12.1、24.9、28.4、30.3、36.5、37.0、39.6、40.2、43.6、44.0 min處的峰。其中保留時間在24.9、28.4、30.3 min對應的物質分別是柚皮素、山柰酚和黃芩素，其他保留時間峰為未知的黃酮類化合物。

表3 油菜原蜜和商品油菜蜜10 種黃酮類化合物含量（n=3）Table 3 The contents of 10 flavonoids in raw rape honey and commercial rape honey from Yunyang (n=3)

如表3所示，意大利蜜蜂油菜原蜜的總黃酮含量比商品蜜豐富，檢測結果表明商品蜜不含有柚皮素、山柰酚和黃芩素。商品蜜中槲皮素、木犀草素和白楊素的含量也比油菜原蜜少，但楊梅素的含量比原蜜更豐富。

加工后的商品蜜黃酮類化合物的種類減少，含量降低，這與黃酮各類成分的穩定性相關，黃芩素和白楊素的結構使它的化學性質不穩定，山柰酚在水溶液中的穩定性差，蜂蜜的加工[29]過程對蜂蜜中的活性物質破壞極大，可能使黃酮類化合物[30]受到破壞和轉化。應在蜂蜜的商品化過程中改進加工方法，盡量保持原蜜的品質，發展高品質的有機蜜。

2.4 意大利蜜蜂油菜原蜜與其他蜜源蜂蜜的黃酮類組分的比較

圖4 油菜原蜜、洋槐原蜜和柑橘原蜜HPLC圖譜Fig. 4 Chromatograms of raw rape honey, acacia honey and citrus honey

如圖4所示，意大利蜜蜂油菜原蜜、洋槐原蜜及柑橘原蜜的總峰數和峰形都有較大的差異，油菜原蜜、洋槐原蜜及柑橘原蜜的總峰數分別為65、58、70 個。油菜原蜜在保留時間為12.1、15.6、18.0、20.1、29.0、30.3、32.0、39.6、40.2、43.6、44.0 min有特有峰。洋槐原蜜的特有峰保留時間為10.0、35.0、42.0 min，柑橘原蜜的特有峰保留時間為14.0、19.0、22.6、31.2、39.7、43.8、44.3 min。特有峰在HPLC圖譜中的保留時間不相同，表明不同蜜源蜂蜜中黃酮類化合物種類不同。

表4 不同蜜源原蜜10 種黃酮類化合物含量（n=3）Table 4 The contents of 10 flavonoids in raw honey samples from different floral sources (n=3)

如表4所示，3 種不同蜜源蜂蜜的總黃酮含量有明顯差異，柑橘原蜜的總黃酮含量最高，達到161.62 μg/100 g。柑橘原蜜除了山柰酚含量偏低，其他單個黃酮含量整體都比較高，其中木犀草素含量約為油菜原蜜的2.7 倍，并且檢測出含有芹菜素，洋槐原蜜和油菜原蜜都未檢出芹菜素。柑橘原蜜未檢測出黃芩素。洋槐原蜜和油菜原蜜相比，楊梅素、木犀草素含量較高，其他單個黃酮和總黃酮含量都偏低，洋槐原蜜未檢測出山柰酚。

蜜蜂采集蜜源植物的花蜜釀制蜂蜜，蜂蜜黃酮類化合物的種類和含量存在差異，這種差異可以反映出蜂蜜是由何種蜜源植物花蜜釀造的。本研究結果表明意大利蜜蜂油菜原蜜、洋槐原蜜及柑橘原蜜黃酮化合物HPLC圖譜存在差異，蜂蜜中黃酮類化合的種類和含量與蜜源相關性大，單花蜂蜜黃酮類化合物的HPLC圖譜具有一定的特異性，可以作為特征圖譜用于蜜源種類的鑒別。

3 結 論

同一產地中華蜜蜂和意大利蜜蜂油菜原蜜黃酮類化合物的HPLC圖譜相似，存在一定差異，不同蜂種的HPLC圖譜存在明顯的特有峰，特有峰可作為中華蜜蜂和意大利蜜蜂油菜原蜜的區分標記。意大利蜜蜂油菜原蜜中總黃酮含量高，但中華蜜蜂油菜原蜜黃酮的種類更豐富。不同產地意大利蜜蜂油菜原蜜的黃酮化合物HPLC圖譜具有一致性，總黃酮含量大致相同，單個黃酮化合物含量有一定差異，油菜原蜜中黃酮類化合物的種類受產地差異影響小。商品油菜原蜜中黃酮類化合物的峰主要集中在HPLC圖譜前部，它與油菜原蜜HPLC圖譜相似性低。不同蜜源蜂蜜原蜜的黃酮類化合物的HPLC圖譜具有特異性，在含量和種類上的差別極大。

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Comparative HPLC Analysis of Flavonoids from Different Raw Honeys

WANG Qin, LI Zhi, DANG Xiaoqun, ZHOU Zeyang, WANG Linling*
(College of Life Sciences, Chongqing Normal University, Chongqing 401331, China)

In this study, by using high performance liquid chromatography (HPLC), we compared the flavonoid composition and contents of raw honey from different honeybee species, different geographic origins and different floral sources and commercial processed honey. The results showed that Chinese honeybee (Apis cerana cerana) and Italy honeybee (Apis mellifera ligustica) rape honey were similar in terms of total peak number and peak shape, but the total flavonoids content of Italy honeybee rape honey was higher than that of its Chinese counterpart. Italy honeybee rape honeys from different producing areas had a high similarity in the HPLC profiles, and they were almost identical with respect to the number and amount of flavonoids identified. The number and amount of flavonoids detected in processed honey were reduced as compared to the raw one. The HPLC profile of processed honey indicated that the chromatographic peaks of flavonoids occurred earlier, which were intensively distributed in the water-soluble phase. Considerable differences in total peak number and peak shape were found among raw honey from different floral sources; a total of 65, 58 and 70 flavonoid peaks were identified from rape honey, acacia honey and citrus honey, respectively, and citrus honey had the highest flavonoid content (161.62 μg/100 g). The HPLC peak shape of flavonoids in monofloral honey showed some specificity, providing a characteristic fingerprint for the identification of honey species.

rape honey; high performance liquid chromatography (HPLC); Apis mellifera ligustica; Apis cerana cerana; flavonoids; nectar source

10.7506/spkx1002-6630-201714025

TS207.3

A

1002-6630（2017）14-0164-06

王琴, 李治, 黨曉群, 等. 蜂蜜中原蜜黃酮類化合物HPLC圖譜比較分析[J]. 食品科學, 2017, 38(14): 164-169.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714025. http://www.spkx.net.cn

WANG Qin, LI Zhi, DANG Xiaoqun, et al. Comparative HPLC analysis of flavonoids from different raw honeys[J]. Food Science, 2017, 38(14): 164-169. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714025. http://www.spkx.net.cn

2016-10-14

重慶市社會民生科技創新專項（cstc2015shmszx80031）；教育部留學回國人員科研啟動基金項目

王琴（1991—），女，碩士研究生，研究方向為生物化學與分子生物學。E-mail：wqin0408@163.com

*通信作者：王林玲（1969—），女，教授，博士，研究方向為生物化學。E-mail：wanglinling2005@163.com