響應面法優(yōu)化檸檬酸去除香菇中鎘工藝

胡 靜，孫君社，譚曉妍，胡紹峰，秦子芳，寧慧娟，張秀清,*

（1.中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083；2.農業(yè)部規(guī)劃設計研究院，北京 100125）

響應面法優(yōu)化檸檬酸去除香菇中鎘工藝

胡 靜1，孫君社2，譚曉妍1，胡紹峰1，秦子芳1，寧慧娟1，張秀清1,*

（1.中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083；2.農業(yè)部規(guī)劃設計研究院，北京 100125）

為降低香菇中重金屬鎘的含量，本實驗以干香菇為原料，采用檸檬酸為洗脫劑去除香菇中的重金屬鎘，并對去除方法進行優(yōu)化。通過單因素試驗和響應面優(yōu)化方法，分析檸檬酸濃度、pH值和轉速對香菇中鎘去除率的影響。結果表明，采用檸檬酸作為洗脫劑，在濃度0.32 mol/L、pH 5.0、30 ℃、轉速70 r/min條件下，香菇中鎘的去除率達到最大，為57.0%，去除后香菇中鎘殘留量最高為0.41 mg/kg，低于國家限量標準0.5 mg/kg。同時采用該方法處理后，香菇中多糖及蛋白質含量損失少，較好地保留了香菇中的營養(yǎng)成分。該方法對降低香菇中鎘的殘留具有一定的應用參考價值。

香菇；鎘；檸檬酸；響應面

香菇（Lentinus edodes）為世界第二大食用菌，屬擔子菌亞門，層菌綱，傘菌目，側耳科，香菇屬，是一種木腐性真菌[1]，主要分布在亞洲東南部，屬于熱帶亞熱帶環(huán)境中的真菌微生物[2]。香菇肉質肥厚，味道鮮美，營養(yǎng)豐富，是我國重要的藥食同源真菌[3]。同時香菇中也含有豐富的藥效成分，如香菇多糖、香菇嘌呤及三萜類化合物等[4]，具有抗病毒[5]、抗腫瘤[6-7]、抗氧化[8-10]、降血脂[11-14]等功效，常用于臨床治療中的輔助治療[15]。

目前香菇生產多采用袋料栽培方式，但是在生長過程中香菇會富集袋料中的重金屬，其重金屬含量與栽培環(huán)境、栽培基質和自身機制有關[16-17]，大多數(shù)重金屬通過被動運輸進入組織[18-19]。Schlecht等[20]研究發(fā)現(xiàn)食用菌對鎘的富集效果較為顯著，其鎘的富集量為蔬菜的10 倍。賈彥[21]分析了北京市食用菌重金屬含量，發(fā)現(xiàn)部分地區(qū)香菇樣品鎘超標率達42.5%。食用菌中鎘主要分布在細胞壁上，其次分布在細胞質和液泡中[22]。2015年新頒布的中華人民共和國供銷合作行業(yè)標準GH/T 1013—2015《香菇》中規(guī)定干菇中鎘（以Cd計）的限量標準為0.5 mg/kg。

針對香菇中重金屬鎘含量較高的情況，目前多從栽培香菇的袋料著手，控制原料的重金屬含量或添加外源物質控制香菇中重金屬含量。邊銀丙[23]在袋料配方中提高石膏用量，通過鈣離子的競爭及pH值的改變，能有效降低香菇中鎘含量34%～45%。吳學謙[24]改變香菇培養(yǎng)料為50%～89%的斜發(fā)沸石粉、9%～42%的石灰石粉或石膏粉和2%～8%的硫酸鎂，可使栽培的香菇中重金屬含量降低10%～50%。但是當前研究中對于采收后香菇子實體重金屬鎘的去除方法研究較少。檸檬酸作為一種有機酸，是常用的食品添加劑，也可作為環(huán)境友好型淋洗劑，在溫和酸性條件下可以絡合重金屬離子，以達到去除重金屬的效果，而且檸檬酸在好氧及厭氧條件下均可被生物降解[25]。單恩莉等[26]利用酶解結合檸檬酸浸泡處理對東海烏參中重金屬進行去除，去除率達90%以上，且去除前后東海烏參中脂肪、蛋白質、多糖成分無顯著變化。丁仲仲[27]利用檸檬酸去除壇紫菜中重金屬，去除效果良好，且去除前后壇紫菜感官和品質無明顯變化。Wang Yi等[28]利用檸檬酸、乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA）和活性炭共同作用，對香菇多糖中重金屬鎘進行去除，去除效果良好。

本研究以檸檬酸為洗脫劑，通過單因素試驗考察檸檬酸濃度、pH值及轉速[29-32]對香菇中鎘去除率的影響，在此基礎上利用響應面分析法對鎘去除方法進行優(yōu)化，得到檸檬酸去除鎘的適宜方法條件。同時對處理前后香菇中蛋白質和多糖含量進行了測定，較好地保留了香菇中的有效成分，得到了營養(yǎng)豐富、重金屬含量符合標準的香菇。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取不同主產地、鎘含量較高的香菇傘為實驗材料，為了便于后續(xù)加工，將香菇進行切片處理。

100 mg/L鎘標準溶液 百靈威科技有限公司；苯酚、硫酸、硝酸、葡萄糖、氯化鎘、無水乙醇、檸檬酸、硫酸鉀、硫酸銅、甲基紅、EDTA、硼酸、氫氧化鈉、過氧化氫、溴鉀酚綠均為分析純。

1.2 儀器與設備

SPD50型自動凱式定氮儀、SPT20消解爐 北京三品科創(chuàng)儀器公司；ICP 6300電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀 美國Thermo Fisher公司；MARS 5. MARS 6微波消解儀 美國CEM公司；TM-1901型雙光束紫外-可見光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；搖床太倉豪成儀器有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 鎘去除工藝流程

香菇傘→均勻切片（厚度1～5 mm）→加入洗脫劑（選擇合適的洗脫劑濃度、pH值、轉速）→搖床洗脫→烘干、粉碎→鎘含量測定。

1.3.2 香菇中重金屬鎘的測定

采用微波消解系統(tǒng)消解樣品，于電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀中測定香菇中鎘含量。鎘去除率的計算公式如下所示：

式中：C0為處理前香菇中鎘含量/（mg/kg）；C為處理后香菇中鎘含量/（mg/kg）。

1.3.3 洗脫劑的確定

本實驗選取水、檸檬酸溶液及 EDTA溶液分別作為香菇中重金屬鎘的洗脫劑，主要考察這3 種洗脫劑去除香菇中重金屬鎘的效果。選擇料液比1∶10、濃度0.16 mol/L、pH 6.0、轉速150 r/min實驗條件，通過比較香菇中重金屬鎘的去除率確定最佳洗脫劑。

1.3.4 單因素試驗

選取上述實驗選定的溶液作為單因素試驗的洗脫劑，以蒸餾水處理為對照組（CK），分別考察洗脫劑濃度、pH值和轉速3個因素對重金屬鎘去除率的影響。

1.3.5 響應面試驗優(yōu)化

通過單因素試驗確定影響鎘去除率的主要因素和最佳水平范圍，根據(jù)響應面中的Box-Behnken原理，選擇洗脫劑濃度、pH值和轉速3 個因素，設計三因素三水平試驗，響應面試驗因素水平如表1所示。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of the independent variables used in response surface design

1.3.6 蛋白質與多糖含量的測定

根據(jù)GB/T 15673—2009《食用菌中粗蛋白含量的測定》和NY/T 1676—2008《食用菌中粗多糖含量的測定》，采用凱氏定氮法和苯酚-硫酸法對處理前后的香菇進行蛋白質和多糖含量的測定。

2 結果與分析

2.1 洗脫劑的確定

在料液比1∶10、洗脫劑濃度0.16 mol/L、pH 6.0、轉速150 r/min的條件下，分別選用不同的洗脫劑對香菇中重金屬鎘進行去除，探討不同洗脫劑對重金屬鎘去除率的影響，結果如圖1所示，蒸餾水對香菇中重金屬鎘的去除率僅為10.4%，相比而言，EDTA和檸檬酸對鎘去除率較高，去除率分別為55.4%和40.1%。但EDTA對眼睛、皮膚有一定刺激作用，GB 2760—2014《食品添加劑使用標準》中規(guī)定EDTA在食品中最大添加量為0.25 g/kg，而且EDTA作為吸附劑時，具有廣泛的配位性能，幾乎能與所有金屬離子形成配合物[33]，易對香菇中營養(yǎng)成分造成損失。檸檬酸作為低分子質量有機酸的一種，不僅本身可生物降解，而且對重金屬的解吸具有明顯的促進作用[34]，因此實驗選擇檸檬酸作為鎘的去除劑。

圖1 不同溶劑對鎘洗脫率的影響Fig. 1 Effects of different solvents on the removal of cadmium

2.2 單因素試驗結果

圖2 3 種因素對鎘去除率的影響Fig. 2 Effects of three factors on the removal rate of cadmium

在檸檬酸pH 6.0、轉速150 r/min的條件下，分別按照檸檬酸濃度為0.02、0.04、0.08、0.16、0.32 mol/L進行香菇中重金屬鎘的去除，探討檸檬酸濃度對香菇中重金屬鎘去除率的影響。由圖2A可知，隨著檸檬酸加入量的不斷增大，鎘的去除率逐漸增大，這可能是因為增加檸檬酸濃度可以增加擴散速率，使檸檬酸與鎘離子形成穩(wěn)定的絡合物[34]，從而降低香菇中鎘的含量。當檸檬酸濃度為0.32 mol/L時去除率達到49.0%，濃度為0.16 mol/L時去除率為47.1%。

在檸檬酸濃度0.16 mol/L、轉速150 r/min的條件下，分別按照檸檬酸pH值為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0進行香菇中重金屬鎘的去除，探討檸檬酸pH值對香菇中重金屬鎘去除率的影響。由圖2B可知，隨著溶液pH值的降低，香菇中鎘去除率不斷提高，這可能是因為低pH值條件下，鎘的去除效率主要受到質子運動的影響，隨著pH值的升高，溶液中的質子數(shù)逐漸減少，此時，去除效率取決于酸根對重金屬的絡合能力[27]。在中等酸性條件下，檸檬酸對重金屬鎘的絡合作用效果較好。

在檸檬酸濃度0.16 mol/L、pH 6.0的條件下，分別按照轉速為50、100、150、200、250 r/min進行香菇中重金屬鎘的去除，探討轉速對香菇中重金屬鎘去除率的影響。由圖2C可知，轉速對去除率影響差異顯著，提高搖床轉速，可以加快鎘離子的擴散速率，提高去除效果。轉速在100 r/min時，去除率達到最高，為43.7%。

2.3 響應面試驗結果

2.3.1 響應面試驗設計與結果

表2 響應面試驗分析結果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

根據(jù)單因素試驗結果，選擇檸檬酸濃度、檸檬酸pH值和轉速為考察因素，使用Design-Expert 8.0軟件，以鎘去除率為指標，設計三因素三水平的響應面試驗，響應面試驗結果如表2所示。通過對表2數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到回歸方程為：對擬合的模型進行方差分析及回歸系數(shù)的顯著性檢驗，結果見表3。模型P值小于0.05，即表明該模型顯著，失擬項不顯著（P=0.2333＞0.05），說明殘差是由隨機誤差引起的；模型決定系數(shù)R2=0.86，說明模型對試驗擬合程度較好，能夠真實地反映各影響因素與響應值之間的關系，因此可以利用該方程對香菇中重金屬鎘的去除率進行分析和預測。模型中A對響應值的影響顯著

（P＜0.05），說明檸檬酸濃度是影響香菇中重金屬鎘去除率的重要控制因素；3 個因素對鎘去除率的影響大小依次為檸檬酸濃度＞pH值＞轉速。

2.3.2 檸檬酸去除香菇中鎘的響應面分析

圖3 各因素交互影響鎘去除率的響應面圖Fig. 3 Response surface plots showing the effect of various factors on the removal rate of cadmium

觀察圖3中各因素之間兩兩相互作用的響應面圖形，分析其對香菇重金屬鎘去除率的影響。以圖3b為例，等高線呈橢圓形，說明檸檬酸濃度和轉速的交互作用對鎘的去除率影響較大。在所涉及的實驗條件范圍內，固定檸檬酸濃度，隨著轉速的不斷增加，鎘的去除率呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢。固定轉速，鎘的去除率呈先上升后趨于平穩(wěn)的趨勢。

2.3.3 最佳方法條件的確定與驗證

利用Design-Expert 8.0軟件分析得出最大響應值對應的因素條件為檸檬酸濃度0.32 mol/L、pH 5.0、轉速70 r/min，且模型預測重金屬鎘去除率為59.6%。為證實預測結果，按最佳去除方法條件重復實驗3 次，得到重金屬鎘去除率為57.0%，鎘的殘留量為0.41 mg/kg，低于國家限量標準0.5 mg/kg。實測值與預測值之間偏差較小，因此說明應用響應面法優(yōu)化得到的提取條件是準確可靠的。

2.4 檸檬酸洗脫對香菇有效成分的影響

圖4 不同香菇樣品鎘去除率Fig. 4 Removal rate of cadmium from different Letinous edodes samples

對于不同的香菇樣品，采用優(yōu)化得到的方法進行重金屬鎘的去除，結果如圖4所示，3 種香菇鎘含量均有明顯降低，平均去除率為52.4%。采用凱氏定氮法和苯酚-硫酸法對香菇中蛋白質和多糖的含量進行測定（圖5），未經(jīng)處理的香菇蛋白質含量為24.3%，處理后的香菇蛋白質含量為21.3%，僅降低3%；未處理的香菇多糖含量為8.37%，處理后的香菇多糖含量為8.04%，僅降低0.33%，洗脫前后香菇中多糖、蛋白質含量無顯著性差異，較好地保留了香菇中的營養(yǎng)成分。

圖5 最佳工藝條件對營養(yǎng)成分的影響Fig. 5 Effect of the optimized treatment for cadmium removal on nutrient retention

3 結 論

香菇作為一種營養(yǎng)豐富的食用菌，備受人們青睞，但是重金屬鎘污染問題日益嚴重，影響了香菇市場的進一步發(fā)展，因此研究其重金屬鎘的去除方法具有重要的實際價值。本研究通過單因素試驗和響應面試驗，對檸檬酸洗脫去除香菇重金屬鎘的方法進行了優(yōu)化，得到采用檸檬酸作為洗脫劑，在濃度0.32 mol/L、pH 5.0、 30 ℃、轉速70 r/min條件下，香菇中鎘的去除率達到最大，去除率為57.0%，相當于0.16 mol/L EDTA處理時所得到的去除率。隨后將該方法應用到不同香菇樣品中，結果顯示鎘去除率均在48%以上，平均去除率為52.4%，且去除后香菇中鎘含量均符合國家限量標準；該方法處理前后香菇中蛋白質和多糖含量無顯著性差異，對香菇營養(yǎng)成分沒有造成明顯損失。本實驗得到的香菇鎘的去除方法能顯著降低香菇中鎘的含量，對現(xiàn)實生產具有一定的指導意義。

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Removal of Cadmium from Lentinus edodes Using Citric Acid: Optimization of Processing Conditions Using Response Surface Methodology

HU Jing1, SUN Junshe2, TAN Xiaoyan1, HU Shaofeng1, QIN Zifang1, NING Huijuan1, ZHANG Xiuqing1,*
(1. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China; 2. Chinese Academy of Agricultural Engineering, Beijing 100125, China)

The removal of the heavy metal cadmium in dried Lentinus edodes using citric acid content was optimized using a combination of one-factor-at-a-time method and response surface methodology. The removal efficiency of cadmium was investigated as a function of three independent variables: citric acid concentration, pH and rotation speed. It turned out that the maximum removal rate of cadmium of 57.0% was obtained under the following optimized conditions: citric acid concentration 0.32 mol/L, pH 5.0, and rotation speed 70 r/min. After the treatment, the maximum residual cadmium content was 0.41 mg/kg, lower than the national limit of 0.5 mg/kg. Meanwhile, low losses of polysacccharides and proteins were observed suggesting good retention of nutrients in L. edodes. The proposed method could have a high application potential for reducing residual cadmium in L. edodes.

Lentinus edodes; cadmium; citric acid; response surface methodology

10.7506/spkx1002-6630-201714028

TS201.6

A

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胡靜, 孫君社, 譚曉妍, 等. 響應面法優(yōu)化檸檬酸去除香菇中鎘工藝[J]. 食品科學, 2017, 38(14): 181-186.

10.7506/ spkx1002-6630-201714028. http://www.spkx.net.cn

HU Jing, SUN Junshe, TAN Xiaoyan, et al. Removal of cadmium from Lentinus edodes using citric acid: optimization of processing conditions using response surface methodology[J]. Food Science, 2017, 38(14): 181-186. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714028. http://www.spkx.net.cn

2016-12-05

國家自然科學基金面上項目（21576142）；中國農業(yè)大學基本科研業(yè)務費項目（2017SP001）

胡靜（1993—），女，碩士研究生，研究方向為真菌多糖性質及代謝調控。E-mail：hujing9293@126.com

*通信作者：張秀清（1976—），女，副教授，博士，研究方向為次生代謝及調控。E-mail：xiuqingzhang@cau.edu.cn