銀離子絡(luò)合法分離純化余甘子核仁油中α-亞麻酸

葛雙雙，張?chǎng)?坤，馮 穎，甘 瑾，鄭 華，張 弘*

（中國林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲研究所，國家林業(yè)局特色森林資源工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650224）

銀離子絡(luò)合法分離純化余甘子核仁油中α-亞麻酸

葛雙雙，張?chǎng)?坤，馮 穎，甘 瑾，鄭 華，張 弘*

（中國林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲研究所，國家林業(yè)局特色森林資源工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650224）

利用Ag+絡(luò)合技術(shù)分離、純化余甘子核仁油中α-亞麻酸，旨在獲得高純度的α-亞麻酸。通過單因素試驗(yàn)考察了AgNO3溶液濃度、甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)、絡(luò)合時(shí)間、絡(luò)合溫度對(duì)α-亞麻酸純度及回收率的影響。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以α-亞麻酸純度及回收率為響應(yīng)值，進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化得到的最佳工藝條件為絡(luò)合溫度為0 ℃、AgNO3溶液濃度為2.29 mol/L、甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)為38.00%、絡(luò)合時(shí)間為1.93 h，在此工藝條件下，α-亞麻酸純度及回收率分別為93.30%及73.37%。對(duì)絡(luò)合后的AgNO3進(jìn)行回收并二次絡(luò)合，結(jié)果表明：AgNO3的回收率達(dá)93.83%，回收的Ag+具有較好的絡(luò)合效果，在整個(gè)絡(luò)合工藝中并未引入Ag+，因此，該方法不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)余甘子核仁油中α-亞麻酸的分離、純化，而且降低了絡(luò)合工藝的操作成本，同時(shí)具有一定安全性，為余甘子核仁油的工業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù)。

余甘子核仁油；α-亞麻酸；Ag+絡(luò)合

葛雙雙, 張?chǎng)? 李坤, 等. 銀離子絡(luò)合法分離純化余甘子核仁油中α-亞麻酸[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(14): 213-220. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714033. http://www.spkx.net.cn

GE Shuangshuang, ZHANG Wenwen, LI Kun, et al. Separation and purification of α-linolenic acid from Phyllanthus emblica L. seed oil by silver iron complexation[J]. Food Science, 2017, 38(14): 213-220. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714033. http://www.spkx.net.cn

余甘子核仁油中含有豐富的不飽和脂肪酸，其中（Z,Z,Z）-9,12,15-十八碳三烯酸（α-亞麻酸）含量更是高達(dá)68.25%[1]，這與富含α-亞麻酸的亞麻籽油[2-3]、紫蘇籽油[4]相近。α-亞麻酸屬于ω-3系列多不飽和脂肪酸，是人體不能自身合成的必需脂肪酸，具有降血脂、降血壓、抑制過敏、抗血栓、抗腫瘤、保護(hù)視力等作用[5-7]。因此，從余甘子核仁油中分離、純化高純度的α-亞麻酸，對(duì)擴(kuò)大余甘子核仁油的利用、提高油脂的附加值具有重大的意義。

目前，分離α-亞麻酸的方法主要有：分子蒸餾法[8]、超臨界流體萃取法[9-10]、尿素包合法[11-12]、柱色譜法[13]、Ag+絡(luò)合法[14-16]等[17-18]。其中，分子蒸餾法、超臨界流體萃取法、柱色譜法對(duì)設(shè)備要求較苛刻，并且操作成本高，不適合工業(yè)化生產(chǎn)[19-21]。尿素包合法具有投資少、操作簡單等特點(diǎn)，已被工業(yè)化應(yīng)用。但是，尿素包合法是基于脂肪酸中雙鍵的存在形態(tài)而分離、純化多不飽和脂肪酸，飽和與單不飽和脂肪酸比較容易進(jìn)入尿素分子間的空管道，進(jìn)而形成具有六棱柱結(jié)構(gòu)的尿素包合物，對(duì)于含有2 個(gè)及2 個(gè)以上雙鍵的多不飽和脂肪酸來說，因其碳鏈比較彎曲且具有一定的空間結(jié)構(gòu)，尿素包合法很難將其分離[22]。Ag+絡(luò)合法是基于Ag+能夠與含有特殊官能團(tuán)或結(jié)構(gòu)的有機(jī)物形成p-絡(luò)合作用[23]，目前該方法已經(jīng)成功應(yīng)用于蠶絲纖維[24]、茄尼醇[25]、萘[23]、多不飽和脂肪酸[26-27]等成分的分離純化，并且絡(luò)合效率較高。但是，相關(guān)研究中多數(shù)未對(duì)絡(luò)合后的Ag+進(jìn)行回收，并且沒有對(duì)回收的Ag+進(jìn)行再次利用，因此，使用該方法不僅增加了操作成本，而且造成了重金屬的污染，同時(shí)，對(duì)于茄尼醇、多不飽和脂肪酸等功能性成分，Ag+的使用具有一定的安全問題[28]。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)上述缺陷，在采用Ag+絡(luò)合技術(shù)對(duì)余甘子核仁油中α-亞麻酸純化基礎(chǔ)上，考慮實(shí)際操作成本及安全性問題，針對(duì)絡(luò)合后的Ag+進(jìn)行回收再利用，并對(duì)純化后的α-亞麻酸進(jìn)行Ag+殘留檢測(cè)，旨在開發(fā)出高效、低成本、安全富集α-亞麻酸的工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

余甘子核仁由中國林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲研究所景東亞熱帶試驗(yàn)站提供；混合脂肪酸由尿素包合精制。

異辛烷（分析純） 西隴化工有限公司；無水硫酸鈉（分析純） 天津風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉（分析純） 天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；正己烷、乙二醇、石油醚（沸程60～90 ℃）、硝酸銀（均為分析純） 廣東光華科技有限公司；三氟化硼甲醇絡(luò)合物上海麥克林生化科技有限公司；十九烷酸甲酯、α-亞麻酸甲酯（色譜純） 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AB204-S精密型電子天平 瑞士梅特勒-托利多（中國）有限公司；XMT-DA型數(shù)顯恒溫水浴鍋 余姚市亞星儀器儀表有限公司；DC-0210低溫恒溫槽 上海匡貝實(shí)業(yè)有限公司；N1000 Rotavapor R11型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀日本東京理化器械株式會(huì)社；ITQ 900氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、iCAP QICP-MS電感耦合等離子質(zhì)譜儀 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；DFY-5L/30低溫恒溫反應(yīng)槽鞏義市予華儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 Ag+絡(luò)合混合脂肪酸

將混合脂肪酸配制成0.2 g/mL的石油醚溶液，配制一定濃度的AgNO3-甲醇溶液，將二者等體積混合，在一定溫度條件下，于300 r/min磁力攪拌一定時(shí)間，靜置分層，將下層水相與等體積的石油醚混合，在50 ℃攪拌30 min，重復(fù)上述反萃取步驟3 次，合并石油醚相，分別用等體積的飽和氯化鈉溶液與去離子水洗滌3 次，加入無水硫酸鈉脫水，溶劑經(jīng)回收得到富含α-亞麻酸的脂肪酸。

1.3.2 脂肪酸的甲酯化

參照GB/T 17376—2008《動(dòng)植物油脂 脂肪酸甲酯制備》中三氟化硼法。

1.3.3 氣相色譜-質(zhì)譜分析條件

氣相色譜條件：CP7420毛細(xì)管柱（100 m× 0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：初始溫度100 ℃，保持20 min，以20 ℃/min的速率升至190 ℃，保持20 min，然后以1 ℃/min的速率升溫到210 ℃，保持10 min，再以20 ℃/min的速率升溫至230 ℃，最后保持1 min；進(jìn)樣口溫度230 ℃；載氣為高純氦氣，流速1.0 mL/min；分流比50∶1；進(jìn)樣量1 μL。

質(zhì)譜條件：電子電離源；離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度250 ℃；質(zhì)量掃描范圍40～400 u。

采用面積歸一化法計(jì)算α-亞麻酸的相對(duì)含量，即α-亞麻酸的純度。

1.3.4 AgNO3的回收率的測(cè)定

將反萃取后的AgNO3溶液置于45 ℃條件下，避光磁力攪拌至溶液呈糊狀，將濃縮的AgNO3溶液置于50 ℃的烘箱中，干燥至恒質(zhì)量，將樣品取出并置于干燥器中，待其冷卻至室溫后稱質(zhì)量，計(jì)算AgNO3的回收率。

1.3.5 回收AgNO3的二次絡(luò)合

配制2.29 mol/L回收的AgNO3-甲醇（甲醇-水（19∶50，V/V））溶液，加入等體積0.2 g/mL多不飽和脂肪酸溶液，在0 ℃、300 r/min磁力攪拌1.93 h。將得到的水相按照1.3.4節(jié)中反萃取步驟，萃取富含α-亞麻酸的脂肪酸。

1.3.6 純化后脂肪酸中Ag+殘留量檢測(cè)

取絡(luò)合后富含α-亞麻酸的脂肪酸0.1 g，加入10 mL硝酸，30 min后加入5 mL的H2O2，樣品搖勻后進(jìn)行微波消解。將微波消解后的樣品，用超純水定容至100 mL，樣品過0.45 μm濾膜后進(jìn)行電感耦合等離子質(zhì)譜檢測(cè)。

1.3.7 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.7.1 AgNO3濃度的確定

在絡(luò)合溫度0 ℃、絡(luò)合時(shí)間2 h、甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)40%的條件下，考察AgNO3溶液濃度分別在1、2、3、4、5 mol/L時(shí)，對(duì)α-亞麻酸純度及回收率的影響，確定AgNO3溶液濃度。

1.3.7.2 絡(luò)合時(shí)間的確定

在絡(luò)合溫度0 ℃、AgNO3溶液濃度2 mol/L、甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)40%的條件下，考察絡(luò)合時(shí)間分別在0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h時(shí)，對(duì)α-亞麻酸純度及回收率的影響，確定絡(luò)合時(shí)間。

1.3.7.3 甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)的確定

在絡(luò)合溫度0 ℃、AgNO3溶液濃度2 mol/L、絡(luò)合時(shí)間2 h的條件下，考察甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)分別在0%、10%、20%、30%、40%、50%時(shí)，對(duì)α-亞麻酸純度及回收率的影響，確定甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)。

1.3.7.4 絡(luò)合溫度的確定

在AgNO3溶液濃度2 mol/L、絡(luò)合時(shí)間2 h、甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)40%的條件下，考察絡(luò)合溫度分別在-5、0、5、10、15、20 ℃時(shí)，對(duì)α-亞麻酸純度及回收率的影響，確定絡(luò)合溫度。

1.3.8 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以α-亞麻酸純度及回收率為響應(yīng)值，以AgNO3溶液濃度、絡(luò)合時(shí)間、甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)為考察因素，進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，見表1。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and their levels used in the Box-Behnken design

1.3.9 Ag+絡(luò)合純化后脂肪酸中α-亞麻酸絕對(duì)含量的測(cè)定

1.3.9.1 α-亞麻酸校正因子的測(cè)定

[29]選取十九烷酸甲酯作為內(nèi)標(biāo)物，分別配制2、4、6、8、10 mg/mL的α-亞麻酸甲酯及2 mg/mL的十九烷酸甲酯溶液，分別移取不同質(zhì)量濃度的α-亞麻酸甲酯溶液1 mL與1 mL的十九烷酸甲酯溶液混合均勻，進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)，每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次，按公式（1）計(jì)算校正因子：

式中：fALA為α-亞麻酸的校正因子；AALA、A19分別為α-亞麻酸甲酯與十九烷酸甲酯的峰面積；mALA、m19分別為α-亞麻酸甲酯與十九烷酸甲酯的質(zhì)量/mg。

1.3.9.2 α-亞麻酸絕對(duì)含量的測(cè)定

將純化前后的脂肪酸按照1.3.2節(jié)進(jìn)行甲酯化，并分別配制成2 mg/mL的溶液，將絡(luò)合前后的脂肪酸甲酯溶液與2 mg/mL的十九烷酸甲酯溶液等體積混合，取適量混合液進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)，每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次，按公式（2）下計(jì)算α-亞麻酸的絕對(duì)含量：

式中：ωALA為α-亞麻酸的絕對(duì)含量/%；fALA為α-亞麻酸的校正因子；AALA、A19分別為α-亞麻酸甲酯與十九烷酸甲酯的峰面積；m19、m分別為十九烷酸甲酯與樣品的質(zhì)量/mg。

1.3.9.3 α-亞麻酸回收率計(jì)算

按公式（3）計(jì)算α-亞麻酸回收率：

式中：Y為Ag+絡(luò)合法純化后α-亞麻酸回收率/%；m、m1分別為混合脂肪酸質(zhì)量和Ag+絡(luò)合后混合脂肪酸質(zhì)量/g；p、p1分別為混合脂肪酸中α-亞麻酸純度和Ag+絡(luò)合后混合脂肪酸中α-亞麻酸純度/%。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 AgNO3溶液濃度對(duì)α-亞麻酸純度及回收率的影響

圖1 AgNO3溶液濃度對(duì)α-亞麻酸純度及回收率的影響Fig. 1 Effect of silver nitrate concentration on the purity and yield of α-linolenic acid

Ag+與—C＝C—絡(luò)合的原理，普遍接受Dewar-Chatt-Duncanson模型（DCD模型），該模型認(rèn)為—C＝C—中不飽和電子與Ag+能夠形成σ配位鍵；Ag+給出一對(duì)d電子到—C＝C—π*反鍵軌道，形成反饋π鍵[30-32]。因此，雙鍵越多、碳鏈越短、空間位阻越小的不飽和脂肪酸越容易與Ag+形成絡(luò)合物。如圖1所示，隨著AgNO3溶液濃度增加，α-亞麻酸的純度呈下降趨勢(shì)，相反，α-亞麻酸回收率呈上升趨勢(shì)。研究發(fā)現(xiàn)，余甘子核仁油中多不飽和脂肪酸的主要成分為（Z,Z）-9,12-十八碳二烯酸（亞油酸）和α-亞麻酸[1]。隨著Ag+濃度的增大，越來越多的α-亞麻酸與Ag+形成絡(luò)合物進(jìn)入水相[33]，在后續(xù)操作過程中更多的α-亞麻酸被洗脫分離出來，因而α-亞麻酸的回收率升高。與此同時(shí)，當(dāng)體系中Ag+濃度增大時(shí)，會(huì)形成越來越多的亞油酸-nAg+絡(luò)合物[27]，因此，α-亞麻酸相對(duì)含量，即純度下降。

2.1.2 甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)對(duì)α-亞麻酸純度及回收率的影響

圖2 甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)對(duì)α-亞麻酸純度及回收率的影響Fig. 2 Effect of volume fraction of methanol on the purity and yield of α-linolenic acid

α-亞麻酸為非極性物質(zhì)，由于碳鏈較長，當(dāng)其與Ag+形成絡(luò)合物時(shí)，仍然具有一定的疏水性[15]，因此，選擇合適的溶劑尤為重要。本實(shí)驗(yàn)選取甲醇溶液作為溶劑，能夠保持α-亞麻酸-nAg+絡(luò)合物的穩(wěn)定性[34]。如圖2所示，隨著甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)的增加，α-亞麻酸純度呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，并在甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí)達(dá)到最大值。當(dāng)甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)增加時(shí)，不僅增大了絡(luò)合萃取的分配比[16]，而且提高了α-亞麻酸-nAg+絡(luò)合物的穩(wěn)定性[15,34]，因此，α-亞麻酸的純度升高。當(dāng)甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)超過40%以后，越來越多的脂肪酸主要是因?yàn)榧状嫉奈锢砣芙庾饔眠M(jìn)入水相，而Ag+絡(luò)合作用則變?yōu)榇我饔茫瑑烧呋ハ嘧饔玫慕Y(jié)果，使得α-亞麻酸的純度下降[35]。同樣，α-亞麻酸的回收率也出現(xiàn)一個(gè)先升高后降低的趨勢(shì)，并在甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)為40%達(dá)到最高。在一定范圍內(nèi)，隨著甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)增大，越來越多的α-亞麻酸與Ag+形成絡(luò)合物，進(jìn)而分離、純化出來，當(dāng)甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)達(dá)到50%的時(shí)候，由于在低溫條件下操作，部分AgNO3在反應(yīng)的過程中析出[36]，因此，起到絡(luò)合作用的有效Ag+量相對(duì)減少，導(dǎo)致α-亞麻酸回收率下降。

2.1.3 絡(luò)合時(shí)間對(duì)α-亞麻酸純度及回收率的影響

α-亞麻酸與Ag+的絡(luò)合過程為可逆反應(yīng)，因此，需要一定的絡(luò)合時(shí)間才能達(dá)到穩(wěn)定。如圖3所示，隨著絡(luò)合時(shí)間的延長，α-亞麻酸純度呈先升高后降低的趨勢(shì)，并在絡(luò)合時(shí)間為2.0 h時(shí)達(dá)到最高。當(dāng)絡(luò)合時(shí)間比較短時(shí)，α-亞麻酸-nAg+絡(luò)合物不穩(wěn)定，并且絡(luò)合萃取的分配系數(shù)較小[34,37]，進(jìn)而被絡(luò)合的α-亞麻酸較少，因此純度比較低。當(dāng)絡(luò)合時(shí)間比較長時(shí)，Ag+不僅會(huì)絡(luò)合α-亞麻酸，也會(huì)對(duì)亞油酸有一定絡(luò)合，因而，α-亞麻酸相對(duì)含量下降，即純度下降[26]。隨著絡(luò)合時(shí)間的延長，α-亞麻酸回收率呈先升高后平緩的趨勢(shì)。隨著絡(luò)合時(shí)間的延長，越來越多的α-亞麻酸與Ag+形成較為穩(wěn)定絡(luò)合物，之后α-亞麻酸被洗脫分離出來，因此，α-亞麻酸回收率升高。當(dāng)達(dá)到2.0 h以后，絡(luò)合反應(yīng)達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡[36]，即α-亞麻酸-nAg+絡(luò)合物的量一定，被純化、分離出來的α-亞麻酸量基本恒定不變，因此，α-亞麻酸回收率基本不變。

圖3 絡(luò)合時(shí)間對(duì)α-亞麻酸純度及回收率的影響Fig. 3 Effect of complexation time on the purity and yield of α-linolenic acid

2.1.4 絡(luò)合溫度對(duì)α-亞麻酸純度及回收率的影響

圖4 絡(luò)合溫度對(duì)α-亞麻酸純度及回收率的影響Fig. 4 Effect of complexation temperature on the purity and yield of α-linolenic acid

溫度是絡(luò)合反應(yīng)的一個(gè)重要參數(shù)，不僅影響反應(yīng)過程的快慢，而且對(duì)絡(luò)合物的穩(wěn)定存在至關(guān)重要。由圖4可見，隨著絡(luò)合溫度的降低，α-亞麻酸純度先增高后降低，并且在10 ℃時(shí)達(dá)到最高。Ag+絡(luò)合過程屬于放熱反應(yīng)[28]，溫度的降低有利于絡(luò)合反應(yīng)正向進(jìn)行，越來越多的α-亞麻酸被Ag+絡(luò)合純化出來，因此，α-亞麻酸純度升高。當(dāng)絡(luò)合溫度低于10 ℃時(shí)，不僅有利于α-亞麻酸-nAg+絡(luò)合物生成，也有利于亞油酸-nAg+絡(luò)合物的穩(wěn)定存在[35]，使得部分亞油酸被反萃取出來，進(jìn)而導(dǎo)致α-亞麻酸相對(duì)含量下降，即純度下降。絡(luò)合溫度對(duì)α-亞麻酸回收率影響效果顯著，隨著絡(luò)合溫度的降低，α-亞麻酸回收率呈上升趨勢(shì)，但是，當(dāng)溫度低于0 ℃時(shí)，α-亞麻酸回收率急劇下降。α-亞麻酸與Ag+的絡(luò)合過程為放熱反應(yīng)，溫度的升高不利于α-亞麻酸-nAg+絡(luò)合物穩(wěn)定存在[34-35]，即被絡(luò)合出來的α-亞麻酸的量減少，因而α-亞麻酸回收率降低。當(dāng)溫度低于0 ℃時(shí)，有白色絮狀物質(zhì)即α-亞麻酸-nAg+絡(luò)合物沉淀產(chǎn)生[36]，白色絮狀物的存在使后續(xù)洗脫分離過程變得困難，因而，α-亞麻酸回收率的降低；另外，當(dāng)絡(luò)合溫度過低時(shí)，部分AgNO3直接析出而沒有起到絡(luò)合α-亞麻酸的效果，使得α-亞麻酸回收率降低。2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 工藝模型的建立及其顯著性檢驗(yàn)

α-亞麻酸與Ag+的絡(luò)合過程屬于放熱反應(yīng)，溫度越低越有利于絡(luò)合反應(yīng)的進(jìn)行，但是，隨著溫度的降低，AgNO3在甲醇溶液中的溶解度降低，當(dāng)溫度過低時(shí)，部分AgNO3直接析出，并未真正起到絡(luò)合作用。在實(shí)際操作過程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溫度低于0 ℃時(shí)，α-亞麻酸-nAg+絡(luò)合物形成沉淀，不利于后續(xù)的反萃取過程，因此，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗(yàn)方案進(jìn)行三因素三水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選用絡(luò)合溫度為0 ℃，以AgNO3溶液濃度、甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)、絡(luò)合時(shí)間為考察因素，α-亞麻酸純度Y1以及α-亞麻酸回收率Y2為響應(yīng)值，見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Box-Behnken design arrangement with response variables

對(duì)表2中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到以α-亞麻酸純度Y1及α-亞麻酸回收率Y2為目標(biāo)函數(shù)的2 個(gè)二次多元回歸方程，如表3所示。由2 個(gè)數(shù)學(xué)模型的決定系數(shù)（R2）及預(yù)測(cè)決定系數(shù)（R2Adj）可知，2個(gè)數(shù)學(xué)模型的擬合程度較好，因而模型可靠性高。

由表4可知，2 個(gè)回歸模型失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），并且α-亞麻酸純度及回收率回歸模型極顯著（P＜0.000 1），表明2 個(gè)模型實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值擬合度較好，因而該模型能較好地分析和預(yù)測(cè)余甘子核仁油中α-亞麻酸的純化效果。

表 3α-亞麻酸純度及回收率回歸模型擬合結(jié)果Table 3 Fitted regression models for the purity and yield of α-linolenic acid

表4 α-亞麻酸純度及回收率方差分析結(jié)果Table 4 Analysis of variance for the purity and yield of α-linolenic acid

對(duì)于α-亞麻酸純度Y1，一次項(xiàng)A（AgNO3溶液濃度）、B（甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)）、C（絡(luò)合時(shí)間）均極顯著；交互項(xiàng)AB、AC、BC均極顯著；二次項(xiàng)A2不顯著，B2、C2均極顯著。結(jié)合表4中F值大小，可知各因素對(duì)α-亞麻酸純度影響效應(yīng)依次為：AgNO3溶液濃度＞甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)＞絡(luò)合時(shí)間。

對(duì)于α-亞麻酸回收率Y2，一次項(xiàng)A（AgNO3濃度）、B（甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)）極顯著，C（絡(luò)合時(shí)間）顯著；交互項(xiàng)AB極顯著，AC、BC均不顯著；二次項(xiàng)A2、B2均極顯著，C2不顯著。結(jié)合表4中F值大小，可知各因素對(duì)α-亞麻酸回收率影響效應(yīng)依次為：AgNO3溶液濃度＞甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)＞絡(luò)合時(shí)間。

2.2.2 響應(yīng)面分析

圖5 兩因素交互作用對(duì)α-亞麻酸純度和回收率影響的響應(yīng)面圖Fig. 5 Response surface plots for the interactive effects of various factors on the yield of α-linolenic acid

如圖5所示，AgNO3溶液濃度、甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)、絡(luò)合時(shí)間3 個(gè)因素對(duì)α-亞麻酸純度和回收率的影響，并能夠反映3 個(gè)因素中任何兩因素的交互影響。3 個(gè)因素中，AgNO3溶液濃度對(duì)α-亞麻酸純度和回收率的影響最大，其次是甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)，絡(luò)合時(shí)間影響最小。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在Design-Expert 8.0.6優(yōu)化下，最佳組合條件為AgNO3溶液濃度2.29 mol/L、甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)37.90%、絡(luò)合時(shí)間1.93 h，在此條件下響應(yīng)面模型預(yù)測(cè)得到的α-亞麻酸純度及回收率分別為94.13%、70.59%。考慮到實(shí)際工藝操作，將優(yōu)化條件圓整為：AgNO3溶液濃度2.29 mol/L、甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)38.00%、絡(luò)合時(shí)間1.93 h，進(jìn)行3 次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得α-亞麻酸純度及回收率分別為（93.30±0.21）%、（73.37±0.51）%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測(cè)值結(jié)果相差不大，說明2 個(gè)模型方程與實(shí)際情況擬合度較好，響應(yīng)面法得到的模型方程，用于預(yù)測(cè)Ag+絡(luò)合余甘子核仁油中的α-亞麻酸過程是可行的。

2.4 絡(luò)合前后脂肪酸成分分析

如圖6A、B所示，以α-亞麻酸甲酯與十九烷酸甲酯的質(zhì)量濃度比為橫坐標(biāo)（x），相對(duì)應(yīng)的α-亞麻酸甲酯與十九烷酸甲酯峰面積比為縱坐標(biāo)（y），進(jìn)行線性回歸，其回歸方程以及α-亞麻酸甲酯的校正因子，結(jié)果見表5。由圖6C可知，混合脂肪酸主要有5 種脂肪酸，其中，飽和脂肪酸相對(duì)含量為1.14%，單不飽和脂肪酸相對(duì)含量為2.95%，多不飽和脂肪酸相對(duì)含量為95.23%。

圖6 Ag＋絡(luò)合法純化前后混合脂肪酸總離子流圖（A、B）和脂肪酸相對(duì)含量變化（C）Fig. 6 Total ion current (TIC) chromatograms of mixed fatty acids and changes in relative contents of fatty acids before and after silver iron complexation

表 5α-亞麻酸甲酯相對(duì)十九烷酸甲酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線及校正因子Table 5 Standard curve and correction factor forα-linolenic acid methyl ester relative to nonadecanoic acid methyl ester

混合脂肪酸經(jīng)過Ag+絡(luò)合后，α-亞麻酸的絕對(duì)含量則由原來的71.06%提高到94.17%，α-亞麻酸回收率為73.37%。分離、純化得到的α-亞麻酸為人體不能自身合成而必需從外界攝取的必需脂肪酸，利用Ag+絡(luò)合法將余甘子核仁油中的α-亞麻酸分離、純化出來，為以后余甘子核仁油的進(jìn)一步開發(fā)提供了良好的基礎(chǔ)。

2.5 AgNO3的回收及其二次絡(luò)合效果分析

圖7 不同種類AgNO3對(duì)α-亞麻酸純度及回收率的影響Fig. 7 Effect of fresh and recovered silver nitrate on the purity and yield of α-linolenic acid

為避免Ag+對(duì)環(huán)境的污染，降低工藝成本，本實(shí)驗(yàn)對(duì)絡(luò)合后的AgNO3進(jìn)行回收，回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，回收率達(dá)到93.83%。將回收的AgNO3進(jìn)行重復(fù)絡(luò)合α-亞麻酸實(shí)驗(yàn)，如圖7所示。新鮮的AgNO3與回收的AgNO3絡(luò)合后的混合脂肪酸中α-亞麻酸純度相差2.34%，α-亞麻酸回收率相差0.98%，整體來看，回收的AgNO3仍然具有較好的絡(luò)合效果，并且，絡(luò)合后的AgNO3回收率較高。因此，該方法不僅能夠降低Ag+對(duì)環(huán)境的污染，有利于環(huán)保，而且，大大節(jié)省了該工藝的操作成本，對(duì)以后的工業(yè)化應(yīng)用具有一定的指導(dǎo)意義。

2.6 純化后脂肪酸中Ag+含量分析

表6 不同樣品中Ag＋含量變化Table 6 Comparison of silver iron content in different samples

由表6可知，混合脂肪酸中含有一定的Ag+，它的來源可能分為2 個(gè)部分：來源于未經(jīng)任何加工的余甘子核仁本身，余甘子果樹在生長過程中會(huì)富集土壤或水體當(dāng)中的Ag+，且通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)余甘子核仁中Ag+含量為4.80 ng/g；來源于加工過程，混合脂肪酸的制備需要經(jīng)過余甘子核仁油的提取、皂化等一系列的加工過程，在加工過程中，用到的試劑中可能含有Ag+，因而，混合脂肪酸的加工過程亦是原料及試劑中的Ag+不斷被富集的過程，這也從側(cè)面印證了不飽和脂肪酸對(duì)Ag+有較強(qiáng)的絡(luò)合能力，該配位鍵極易形成，從而使得混合脂肪酸中Ag+含量高于余甘子核仁。經(jīng)Ag+絡(luò)合后混合脂肪酸中Ag+含量略低于混合脂肪酸，說明在絡(luò)合過程中并未引入Ag+，相反，在后續(xù)反萃取過程中，利用飽和氯化鈉溶液以及蒸餾水洗滌時(shí)，將混合脂肪酸中部分Ag+經(jīng)沉淀去除，同時(shí)也說明了反萃取方法能夠?qū)⒅舅崤cAg+較為徹底的洗脫分離。Ag+絡(luò)合法純化后的α-亞麻酸產(chǎn)品中Ag+含量遠(yuǎn)低于硝酸銀硅膠柱層析法純化后魚油中的二十碳五烯酸[38]，說明該方法具有一定的安全性。由上述結(jié)果可知，絡(luò)合后的α-亞麻酸產(chǎn)品中并未引入Ag+，這為純化后的α-亞麻酸進(jìn)一步利用打下良好的基礎(chǔ)[39]。

3 討 論

利用Ag+絡(luò)合技術(shù)成功將余甘子核仁油中α-亞麻酸分離、純化出來。通過響應(yīng)面優(yōu)化，確定了最佳Ag+絡(luò)合工藝參數(shù)：絡(luò)合溫度0 ℃、AgNO3溶液濃度2.29 mol/L、甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)38.00%、絡(luò)合時(shí)間1.93 h，在此工藝條件下，α-亞麻酸純度為93.30%，混合脂肪酸中的α-亞麻酸有73.37%被回收。經(jīng)過分離、純化之后的α-亞麻酸絕對(duì)含量達(dá)到94.17%。對(duì)絡(luò)合后的AgNO3進(jìn)行回收，回收率高達(dá)93.83%，回收后的AgNO3仍然具有較好的絡(luò)合效果，因此，該方法不僅實(shí)現(xiàn)了AgNO3回收再利用，而且大大降低了該工藝的操作成本。考慮到產(chǎn)品安全性問題，對(duì)絡(luò)合后的α-亞麻酸進(jìn)行Ag+離子殘留檢測(cè)，結(jié)果顯示，該工藝并未引入Ag+離子，相反，在后續(xù)操作過程中，還將混合脂肪酸中部分Ag+離子進(jìn)行沉淀去除，這為純化得到的α-亞麻酸進(jìn)一步利用提供了安全保障。

Ag+離子絡(luò)合技術(shù)分離、純化余甘子核仁油中α-亞麻酸，方法操作簡單，AgNO3可重復(fù)利用，操作成本大大降低，并且絡(luò)合過程是在低溫條件下完成的，能更好地保持α-亞麻酸活性，得到的α-亞麻酸產(chǎn)品中并未引入Ag+，具有一定的安全性。因此，該方法對(duì)余甘子核仁油中α-亞麻酸的開發(fā)及工業(yè)應(yīng)用，具有一定的指導(dǎo)意義。

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Separation and Purification of α-Linolenic Acid from Phyllanthus emblica L. Seed Oil by Silver Iron Complexation

GE Shuangshuang, ZHANG Wenwen, LI Kun, FENG Ying, GAN Jin, ZHENG Hua, ZHANG Hong*
(Research Center of Engineering and Technology on Forest Resources with Characteristics, State Forestry Administration, Research Institute of Resources Insects, Chinese Academy of Forestry, Kunming 650224, China)

The objective of this research was to purify α-linolenic acid from Phyllanthus emblica L. seed oil by using silver iron complexation in order to obtain high purity and yield of α-linolenic acid. Firstly, the effects of silver nitrate concentration, volume fraction of methanol, complexation time and complexation temperature on the purity and yield of α-linolenic acid were investigated by one-factor-at-a-time method. Afterwards, three independent variables were selected out of the four process parameters for the optimization experiments which were done using Box-Behnken design with the purity and yield of α-linolenic acid as response variables. The results indicated that the optimal process parameters were obtained as follows: complexation temperature, 0 ℃; silver nitrate concentration, 2.29 mol/L; methanol volume fraction, 38.00%; and complexation time, 1.93 h, under which the purity and yield of α-linolenic acid were 93.30% and 73.37%, respectively. The remaining silver nitrate was recovered for a second complexation. The recovery of silver nitrate was 93.83% and the recovered Ag+still had good complexation effect. Particularly, exogenous Ag+was not introduced in the whole complexation process. Therefore, this method allowed successful separation and purification of α-linolenic acid from P. emblica L. seed oil while reducing the operating cost. Meanwhile, the method of silver iron complexation was safe and helpful for industrial application of P. emblica L. seed oil.

Phyllanthus emblica L. seed oil; α-linolenic acid; silver iron complexation

10.7506/spkx1002-6630-201714033

TQ645.6；TS225.1

A

1002-6630（2017）14-0213-08引文格式：

2016-10-26

“十三五”國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃重點(diǎn)專項(xiàng)（2016YFD0600806）；

中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（riricaf2015003M）

葛雙雙（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物開發(fā)與利用。E-mail：geshuangshuang0407@163.com

*通信作者：張弘（1963—），男，研究員，博士，研究方向?yàn)榱謽I(yè)生物資源化學(xué)與工程。E-mail：kmzhhong@163.com