響應面試驗優化豌豆胰蛋白酶抑制劑超聲粗提工藝

俞紅恩，劉紅開，康玉凡,*

（1.中國農業大學農學院，北京 100193；2.濟南大學商學院，山東 濟南 250002）

響應面試驗優化豌豆胰蛋白酶抑制劑超聲粗提工藝

俞紅恩1，劉紅開2，康玉凡1,*

（1.中國農業大學農學院，北京 100193；2.濟南大學商學院，山東 濟南 250002）

利用響應面分析法對豌豆胰蛋白酶抑制劑超聲輔助粗提工藝進行優化。通過單因素試驗篩選最佳單因素條件：樣品顆粒度80 目、超聲頻率40 kHz、超聲時間13 min、超聲溫度40 ℃、料液比1∶80（g/mL）、超聲功率500 W。在單因素試驗基礎上，選取超聲時間、超聲溫度、料液比、超聲功率為自變量，胰蛋白酶抑制劑總活性為響應值，根據Box-Behnken試驗設計原理采用四因素三水平的響應面分析法，并且建立二次多項式回歸方程的預測模型。根據回歸模型，在超聲頻率40 kHz、樣品顆粒度80 目的條件下，確定豌豆胰蛋白酶抑制劑總活性最高的優化組合為超聲時間16 min、超聲溫度50 ℃、料液比1∶100（g/mL）、超聲功率500 W，豌豆胰蛋白酶抑制劑總活性為574.54 TIU/g，與理論預測值582.80 TIU/g相比，其相對誤差為1.42%；R2Adj=0.886 4，R2=0.943 2，說明該模型擬合程度較好，通過響應面優化后得出的回歸方程具有一定的實踐指導意義。

豌豆；胰蛋白酶抑制劑；提取；響應面法；超聲

豌豆（Pisum sativum L.），又名畢豆、國豆、荷蘭豆、麥豆等[1]，種質資源豐富、來源廣、產量高、價格低，是我國重要的食用豆類之一，具有糧食、蔬菜、飼料及醫藥等多種用途。豌豆含有豐富的蛋白（20%～24%，高于豇豆、綠豆）、淀粉、維生素、礦物質和多種人體必需氨基酸[2]，且賴氨酸、色氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸等必需氨基酸比例均衡，含量（高于蠶豆和大豆）均符合聯合國糧農組織與世界衛生組織所推薦的標準模式[3]。豌豆可以加工成多種食品，如速溶豌豆粉、豌豆醬等，主要用于制作粉絲（主要成分為淀粉）；豌豆也被加工成各類休閑食品，廣受歡迎。同時，豌豆品種中胰蛋白酶抑制劑（trypsin inhibitor，TI）含量也較高。Hobday等[4]研究發現在無菌環境中發芽的豌豆種子中含有能夠抑制胰蛋白酶活性的蛋白成分。Howard[5]發現新西蘭豌豆栽培品種中的TI有3～9 種亞型。TI結構與大豆結構相似，存在6 種亞型，分子質量為6.8～7.9 kD[6]。Clemente等[7]研究指出，TI的一種亞型能劑量依賴性地抑制人體早期結腸癌細胞HT29，這對研究TI亞基特定性功能有一定的參考價值。Wang Xiaofang等[8]報道在加拿大5 個地區種植的17 個豌豆品種中的TI活性品種間差異顯著，這為在不同地區篩選優質豌豆提供指導意義。TI的傳統粗提取主要是通過磁力攪拌浸提數小時后進行熱變性處理、硫酸銨分級沉淀或等電點聚沉、納濾膜超濾等方法除雜蛋白得粗提液。付煊赫[9]以正交試驗法研究發現鷹嘴豆TI的最佳提取工藝為pH 4.0，提取料液比1∶40，50 ℃浸提1.5 h。梁雪華等[10]以響應面法優化大豆TI粗提工藝。然而，國內學者對TI的研究多集中于大豆、綠豆及紅小豆等少數幾類，對TI的研究還鮮有報道，并且TI的粗提方式主要為磁力攪拌浸提，耗時較長。

TI泛指具有抑制胰蛋白酶活性作用的小分子蛋白或多肽，在動植物等生命體內廣泛存在，是自然界中含量最為豐富的蛋白種類之一。TI可與機體內相應的蛋白水解酶形成動態平衡體系，參與調節眾多重要的生命活動[11]。植物儲藏器官，如種子、果實、塊莖中含有相對較多的TI。TI是一種抗營養因子[12]，能與食道中的胰蛋白酶結合從而影響營養物質的消化吸收；然而TI也是一種重要的生理活性蛋白，參與調控眾多機體生理代謝活動，如降血糖[13-14]、抑癌消炎[15-16]、輻射保護[17]、抗病蟲[18]等，應用前景良好。鑒于TI的雙重功效，使其在醫學、農業及食品科技等領域有了越來越多的應用，因此針對不同豆類TI在醫學及營養學等領域的研究有著重大意義。

超聲波提取法是一種優良的提取方法，因其操作簡單、方便、能耗低，已經被廣泛運用于天然植物的生物堿、多糖、苷類及蛋白質等有效成分的提取。超聲輔助提取法主要是利用超聲波具有的機械效應、空化效應及熱效應，通過增大介質分子的運動速度、加大介質的穿透力即能夠破壞植物細胞壁，使溶劑易于滲入細胞內，進而提高生物有效成分的提取效率[19]。響應面法是在試驗設計的基礎上，通過試驗所得數據，建立數學模型來快速有效地確定多因子系統的最佳條件，由于采取了更為合理的試驗設計，能以最為經濟的方式對試驗進行全面研究，該法已廣泛地應用于食品工業、化學化工等方面的研究[20-22]，然而利用響應面法來優化超聲輔助提取豌豆TI粗提工藝的研究鮮有報道。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豌豆為成豌8號，收獲年份2016年，來自四川農業科學研究院，旋風磨研磨，置于4 ℃冰箱中備用。

苯甲酰-DL-精氨酸-對硝基酰胺鹽（Nα-benzoyl-DL-arginine 4-nitroanilide hydrochloride，BAPNA）、胰蛋白酶（酶活力大于250 NFU/mg） 美國Sigma公司；Tris、無水氯化鈣、二甲基亞砜等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

1093 CYCLOTEC旋風磨 瑞典Foss公司；全波長酶標儀 賽默飛世爾公司；KQ-500E型超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；多管旋渦混合儀 杭州米歐儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 豌豆TI的提取

TI的提取采用超聲波輔助水浸提取法。

1.3.2 豌豆TI含量的測定

TI含量的測定參照文獻[23-24]進行，胰蛋白酶可催化水解BAPNA，引起410 nm波長處吸光度的增加，而TI可抑制胰蛋白酶的活性，使410 nm波長處吸光度增加的幅度有所減少，以其減少的程度表示此抑制劑的抑制能力，從而計算抑制活性。

溶液配制：Tris-HCl緩沖液：0.222 g CaCl2溶于100 mL 0.05 mol/L、pH 8.2 Tris-HCl緩沖液；BAPNA溶液（現用現配）：先以0.5 mL二甲基亞砜溶解0.02 g BAPNA，再用已預熱37 ℃的Tris-HCl緩沖液定容至50 mL；胰蛋白酶溶液：0.004 g胰蛋白酶用0.001 mol/L的HCl溶液溶解并定容至50 mL；30%乙酸溶液：分別量取30 mL冰乙酸及70 mL蒸餾水，混勻。

微反應板上依次加入50 μL樣品液、50 μL胰蛋白酶液，37 ℃保溫10 min后，加入125 μL BAPNA溶液，37 ℃保溫30 min，加入25 μL乙酸溶液終止反應。在410 nm波長處用酶標儀測定吸光度[25]。豌豆胰蛋白酶抑制活性單位定義為：在上述反應條件下能夠抑制1 mg胰蛋白酶活性所需要的TI量為1個活性單位（TIU）。

1.3.3 響應面試驗設計

根據單因素試驗的結果，以超聲時間、超聲溫度、料液比、超聲功率設計四因素三水平響應面試驗，確定成豌8號中TI最佳提取條件。響應面試驗因素水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗因素與水平Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used in Box-Behnken design

2 結果與分析

2.1 豌豆TI超聲粗提單因素試驗結果

2.1.1 樣品顆粒度選擇

圖1 樣品顆粒度對TI總活性的影響Fig. 1 Effect of sample granularity on trypsin inhibitory activity

控制反應條件為超聲頻率40 kHz、超聲功率300 W、超聲時間10 min、超聲溫度40 ℃、料液比1∶100，考察以孔徑為40、60、80、100 目篩網對樣品進行分級過篩，并測定TI的總活性。由圖1可知，隨著豆粉篩網目數的增加，TI總活性也增加，當豆粉篩網目數為80目時TI總活性最大，當篩網目數大于80目時，TI總活性下降。成豌8號含油量低，粉碎過篩徹底，成豌8號過40目篩網所得樣品顆粒包含了絕大部分的種皮顆粒物，因而TI總活性相對較低。因此選擇豆粉顆粒度最佳為過80目篩網。

2.1.2 超聲頻率選擇

圖2 超聲頻率對TI總活性的影響Fig. 2 Effect of ultrasonic frequency on trypsin inhibitory activity

控制反應條件為樣品過80目孔徑篩網、超聲功率300 W、超聲時間10 min、超聲溫度40 ℃、料液比1∶100，考察在超聲頻率為20、40、80 kHz時TI總活性。由圖2可知，超聲頻率為20 kHz和40 kHz時，豌豆TI總活性提高且存在顯著差異，超聲頻率為40 kHz和80 kHz時，二者TI總活性不存在顯著差異。因此，選擇40 kHz作為最佳超聲頻率。

2.1.3 超聲功率選擇

圖3 超聲功率對TI總活性的影響Fig. 3 Effect of ultrasonic power on trypsin inhibitory activity

控制反應條件為樣品過80目孔徑篩網、超聲頻率40 kHz、超聲時間10 min、超聲溫度40 ℃、料液比1∶100，考察在超聲功率為200、300、400、500、600 W時提取的TI總活性。由圖3可知，隨著超聲功率的增加，豌豆TI的總活性也升高，當超聲頻率達到500 W時，TI總活性達到最大；但超聲功率過大反而引起TI總活性下降，說明超聲功率對TI總活性的影響是雙向的，既存在正效應又存在負效應。超聲波在提取液中產生的空化效應和機械作用可以有效地破碎植物細胞壁，使有效成分呈游離狀態并溶入提取溶劑。因此，一定功率時可促進TI的提取；當功率過高時，TI會在超聲的作用下分解，同時，也會使更多的脂溶性物質溶入提取液中，影響后期TI的純化。試驗中應避免超聲波功率過大而引起TI總活性的下降，同時超聲功率升高會引起溫度升高。因此，選擇500 W作為最優超聲功率。

2.1.4 超聲時間選擇

圖4 超聲時間對TI總活性的影響Fig. 4 Effect of ultrasonic radiation time on trypsin inhibitory activity

控制反應條件為樣品過80目孔徑篩網、超聲頻率40 kHz、超聲功率500 W、超聲溫度40 ℃、料液比1∶100，考察在超聲時間為5、9、13、17、21、25 min時提取的TI總活性。由圖4可知，隨著超聲時間的延長，豌豆TI的溶出量增加。當超聲時間為13 min時，TI總活性達到最大，但13 min后，超聲時間的延長反而使TI總活性下降，這是因為超聲時間的延長增加了超聲波作用的強度，不僅破壞細胞壁，而且破壞了豌豆TI的高級結構，導致TI總活性下降[26]。粗提液中蛋白變性也可能是由于氣泡的融合及氣液層對蛋白分子的吸附作用[27]。因此，選擇13 min作為最優超聲時間。

2.1.5 超聲溫度選擇

圖5 超聲溫度對TI總活性的影響Fig. 5 Effect of ultrasonic temperature on trypsin inhibitory activity

控制反應條件為樣品過80目孔徑篩網、超聲頻率40 kHz、超聲功率500 W、超聲時間13 min、料液比1∶100，考察在常溫對照（CK）和超聲溫度30、40、50、60、70 ℃時提取的TI總活性。由圖5可知，隨著超聲溫度的升高，使細胞壁滲透性增強，同時增加提取物的擴散系數和溶解度，降低溶劑黏度，使更多的豌豆TI溶于溶劑中，繼而豌豆TI總活性逐漸升高，當超聲時間升到40 ℃時，TI總活性達到最大，隨著超聲溫度的進一步升高，TI總活性出現下降的趨勢，超聲的熱效應使提取溫度隨時間的延長而逐漸上升，溫度過高導致部分TI蛋白變性失活、內部的氧化還原及聚合反應，同時容易造成溶劑揮發損失及豆粉中其他成分溶解度的增大，從而影響TI總活性的測定。因此，選擇40 ℃作為最優超聲時間。

2.1.6 料液比選擇

圖6 料液比對TI總活性的影響Fig. 6 Effect of solid-to-liquid ratio on trypsin inhibitory activity

控制反應條件為樣品過80目孔徑篩網、超聲頻率40 kHz、超聲功率500 W、超聲時間13 min、超聲溫度40 ℃，考察料液比在1∶40、1∶60、1∶80、1∶100、1∶120、1∶140時提取的TI總活性。由圖6可知，隨著溶劑用量的增加，從細胞內到溶劑之間擴散的濃度梯度增大，豌豆TI浸提量增加，但溶劑用量達到一定程度時，豌豆種子中TI接近全部溶出，再增加溶劑用量反而使TI總活性下降，可能是因為豆粉中一些其他物質如多糖溶解，妨礙了TI提取分離。溶劑用量增大在一定程度上提高傳質推動力，但從提取效果、減少溶劑用量、降低能耗等方面綜合考慮，溶劑用量也不宜過大。當料液比為1∶80時，TI總活性達到最大，因此，選擇1∶80作為最優料液比。

2.2 響應面試驗結果

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

通過Design-Expert 8.0.6軟件對表2的數據進行多元回歸擬合，獲得編碼自變量超聲時間（A）、超聲溫度（B）、料液比（C）、超聲功率（D）對TI總活性（Y）的二次多項回歸方程：Y=514.16-15.74A+8.94B+ 30.26C-17.76D+24.16AB+23.15AC-4.29AD+8.90BC-11.36BD+17.79CD-23.01A2-3.14B2+9.95C2-17.72D2。對該回歸模型及系數進行顯著性檢驗，結果見表3。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model

由表3可知，一次項A、C、D對結果的影響極顯著（P＜0.01）；B對結果的影響顯著（P＜0.05）；AB、AC、CD交互作用極顯著（P＜0.01）；二次項A2、D2影響極顯著（P＜0.01）；C2影響顯著（P＜0.05）；失擬項不顯著（P＞0.05）。模型調整確定系數R2Adj為0.886 4，說明模型能解釋88.64%響應值的變化，擬合程度較好；因變量與所考察自變量之間的復相關系數R2為0.9432，說明該模型擬合程度較好[28-29]，試驗誤差小，可用該回歸方程代替真實點對試驗結果進行分析。由表3還可知，各因素對TI總活性影響程度的大小順序為：料液比＞超聲功率＞超聲時間＞超聲溫度。

根據回歸模型，得出TI總活性最高的優化組合為超聲時間15.91 min、超聲溫度50 ℃、料液比1∶100 （g/mL）、超聲功率459.14 W，TI總活性的理論最高值為582.80 TIU/g。

在回歸模型方差分析結果的基礎上，根據得到的回歸二次方程，做超聲時間、超聲溫度、料液比、超聲功率對TI總活性影響的響應面圖，分析兩個因素交互作用對TI總活性的影響。從圖7可看出，每組因素交互作用下，TI總活性均有最大值，說明各組交互作用對TI總活性有影響。響應面的形狀可反映出各因素交互作用對TI總活性的影響，曲面越陡峭[30]，影響越顯著。

圖7 兩因素交互作用對TI總活性的響應面圖Fig. 7 Response surface plot showing the effect of operating parameters on trypsin inhibitory activity

根據Box-Behnken模型預測響應面優化的最佳工藝條件，考慮到實際操作的可行性，將豌豆TI粗提條件調整為超聲時間16 min、超聲溫度50 ℃、料液比1∶100（g/mL）、超聲功率500 W，此時TI總活性為574.54 TIU/g。該值與理論值接近，說明采用響應面法優化豌豆TI粗提工藝可行。

3 結 論

采用超聲輔助提取豌豆TI，在單因素試驗的基礎上，通過響應面Box-Behnken試驗設計，建立了TI總酶活的二次多項式數學模型。優化超聲提取豌豆TI的最佳工藝條件為超聲時間16 min、超聲溫度50 ℃、料液比1∶100 （g/mL）、超聲功率500 W，在此條件下實際測定的TI總活性為574.54 TIU/g，僅與響應面理論預測值相差1.42%，說明以上數學模型對豌豆TI的粗提條件的優化具有可行性。豌豆種子中含有豐富的TI，采用響應面分析法優化超聲輔助提取TI粗提工藝，較傳統的磁力攪拌浸提方法大大節省了提取時間，為TI的進一步純化與利用提供重要參考。

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Optimization of Ultrasonic-Assisted Extraction of Trypsin Inhibitor from Pea Seeds by Response Surface Methodology

YU Hong’en1, LIU Hongkai2, KANG Yufan1,*
(1. College of Agronomy and Biotechnology, China Agricultural University, Beijing 100193, China; 2. Business School, University of Jinan, Jinan 250002, China)

The purpose of the current study was the optimization of the solvent extraction of trypsin inhibitor from pea seeds

with ultrasonic assistance. A sample granularity of 80 mesh, an ultrasonic frequency of 40 kHz, a radiation time of 13 min, an extraction temperature of 40 ℃, a solid-to-solvent ratio of 1:80 (g/mL), and an ultrasonic power of 500 W were determined to be optimal using one-factor-at-a-time method. Ultrasonic treatment time, extraction temperature, solid-to-solvent and ultrasonic power were taken as independent variables for further optimization by establishing a quadratic polynomial regression model to predict trypsin inhibitor activity using a Box-Behnken design and analyzing the model by response surface methodology. The final optimized extraction conditions were found to be 80 mesh, 40 kHz, 16 min, 50 ℃, 1:100 (g/mL) and 500 W for sample granularity, and ultrasonic frequency, ultrasonic treatment time, extraction temperature, 50 ℃and solid-to-solvent ratio, respectively. Under these conditions, the maximum trypsin inhibitor activity of 574.54 TIU/g was obtained experimentally, showing a relative error compared to the predicted value of 1.42%. The developed model exhibited an adjusted coefficient of determinationof 0.886 4 and a coefficient of determination (R2) of 0.943 2, indicating an excellent goodness of fit. The model is of great guidance significance.

pea; trypsin inhibitor; extraction; response surface methodology; ultrasonic

10.7506/spkx1002-6630-201714035

S529

A

1002-6630（2017）14-0227-06

俞紅恩, 劉紅開, 康玉凡. 響應面試驗優化豌豆胰蛋白酶抑制劑超聲粗提工藝[J]. 食品科學, 2017, 38(14): 227-232.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714035. http://www.spkx.net.cn

YU Hong’en, LIU Hongkai, KANG Yufan. Optimization of ultrasonic-assisted extraction of trypsin inhibitor from pea seeds by response surface methodology[J]. Food Science, 2017, 38(14): 227-232. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201714035. http://www.spkx.net.cn

2016-09-07

國家現代農業產業技術體系建設專項（CARS-09-06B）

俞紅恩（1992—），女，碩士研究生，研究方向為豌豆胰蛋白酶抑制劑提取純化與特性。E-mail：15600912395@163.com

*通信作者：康玉凡（1963—），女，教授，博士，研究方向為種子生物學及豆類芽菜理論與技術。E-mail：yfkang@cau.edu.cn