失活乳酸菌去除柑橘汁中鏈格孢霉毒素TeA工藝優化

葛 娜，彭幫柱*，徐曉云，潘思軼

（華中農業大學食品科學技術學院，湖北 武漢 430070）

失活乳酸菌去除柑橘汁中鏈格孢霉毒素TeA工藝優化

葛 娜，彭幫柱*，徐曉云，潘思軼

（華中農業大學食品科學技術學院，湖北 武漢 430070）

柑橘果實易受鏈格孢霉菌等病原微生物的污染產生并積累鏈格孢霉毒素，其中細交鏈孢菌酮酸（tenuazonic acid，TeA）是毒性最強的一種鏈格孢霉毒素，具有潛在的致癌性和細胞毒性，對消費者的健康和安全構成嚴重威脅。為降低柑橘汁中TeA含量，本研究利用滅活乳酸菌菌體細胞作為吸附劑，主要研究其吸附去除柑橘汁中TeA的工藝條件。首先通過單因素試驗分析滅活乳酸菌菌粉添加量、吸附時間、TeA初始質量濃度和pH值對TeA去除率的影響，然后采用響應面法Box-Behnken設計對吸附去除橙汁中TeA工藝條件進行了優化，得到最佳工藝參數為滅活乳酸菌菌粉添加量1.20 g/20 mL、吸附時間11.43 h、TeA初始質量濃度250 μg/L、橙汁pH 3.15，在此條件下，TeA去除率為86.98%。同時建立了TeA去除率與各影響因素間的二次多項式回歸模型，并對該模型進行了驗證，結果表明模型擬合程度高，預測效果好。

失活乳酸菌；鏈格孢霉毒素細交鏈孢菌酮酸（TeA）；吸附；柑橘汁

鏈格孢霉毒素細交鏈孢菌酮酸（tenuazonic acid，TeA）是鏈格孢霉、稻瘟病霉等在特定條件下產生的有毒代謝產物之一[1-2]，其毒素水平居各種鏈格孢霉毒素之首[3-4]，對蛋白質合成具有抑制作用，具有潛在的致癌性和細胞毒性，對人的健康和安全構成嚴重威脅[5-6]。

鏈格孢霉可污染谷物[7-8]、果蔬[9-11]、飲料[12-14]、嬰兒食品[15]等；現有文獻證實柑橘果實被鏈格孢霉菌株侵染后能夠產生大量TeA[16-19]。但是，目前缺乏系統的風險評估、限量標準和去除方法等相關研究。

目前真菌毒素的去除方法主要有物理吸附法[20]和化學降解法[21]。無論是物理方法還是化學方法都會在一定程度上引起果汁感官品質和理化性質的變化，并且化學方法存在效果不穩定、化學物質與真菌毒素反應機理和反應后的降解產物不確定、處理成本高、操作困難等缺點。此外，在食品中添加化學添加劑是不被提倡的，在一定程度上影響食品的天然性，因此亟需建立一種安全、高效的方法去除真菌毒素。采用微生物去除真菌毒素的方法逐漸成為一個研究熱點，該方法有望成為一種安全、高效解決真菌毒素污染的方法。

生物吸附法是指以酵母、乳酸菌等生物體細胞及其衍生物為吸附劑，從而實現環境及樣品中污染物去除與控制的處理方法[22]。1998年，El-Nezami等[23]篩選出的乳酸菌菌株LBGG和LC-705在24 h內能結合培養基中80%的黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）（初始質量濃度為5 μg/mL）；2001年Haskard等[24]研究發現，失活鼠李糖乳桿菌和乳酸菌能夠通過細胞表面結合降低AFB1。此后，使用乳酸菌去除真菌毒素成為了研究的熱點[25-27]。2011年，Yue Tianli等[28]研究發現失活的蘋果酒釀酒酵母能夠成功地降低蘋果汁中展青霉素的含量，最大吸附量可以達到70.28%；同時，有研究表明失活的乳酸菌能夠去除蘋果汁中的展青霉素，并且蘋果汁的基本理化指標不變[29]。因此，本實驗以失活的乳酸菌作為生物吸附劑去除橙汁中鏈格孢霉毒素TeA，通過對去除工藝條件的優化，尋找最佳的吸附條件，為柑橘汁中鏈格孢霉毒素TeA的有效控制提供新的思路和方法，為柑橘產業的健康發展提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

短乳桿菌（Lactobcillus brevis）CICC 20023 中國工業微生物菌株保藏管理中心。

新鮮橙子購于華中農業大學農貿市場，去皮榨汁后過濾備用；橙子品種為倫晚，采收時間為2016年3月，單果質量平均約為120～150 g，無病蟲害。

1.1.2 試劑

細交鏈孢菌酮酸銅鹽（(TeA)2Cu）標準品 加拿大多倫多研究化學品公司；乙腈（色譜純） 美國Fisher公司；酵母提取物 英國Oxoid公司；蛋白胨 北京雙旋微生物培養基制品廠；甲酸（分析純）、葡萄糖、磷酸氫二鉀 國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 培養基

液體培養基：酵母膏7.5 g，葡萄糖10.0 g，蛋白胨7.5 g，磷酸氫二鉀2.0 g，吐溫80 0.5 mL，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0；121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min后備用。

1.2 儀器與設備

2998高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國Waters公司；HU660WN-M榨汁機 韓國惠人集團；LX-C35L（數顯）型高壓蒸汽滅菌鍋 合肥華泰醫療設備有限公司；IS-RSVI恒溫振蕩培養箱 廣州市鵬鑫科學儀器有限公司；Centrifuge5804R超速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；Alphal-4真空冷凍干燥儀 德國M. Christ公司；UltraScan XE型色度測定儀 美國HunterLab公司。

1.3 方法

1.3.1 橙汁理化指標的測定

pH值：采用標準矯正pH計測定；色度：利用色度測定儀測定；可溶性固形物含量：采用GB 12143—2008《飲料通用分析方法》[30]中折光計法測定；總酸和總糖含量：采用SB/T 10203—1994《果汁通用試驗方法》[31]中的直接滴定法測定。

1.3.2 滅活菌粉吸附劑的制備

將-80 ℃保存的菌種接種到乳酸菌液體培養基中，在30 ℃、120 r/min振蕩活化24 h。按10%菌液接種量將活化后的菌液（菌液濃度為108CFU/mL）接種于液體培養基中，同樣條件下擴大培養24 h后在6 000×g、4 ℃離心10 min，用蒸餾水洗滌菌泥3 次；將洗的凈菌泥置于高壓滅菌鍋內121 ℃滅活20 min，冷卻后再將預冷后的菌泥進行真空冷凍干燥。冷凍干燥后，研磨過100 目篩制得失活乳酸菌菌粉吸附劑。

1.3.3 鏈格孢霉毒素TeA貯備液的制備

準確稱取1.0 mg細交鏈孢菌酮酸（銅鹽）標準品，用乙腈充分溶解，定容至10 mL，得到質量濃度為100 μg/mL的標準品貯備液，冷藏備用。

1.3.4 樣品中鏈格孢霉毒素TeA含量的HPLC檢測

參照Schwarz等[32]的方法，并根據實際情況有所調整。HPLC檢測條件：色譜柱C18反相柱ODS-2（250 mm×4.60 mm，5 μm）；流動相：A為超純水，B為90%乙腈（乙腈-水），均用0.1%的甲酸酸化處理并用0.45 μm濾膜抽濾后超聲波脫氣20 min；流速：1.0 mL/min；梯度洗脫條件：0～7 min為20%～100% B，7～10 min為100%～50% B，10～15 min為50%B，15～16 min為50%～20% B，16～20 min為20% B；進樣量：20 μL；樣品在檢測前過0.22 μm微孔濾膜，紫外檢測波長：277 nm；柱溫：40 ℃。

1.3.5 單因素試驗設計

1.3.5.1 滅活菌粉添加量對TeA去除率的影響

準確稱0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20 g滅活菌粉，用20 mL蒸餾水清洗后使用高速冷凍離心機（10 000×g，10 min，4 ℃）離心后去掉水，重復1 次，清洗后分別加入20 mL加標橙汁樣品中，隨后將其置于30 ℃恒溫搖床中振蕩吸附24 h，轉速為120 r/min，評價滅活菌粉添加量對TeA去除率的影響。

1.3.5.2 吸附時間對TeA去除率的影響

分別將1.0 g水洗后的滅活菌粉加入到20 mL加標橙汁溶液中，隨后將其置于30 ℃恒溫搖床中振蕩（120 r/min）吸附，分別于0、6、12、18、24、30、36 h取樣，評價吸附時間對TeA去除率的影響。

1.3.5.3 TeA初始質量濃度對TeA去除率的影響

分別在20 mL含有500、750、1 000、1 500、 2 000 μg/L TeA的加標橙汁中加入1.0 g水洗后的滅活菌粉，隨后將其置于30 ℃恒溫搖床中振蕩吸附12 h，搖床轉速120 r/min，吸附結束后繪制去除率與TeA初始質量濃度的關系曲線。

1.3.5.4 橙汁pH值對TeA去除率的影響

以緩沖液調節橙汁pH值分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，加入1.0 g水洗后的滅活菌粉于20 mL不同pH值的加標橙汁中，隨后將其置于30 ℃恒溫搖床中振蕩吸附處理12 h，搖床轉速120 r/min。吸附結束后繪制去除率與pH值的關系曲線。

單因素試驗均以沒有添加滅活乳酸菌菌粉吸附劑的加標橙汁為空白對照，每個處理設置3 個重復。所有樣品吸附完成后使用高速冷凍離心機（10 000×g，10 min， 4 ℃）對橙汁溶液進行離心，棄去沉淀，上清液用HPLC檢測TeA含量。

1.3.6 Box-Behnken試驗設計

在單因素試驗基礎上，選取滅活菌粉添加量、吸附時間、TeA初始質量濃度、橙汁pH值4 個影響因素，根據響應面法中的Box-Behnken試驗設計原理，利用Design-Expert 8.0.5b設計四因素三水平試驗，見表1。

表1 Box-Behnken試驗因素及水平Table 1 Factors and levels used in Box-Behnken design

2 結果與分析

2.1 橙汁理化指標分析

鮮榨橙汁以及不同劑量的滅活菌粉對含有500 μg/L的 20 mL橙汁在30 ℃恒溫搖床中振蕩（120 r/min）吸附12 h后的各理化指標如表2所示。與鮮榨橙汁相比，滅活乳酸菌菌粉吸附后橙汁pH值、色度和可溶性固形物含量基本保持不變，對總糖及總酸含量的影響也很微弱。說明使用滅活菌粉吸附對橙汁的品質影響不大。

表2 橙汁的理化指標測定值Table 2 Physical and chemical properties of citrus juice

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 滅活菌粉添加量對TeA去除率的影響

圖1 滅活菌粉添加量對橙汁中TeA去除率的影響Fig. 1 Effects of adsorbent dose on removal of TeA from citrus juice

由圖1可知，向20 mL橙汁中分別加入0.20～1.20 g滅活菌粉時，橙汁中TeA去除率明顯增大。由此可知，隨著滅活菌粉劑量的增加，TeA去除率增大；當滅活乳酸菌菌粉添加量為1.0 g/20 mL時，橙汁中TeA的去除率達到最高，為71.26%，原因可能是由于菌體細胞數的增多，細胞壁上相應的結合位點增多[33]。繼續加大菌粉使用量時去除率有所降低，可能是由于菌體數增多，導致菌粉之間因靜電作用而產生聚合，進而減少結合位點。據研究發現，更多吸附劑可能在細胞壁上產生篩選效應，并不是所有的結合位點都有真菌毒素附著[34]，從而導致TeA去除率降低。因此確定1.0 g/20 mL為滅活菌粉的最佳吸附劑量。

2.2.2 吸附時間對TeA去除率的影響

由圖2可知，隨著吸附時間的延長，去除率先快速增加，12 h后逐漸達到平衡。用1.0 g滅活菌粉吸附0 h時，去除率為18.26%，該結果表明滅活乳酸菌去除TeA的作用機制可能是TeA被快速吸附到菌體表面的過程[35]；吸附6 h后，去除率為25.39%；吸附12 h后，去除率達到最高，為53.15%；當吸附時間延長至18 h時，去除率為49.82%，此時TeA去除率基本達到平衡；繼續延長吸附時間對鏈格孢霉素TeA的去除率影響不大。因此確定滅活菌粉的最佳吸附時間為12 h。

圖2 吸附時間對橙汁中TeA去除率的影響Fig. 2 Effects of adsorption time on removal of TeA from citrus juice

2.2.3 TeA初始質量濃度對TeA去除率的影響

圖3 橙汁中TeA初始質量濃度對TeA去除率的影響Fig. 3 Effects of initial TeA concentration on removal of TeA from citrus juice

如圖3所示，向20 mL橙汁中加入1.0 g滅活菌粉，對TeA初始質量濃度為500 μg/L的橙汁吸附處理12 h，TeA去除率為70.75%；隨著橙汁TeA初始質量濃度的增大，滅活菌粉對TeA的去除率呈下降趨勢，并最終達到吸附平衡。當TeA初始質量濃度為2 000 μg/L時，其去除率為47.82%。在較低質量濃度條件下，TeA能與菌體細胞表面的結合位點充分結合，從而去除率較高；在較高質量濃度條件下，TeA競爭有限的結合位點，TeA多于結合位點，導致去除率降低。因此，確定TeA最佳初始質量濃度為500 μg/L。

2.2.4 橙汁pH值對TeA去除率的影響

由圖4可知，在TeA初始質量濃度為500 μg/L的橙汁中，隨著橙汁pH值的升高，TeA去除率先增加后降低。在橙汁pH 4.0時具有最大去除率，為64.81%。據文獻報道，pH值在真菌毒素的去除方面有顯著的影響[36]。菌體表面各種活性官能團（如羧基、氨基和磷酸基等）受溶液pH值的影響較大。在pH值較低時，菌體表面帶有較多的正電荷，抑制帶正電荷的TeA在菌體上的吸附；隨著pH值的升高，菌體表面的負電荷逐漸增多，有利于對TeA的靜電吸附，因此將最佳吸附pH值定在4.0左右。

圖4 橙汁pH值對橙汁中TeA去除率的影響Fig. 4 Effects of pH on removal of TeA from citrus juice

2.3 響應面試驗結果

2.3.1 Box-Behnken試驗設計與結果

表3 響應面Box-Behnken試驗設計及結果Table 3 Response surface Box-Behnken design with experimental values of TeA removal

利用Design-Expert 8.0.5b軟件對表3試驗數據進行多元回歸擬合，得到TeA去除率（Y）對滅活菌粉添加量（A）、吸附時間（B）、TeA初始質量濃度（C）和橙汁pH值（D）的二次多項回歸模型方程為：Y=75.99+2.94A+ 5.85B-11.49C-5.65D+4.05AB-8.70AC-1.81AD+18.23BC-5.72BD+8.95CD-6.06A2-18.53B2-12.53C2-9.36D2。由表4可以看出，回歸模型的P值小于0.000 1且模型預測值與試驗值之間有較好的相關性（R2=0.949 1），說明采用響應面法進行滅活乳酸菌去除橙汁中TeA的試驗所得回歸模型是有效的。由表4可知，一次項B、C、D，二次項A2、B2、C2、D2和交互項AC、BC、CD對TeA去除率有顯著或極顯著的影響。各因素對TeA去除率影響由大到小順序為：TeA初始質量濃度＞吸附時間＞橙汁pH值＞滅活菌粉添加量。

表4 回歸方程系數及方差分析Table 4 Analysis of variance of regression model and significant test

2.3.2 各因素交互作用對TeA去除率的影響

圖5 各因素交互作用對TeA去除率影響的響應面和等高線圖Fig. 5 Response surface and contour plots showing the effects of variables on removal of TeA from citrus juice

從圖5可以看出，滅活菌粉添加量和TeA初始質量濃度、TeA初始質量濃度和吸附時間、TeA初始質量濃度和橙汁pH值的交互作用都比較明顯。從圖5b可知，當橙汁pH 4、吸附時間12 h時，等高線沿TeA初始質量濃度方向變化較快，而沿菌粉添加量方向變化較慢，表明TeA初始質量濃度對TeA去除率的影響高于菌粉添加量。從圖5d可知，當滅活菌粉添加量1.0 g/20 mL、橙汁pH 4時，TeA初始質量濃度變化明顯快于吸附時間，在TeA較低初始質量濃度時，去除率較高。從圖5f可知，在吸附時間12 h、滅活菌粉添加量1.0 g/20 mL時，TeA初始質量濃度與橙汁pH值的交互作用顯著。

2.3.3 橙汁中TeA吸附預測模型的驗證

為了進一步驗證橙汁中TeA吸附預測模型的準確性，在滅活乳酸菌去除橙汁中鏈格孢霉毒素TeA的最佳工藝條件下，即：滅活乳酸菌菌粉添加量1.20 g/20 mL、吸附時間11.43 h、TeA初始質量濃度250 μg/L、橙汁pH 3.15。理論最大去除率為87.87%，實際測得TeA去除率為86.98%，兩者基本一致，沒有顯著性差異（P＞0.05），結果表明二次多項式模型擬合程度高，預測效果好。

3 結 論

以滅活乳酸菌菌粉作為吸附劑，優化其去除橙汁中鏈格孢霉毒素TeA的工藝參數，在單因素試驗基礎之上，利用響應面法對影響去除率的因素及其交互作用進行分析，結果表明：各因素對TeA去除率的影響由大到小順序為：TeA初始質量濃度＞吸附時間＞橙汁pH值＞滅活菌粉添加量。最優工藝參數為：滅活菌粉添加量1.20 g/20 mL、吸附時間11.43 h、TeA初始質量濃度250 μg/L、橙汁pH 3.15。在此條件下，TeA去除率為86.98%；同時建立了TeA去除率與各影響因素間的二次多項回歸模型，該模型的驗證結果表明模型擬合程度高，預測效果好。

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Optimization of Adsorption Removal of Alternaria Mycotoxin TeA from Citrus Juice by Inactive Lactic Acid Bacteria

GE Na, PENG Bangzhu*, XU Xiaoyun, PAN Siyi
(College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

Citrus fruit is susceptible to pollution by Alternaria during growth and post-harvest storage. Tenuazonic acid (TeA) is considered to be one of the most toxic mycotoxins produced by Alternaria, and constitutes a serious threat to consumers’health and safety. Therefore, this study aimed to obtain the optimal conditions for adsorption removal of TeA from citrus juice using inactive lactic acid bacteria (LAB) as adsorbent. The optimization was implemented using a combination of one-factor-at-a-time method and response surface methodology with Box-Behnken design. The independent variables were adsorbent dosage, adsorption time, initial concentration of TeA and pH of citrus juice. The response variable was the percentage removal of TeA. An adsorption time of 11.43 h, 1.20 g/20 mL of inactive LAB, an initial TeA concentration of 250 μg/L and pH of 3.15 were determined as to be optimal. Under these optimal conditions, the percentage adsorption of TeA from citrus juice was 86.98%. A quadratic polynomial regression model was established and validated between the independent variables and the response. It turned out that the model had a high goodness of fit and good prediction performance.

inactive lactic acid bacteria; Alternaria mycotoxin TeA; adsorption removal; citrus juice

10.7506/spkx1002-6630-201714040

TS275.5

A

1002-6630（2017）14-0256-07

葛娜, 彭幫柱, 徐曉云, 等. 失活乳酸菌去除柑橘汁中鏈格孢霉毒素TeA工藝優化[J]. 食品科學, 2017, 38(14): 256-262.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714040. http://www.spkx.net.cn

GE Na, PENG Bangzhu, XU Xiaoyun, et al. Optimization of asorption removal of Alternaria mycotoxin TeA from citrus juice by inactive lactic acid bacteria[J]. Food Science, 2017, 38(14): 256-262. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714040. http://www.spkx.net.cn

2016-08-24

湖北省重大科技創新項目（2015ABA035）

葛娜（1987—），女，碩士研究生，研究方向為食品安全。E-mail：gena2007@163.com

*通信作者：彭幫柱（1978—），男，副教授，博士，研究方向為食品發酵工程。E-mail：pengbangzhu@163.com