CRISPR/Cas9系統：基因組定點編輯技術及其在植物基因功能研究中的應用

包愛科，白天惠，趙天璇，蘇家豪

(草地農業生態系統國家重點實驗室, 蘭州大學草地農業科技學院, 甘肅 蘭州730020)

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CRISPR/Cas9系統：基因組定點編輯技術及其在植物基因功能研究中的應用

包愛科*，白天惠，趙天璇，蘇家豪

(草地農業生態系統國家重點實驗室, 蘭州大學草地農業科技學院, 甘肅 蘭州730020)

CRISPR/Cas系統是細菌和古細菌在長期演化過程中形成的一種適應性免疫防御系統，可用來對抗入侵的病毒及外源DNA。相比鋅指核酸酶(ZFNs)和TALE核酸酶(TALENs)，基于RNA指導的Ⅱ型CRISPR/Cas9系統為基因組定點編輯開辟了一條新的道路，在基因功能研究中具有效率高、成本低、易于操作等顯著優點。本文從CRISPR/Cas9系統的基本結構、作用機制及其在植物基因功能研究和作物遺傳育種中的應用等方面進行了簡述，最后對該系統的發展前景進行了展望。

基因編輯；CRISPR/Cas9系統；基因功能；分子育種

隨著越來越多物種全基因組測序的完成，進一步研究基因的功能及其應用是當前面臨的一個新的挑戰。20世紀80年代發展起來的基因編輯技術可以對基因組完成精確修飾，通過在基因組水平上進行基因的定點突變、插入、多位點突變及小片段的刪失等手段，進行基因功能的研究。真核生物基因組包含成千上萬的DNA堿基，直接對其進行遺傳操作難度很大。同源重組(homologous recombination，HR)介導的打靶技術在基因編輯技術方面是一個很大的突破，大大推進了生命科學領域的諸多研究進程[1-2]。然而，盡管HR介導的基因打靶產生了許多精確的突變，但是其發生頻率很低，因此大規模應用面臨巨大挑戰[3]。近年來出現的人工核酸酶技術很好地克服了這一缺點。人工核酸酶可以在基因組特定位點產生DNA雙鏈斷裂(double strand broken，DSB)，隨后啟動細胞內的自我修復機制，通過非同源末端連接(non-homologous end joining，NHEJ)或同源重組(homologous recombination，HR)實現修復[4-5]。目前，人工核酸酶主要包括4類：大范圍核酸酶(meganuclease，MGN)、鋅指核酸酶(zinc-finger nuclease，ZFNs)、TALE核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALENs)以及CRISPR/Cas系統。

MGN核酸酶是在酵母中發現，能夠識別14～40堿基長度的核酸序列的歸巢核酸內切酶，可構建雙鏈斷裂，通過激活同源重組進行修復[6]。歸巢核酸內切酶識別并切割不含內含子的同源等位基因，啟動歸巢作用，插入序列就轉移到缺少該序列的同源等位基因上了。當一個DNA序列被歸巢核酸內切酶切割后，可以通過同源重組對其進行修復，從而實現歸巢核酸內切酶的轉移，以及內含子和歸巢位點序列的阻斷[7]。但是，目前已知的大范圍核酸酶較少，不能覆蓋所有的靶位點，所以其應用受到很大限制[8]。

ZFNs核酸酶包括DNA結合結構域鋅指蛋白和切割結構域ForkⅠ兩部分，每個鋅指蛋白能夠特異性識別3個堿基，而鋅指核酸酶是多個鋅指蛋白模塊的串聯，可以識別更多的核苷酸序列[9]。ForkⅠ通過二聚化才能產生核酸內切酶活性。因此，需要兩個ZFN分別識別靶位點的上下游，當兩個ZFN同各自的識別位點特異性結合并且中間間隔精確時，ForkⅠ將會行使切割功能，從而使DNA雙鏈斷裂(DSB)[9-10]。可見，ZFNs的出現給基因編輯開辟了一條新的道路，它有明顯的技術優勢。然而，ZFNs依然存在著諸多如不能靶向所有的序列、使用前需要大量的篩選和鑒定、脫靶切割率較高等問題[11-12]。

TALE核酸酶和ZFNs結構類似，也由DNA結合結構域TALE蛋白和切割結構域ForkⅠ兩部分組成。在TALE蛋白的N-端是typeⅢ傳送系統的信號位點(translocation)，而其C-端則有核定位信號位點(nuclear locatization，NLS)和轉錄激活信號位點(transcriptional activation，AD)，中游是DNA特異結合域(DNA-binding domain)[13]。DNA特異結合域由33～35個氨基酸組成的重復片段串聯而成，每個片段靶向一個DNA堿基，串聯的重復片段可靶向識別多個堿基。TALE的C-端與ForkⅠ融合后形成TALEN單體，當兩個TALEN單體分別特異性識別各自的位點后，兩個ForkⅠ的切割結構域即可形成二聚體，從而切割DNA產生DSB[14]。與ZFNs相比，TALENs在設計和構建上更為簡便，但由于TALENs的重復片段很多，增大了與靶基因結合的難度，限制了其廣泛應用[11]。

近年來，一項新的基因編輯技術——CRISPR/Cas技術被越來越多的實驗室廣泛接受，該項技術不僅克服了前述3種基因編輯技術中出現的大多數問題，且具有便于操作、成本低等優點[15]，在動植物基因功能鑒定、分子設計育種等研究領域具有巨大的應用潛力。因此，本文著重從CRISPR/Cas的基因座結構、作用機制以及在植物基因功能研究中的應用進行詳細的介紹，以期為相關的研究提供參考。

1 CRISPR/Cas系統概述

1.1 CRISPR/Cas系統

早在1987年，Ishino等[16]在研究iap酶在大腸桿菌中參與堿性磷酸酶同工酶轉化時發現，iap基因的下游存在一種成簇的規律間隔的短回文重復序列，和大多數重復序列不同的是，這些重復序列被5個非重復序列間隔開。但這一發現在當時并沒有引起足夠的注意。在接下來的10年中，隨著更多的微生物基因組被測序，人們發現在40%的細菌和90%的古細菌中都存在這種成簇的重復序列[17]。直到2002年，這類重復序列才被正式命名為Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)[18]。同時，在CRISPR位點的附近發現存在一組保守的與CRISPR相關的蛋白編碼基因，被命名為Cas基因。根據不同的Cas基因，可以將CRISPR系統分為3種類型：TypeⅠ、TypeⅡ以及TypeⅢ[19-20]。Ⅰ型和Ⅲ型的CRISPR位點包含多個Cas蛋白，而Ⅱ型CRISPR位點只包含Cas9一種蛋白，便于構建載體，因此，在目前的研究中，Ⅱ型的CRISPR/Cas9系統的使用比較廣泛。

2005年，多個研究小組均發現從CRISPR重復序列中分離出來的間隔序列與宿主菌染色體外的遺傳物質有很高的同源性[21-23]。這被認為是CRISPR系統研究的一個關鍵轉折點。很快， Barrangou等[24]首次為Ⅱ型CRISPR系統作為適應性免疫系統提供了實驗依據，證明了在基于核酸的免疫系統中，CRISPR的間隔區負責指導外源DNA的識別，而Cas酶則主要控制間隔區的采集和噬菌體的防御。在此之后，CRISPR/Cas系統的研究步伐明顯加快。2012年，Jinek等[25]通過對Ⅱ型CRISPR系統的改造和優化，將CRISPR RNA(crRNA)和trans-activing crRNA(tracrRNA)構建成一條單鏈引導RNA (single-guide RNA，sgRNA)，同樣可以與Cas9共同作用特異性切割目的基因。這為后來CRISPR/Cas系統在基因功能研究中的成功應用打開了一扇大門，如Mandal等[26]采用CRISPR/Cas系統在人類的造血干細胞和效應細胞中實現了有效的基因剔除；Chen等[27]通過該系統實現了對秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)的雙重sgRNA定向基因敲除；Auer等[28]在斑馬魚中介導eGFP向Gal4轉基因株系的轉化；最近，Zhu等[29]也利用該系統在猴子胚胎干細胞中通過同源重組成功實現了基因的打靶。此外，CRISPR/Cas系統還為某些疾病的治療提供了新的手段，目前已成功利用CRISPR/Cas9系統對乙肝病毒[30]、EB病毒[31]以及范可尼貧血[32]等的基因編輯。因此，CRISPR/Cas系統已經得到全世界從事生物學研究科學家的高度重視。

1.2 CRISPR/Cas9系統的結構及作用原理

Ⅱ型CRISPR/Cas系統的基因結構簡單穩定，由眾多短的高度保守的重復序列和長度相似的間隔序列(spacers)間隔排列組成[33-37]，從5′端到3′端依次為tracrRNA、Cas9基因、前導序列(leader sequence)和CRISPR序列。前導序列可作為啟動子，啟動CRISPR序列的轉錄，產生crRNA前體(pre-crRNA)[38-39]。tracrRNA可與Cas9蛋白一起參與RNA酶Ⅲ對CRISPR轉錄產物的選擇性酶切，從而產生成熟的crRNA；隨后，由Cas9蛋白、tracrRNA和crRNA形成的復合體可對crRNA配對的外源DNA實施剪切[40]。值得注意的是，Cas9蛋白有兩個標志性的核酸酶區域，RuvC和HNH，RuvC位于Cas9的氨基端，HNH是一個單一的核酸酶結構域，位于蛋白的中間位置[41]。在Cas9蛋白行使剪切功能時，HNH核酸酶結構域剪切與crRNA互補的序列，而RuvC結構域則負責剪切非互補的序列[24]。CRISPR/Cas9系統的另一個重要特征就是原型間隔序列毗鄰基序(protospacer adjacent motif, PAM)。DNA靶位點上與間隔序列對應的序列被稱為原間隔序列(protospacer)，PAM通常位于protospacer的3′端，其序列很保守，長度一般為2～5個堿基，與protospacer距離1～4個堿基[42]。當外源核酸入侵時，宿主掃描到入侵核酸DNA序列中的多個PAM結構，將PAM的5′端的序列定義為protospacer，從而獲得新的間隔區[42]。另外，由于CRISPR本身的重復序列中不存在PAM位點，因此，PAM的存在也是CRISPR系統區分自身DNA和外源DNA，從而避免發生自身免疫的原因之一[43]。釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes) Cas9的生物化學和結構特征表明，PAM的識別可以啟動Cas9靶向結合和切割之間的構造轉換[43-45]。

目前已發現CRISPR/Cas系統的防御過程可分為3個階段：第一階段，CRISPR間隔區的獲得，包括識別和CRISPR位點上相鄰兩個重復序列間間隔區序列的整合。來自噬菌體或質粒的雙鏈DNA的一小段特殊區域(即原型間隔序列)被整合到宿主細胞DNA的CRISPR前導序列末端，因此，spacer的位置代表了外源遺傳物質入侵的時間順序[46]。在此過程中，Cas1和Cas2蛋白參與了新間隔序列的獲得[24,47]。第二階段，CRISPR基因座的表達。CRISPR基因座首先在RNA聚合酶的作用下被轉錄成前體CRISPR RNA (pre-CRISPR RNA)，然后被Cas蛋白或核酸內切酶剪切成包含單個間隔區和部分重復區的更小的crRNA[48]。第三階段，CRISPR/Cas系統的干擾或免疫。該階段是CRISPR/Cas免疫反應最關鍵的一步，crRNAs與Cas蛋白復合體共同作用，識別外來DNA上的靶序列并進行堿基配對，形成的核糖核蛋白復合物在外源DNA的原型間隔序列處進行切割[49-50]。已有研究發現，crRNA的間隔序列(spacer)與外源DNA的靶位點完全或部分互補都可以實現對特定位點的切割[49]。

2 CRISPR/Cas9系統在植物基因功能研究中的應用

CRISPR/Cas9系統作為一種全新的基因編輯技術，除了在動物育種和疾病治療中發揮其優勢外，在植物基因功能的研究中也體現出其簡便、高效的特點。

2.1 CRISPR/Cas9系統的構建

CRISPR/Cas9系統對基因組進行定點修飾時，只需要表達Cas9蛋白、crRNA和tracrRNA三個組分[51]。目前已對天然CRISPR/Cas9系統進行了成功改造，將crRNA和tracrRNA雙組分利用基因工程整合成一條雙鏈RNA分子，成為sgRNA，從而將CRISPR/Cas9系統簡化成了sgRNA和Cas9蛋白兩部分[25,52]。

Cas9核酸酶是CRISPR/Cas9系統中的核心部分。遺傳密碼有64種，但通常情況下，不同的物種在長期的進化過程中，絕大多數生物傾向于利用其中的一部分密碼子，即對于編碼同一種氨基酸的同義密碼子的使用具有很大的偏好性。而這種密碼子的偏好性阻礙了細菌基因在植物細胞中的表達，因此，在轉入植物之前需要根據宿主植物基因對來源于細菌的基因進行改造和密碼子優化。有研究表明，在植物中對Cas9基因的密碼子進行優化可以顯著提高基因組的編輯效率[53]。另外，Cas9蛋白只有被轉運到細胞核中才能發揮作用，因此，需要在Cas9蛋白引入1個或2個入核的信號肽或標簽蛋白[51]。sgRNA引導Cas9蛋白在靶位點進行切割，是CRISPR/Cas9系統中另一個重要的組成部分。研究表明，選擇不同的啟動子驅動sgRNA表達的效率不同。在雙子葉植物中，植物內源的Ⅲ型啟動子U6或組成型啟動子CaMV35S均可高效地驅動sgRNA的表達，而在單子葉植物中，除了這兩種啟動子外，Ⅲ型啟動子U3也可以高效的啟動其表達[54-59]。另外，利用CRISPR/Cas9系統在植物中進行基因組編輯時，sgRNA中與PAM相距12～13個堿基的序列主要決定CRISPR/Cas9系統的特異性，前導序列中GC含量較高以及將sgRNA和Cas9核酸酶構建在同一載體中可在一定程度上增加CRISPR/Cas9系統的靶向效率[58-59]。

綜合目前已有的報道，在體外構建植物sgRNA-Cas9系統的流程大致可總結為以下幾個步驟：(1) 合成sgRNA。首先在已知序列中找到PAM位點，然后通過PAM定位尋找合適的靶位點，設計的靶位點最好在目標基因序列的第一外顯子附近，這樣可以獲得較高活性的sgRNA(圖1A)。(2) sgRNA-Cas9重組質粒的構建。將合成的sgRNA和經過密碼子優化的Cas9序列構建重組質粒。該過程可以構建一個載體將sgRNA和Cas9同時載入，也可以分別構建載體，構建載體時需要攜帶報告基因或抗性基因(圖1B)。(3) sgRNA-Cas9重組質粒載體活性檢測。Kabin等[60]在水稻(Oryzasativa)中將密碼子優化過的Cas9和sgRNA克隆到水稻瞬時表達載體中，以水稻35s:GFP的表達作為質粒轉化效率的參考來檢測重組質粒載體的活性。如果沒有活性或活性較低，需要重新設計合成sgRNA。(4) 遺傳轉化。采用農桿菌侵染或者基因槍法將構建好的工程載體導入目標植物，進行基因組定點修飾。(5) 檢測定點修飾結果。一般會采用RE-PCR分析法、PCR+TA克隆測序法、基于可以識別錯配雙鏈的錯配內切酶檢測法(Surveyor 法)和T7E1核酸內切酶法以及結合二代測序(next generation sequencing，NGS)的高通量檢測法檢測定點修飾的結果[61]。

圖1 植物中使用CRISPR/Cas9系統進行RNA指導的基因編輯原理圖Fig.1 Schematic description of RNA-guided genome editing in plants using the CRISPR/Cas9 system (A) sgRNA通過PAM定位尋找合適的靶位點，介導Cas9對靶序列進行特異性切割。(B) sgRNA-Cas9重組質粒的構建示意圖。PolⅢ啟動子和終止子控制sgRNA的轉錄；MCS為多克隆位點；PolⅡ啟動子和終止子控制Cas9核酸酶的表達；NLS為核定位信號；Ampr代表抗性基因。(A) sgRNA find the right target site through the PAM and mediate the specific cleavage by Cas9. (B) Diagram of vectors for transient expression. A DNA-dependent RNA polymerase Ⅲ (Pol Ⅲ) promoter and terminator are used to control the transcription of engineered sgRNA. MCS represents the multiple cloning sites. Plant DNA-dependent RNA polymerase Ⅱ (Pol Ⅱ) promoter and terminator are used to control the expression of a chimeric Cas9 nuclease. NLS is a nuclear localization signal and Ampr represents a resistance gene.

2.2 CRISPR/Cas9系統在植物基因功能研究中的應用

CRISPR/Cas系統發現以后，很快就被應用到了高等植物基因功能研究中。目前，CRISPR/Cas9系統已經成功介導了擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻、小麥(Triticumaestivum)、煙草(Nicotianatabacum)、番茄(Lycopersiconesculintum)、大豆(Glycinemax)、甜橙(Citrussinensis)、毛白楊(Populustomentosa)以及豆科牧草蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)等基因組中單個位點甚至多個位點的修飾(表1)。Xu等[53]在水稻中通過農桿菌介導的CRISPR/Cas9系統對水稻BEL基因實現了基因的靶向編輯。他們發現，轉化方法是影響CRISPR/Cas9系統在植物中作用效率的重要因素，總體上使用基因槍會得到更高的轉化效率，且可以導致多個插入，從而有助于提高sgRNA和Cas9蛋白的表達水平。然而，農桿菌介導的轉化通常能夠得到高效的單位點插入，因此，農桿菌介導的sgRNA-Cas9系統靶向的基因組更容易確定。不過最近Yin等[62]發現雙生病毒DNA復制可以提高基因打靶頻率。煙草花葉病毒是一種在細胞質中復制的RNA病毒，可以將gRNAs傳遞到轉基因的Cas9表達煙草中，以實現系統的基因組編輯，甚至可以在兩個后代植株中被檢測到。而目前在植物中，基于DNA病毒的基因組編輯傳遞系統還未被發現。除此之外，其他學者也在雙子葉植物如擬南芥、煙草，以及單子葉植物高粱(Sorghumvulgare)中成功地表達了CRISPR/Cas9系統[63]。目前，CRISPR/Cas9系統不僅能夠在草本植物中進行精確的基因編輯，同時也在木本植物中實現了基因組的編輯和靶位點的突變。Jia等[64]在木本植物甜橙中通過農桿菌向甜橙中導入Cas9以及合成的sgRNA靶向CsPDS基因，成功使目標位點CsPDS基因發生了突變。Fan等[65]在木本植物毛白楊中設計了4個引導RNA(gRNA)靶定毛白楊八氫番茄紅素脫氫酶基因8 (PtoPDS)的不同基因組位點。在農桿菌介導的轉化之后，他們在轉基因楊樹中觀察到了明顯的白化表型。通過分析RNA引導的基因組編輯事件，59個PCR克隆中有30個是純合子突變體，有2個是雜合子突變體，這些目標位點的突變效率估計是51.7%。這就表明，利用Cas9/sgRNA系統，也可以在木本植物中精確地編輯基因組序列，并有效地建立基因敲除突變體。

為了進一步研究CRISPR/Cas9系統在植物基因功能研究中的穩定性，Zhang等[59]通過2個水稻亞種(粳稻日本晴和秈稻Kasalath)測試CRISPR/Cas9系統誘導11個靶基因產生突變的效率、特點、遺傳性及特異性等。通過檢測T0代轉基因植株，發現CRISPR/Cas9系統在所有11個靶基因位點都誘導產生了突變，突變效率高達66.7%，且超過一半(6/11)的靶基因位點在T0代獲得純合突變體；同時，CRISPR/Cas9誘導產生的基因突變通過經典的孟德爾定律遺傳到下一代，通過全基因組重測序并檢測與靶序列高度同源的序列，他們僅在只有一個堿基不同的潛在脫靶位點檢測到突變，這表明CRISPR/Cas9系統在水稻中有很高的特異性。該項研究為CRISPR/Cas9系統在水稻中的穩定應用及進一步應用該技術提高水稻的產量、抗性及品質等提供了理論基礎。

最近幾年，許多研究者還對CRISPR/Cas9系統進行了升級改造，如：Lozano-Juste等[67]發現Cas9蛋白的D10A突變體CasNickase可切割DNA單鏈，其在成對的gRNAs輔助下可以實現DNA雙鏈斷裂，從而在保證原有系統靶向率的基礎上，顯著降低了脫靶率。此外，Qi等[68]發現，當缺失核酸內切酶的Cas9與sgRNA共表達時，會產生一種新的DNA識別復合體，能特異性地干擾轉錄的延伸、RNA聚合酶的結合或轉錄因子結合，被稱為CRISPR干擾(CRISPRi)系統。這一系統能有效抑制大腸桿菌中靶向基因的表達，并且不會出現脫靶效應。而且利用CRISPRi還可以同時抑制多個靶基因。另外，不同于原有的基因敲除技術，CRISPRi技術的效應是可逆的。因此，CRISPRi的序列特殊靶向平臺在大范圍的宿主細胞中作為一種綜合調控基因表達的方法有很好的應用前景。

隨著CRISPR/Cas9系統在基因組編輯技術上的開發和完善，該系統正在被逐步應用到對植物病毒基因組進行高效靶向修飾的研究中。目前已有研究證明CRISPR/Cas9系統對植物DNA病毒存在抑制作用[69]。Ji等[70]通過在擬南芥和煙草中表達Cas9/sgRNA，驗證了其對甜菜曲頂病毒(單鏈DNA病毒)的抑制作用，并發現在sgRNA的引導下，Cas9能夠引起植物病毒多個關鍵功能區(如IR區)核苷酸序列的刪減或突變，而這種作用對菜豆黃矮病毒(單鏈DNA病毒)同樣有效[71]，體現了該系統對植物DNA病毒的作用能力具有普遍適用性。

雖然近幾年來CRISPR/Cas9系統作為一種精確改寫基因組的便捷工具受到了很多學者的青睞(表1)，但是， 對于難以轉化的植物而言， 有效利用CRISPR/Cas9技術進行基因組編輯時存在著巨大挑戰。 最近，Zhang等[72]報道了一種無轉基因的CRISPR/Cas9基因組編輯方法，在小麥愈傷組織細胞中瞬時表達CRISPR/Cas9的DNA或RNA，再用這些細胞再生出整個植株。結果顯示，以瞬時表達為基礎的基因組編輯系統高度有效，能夠產生無轉基因的、純合的小麥突變體。隨后，他們將該方法用于六倍體面包小麥和四倍體硬粒小麥中，產生的突變體沒有檢出任何轉基因成分。研究指出，這種方法可以應用到其他植物中去，加快植物基因組工程研究的速度。

3 CRISPR/Cas9技術的發展前景

CRISPR/Cas9技術作為一種新興的基因編輯技術，與前期的鋅指核酸酶(ZFNs)和TALE核酸酶(TALENs)系統相比，有以下優點：(1) 只要靶序列上含有NGG(PAM)，就可以對其前面的20 bp的序列進行基因編輯，作用效率高；(2) 能夠同時作用于不同靶位點，成本低；(3) 由于Cas9的基因是相同的，不同的靶位點只需設計不同的sgRNA，所以載體構建流程簡便；(4) CRISPR/Cas系統還可以完成不能利用TALENs等技術編輯的基因的定點修飾。

當然，CRISPR/Cas9技術在發展過程中也存在一些問題，比如脫靶效應和編輯位置的限制等。為了減少CRISPR/Cas9系統的脫靶效應，科學家們提出了以下一些策略[73]。(1) 通過全基因組同源性檢索選擇出具有最少潛在脫靶位點的導向序列，在這些選出的導向序列中，選擇脫靶錯配集中在導向序列PAM近端的sgRNAs[74-75]。(2) 使用長度較短的導向序列(17-19 nt)[76]。(3) 采用雙切口酶策略。使用一對位置靠近的sgRNAs，Cas9切割酶可以引入兩個靠近的單鏈切口，導致DNA雙鏈斷裂。這種方法已在細胞系中被證實可以將脫靶活性降低50～1500倍，并在小鼠受精卵中實現基因敲除而不影響靶向切割效率[77-78]。(4) 采用dCas9-FokI策略。利用一對間距優化和定位的sgRNAs，與Fok1核酸酶結構域結合的dCas9可以形成二聚體，導致DNA雙鏈斷裂，這與ZFN和TALEN的設計相似。利用這種策略可以大大提高基因編輯的特異性[79-80]。

總之，CRISPR/Cas9技術由于其諸多優點，在短時間內受到了全球眾多科學家的青睞，成為生物學領域重要的研究熱點之一，為基因的定點修飾和編輯開辟了一條新的道路。我國是世界上旱、寒和鹽堿等災害最為嚴重的國家之一，草類植物資源十分豐富。長期生存于干旱、低溫、土壤貧瘠和鹽堿化等嚴酷環境下的野生植物在漫長的進化過程中，形成了獨特的逆境適應機制，蘊涵著豐富的抗逆基因資源，在優良牧草和農作物抗性遺傳改良方面具有潛在的應用價值。然而，由于這些野生植物生活周期長、遺傳背景和生物學性狀十分復雜，很難利用傳統的基因突變技術對其功能基因展開系統研究。因此，CRISPR/Cas9技術的發展無疑為研究野生草類植物抗逆基因的功能提供了強有力的技術支持，從而為系統闡明這些植物的逆境響應機制、并將其用于栽培作物的遺傳改良帶來了曙光。值得一提的是，目前在豆科牧草蒺藜苜蓿中利用CRISPR/Cas9技術已經實現了基因功能的研究，這為其他牧草功能基因的研究奠定了良好的基礎[66]。可以預見，隨著技術的不斷發展完善，CRISPR/Cas9系統及其相關的衍生技術將在植物關鍵功能基因的鑒定以及作物和優良牧草分子設計育種等領域得到廣泛應用，從而造福于農業生產的可持續發展和生態環境安全。

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CRISPR/Cas9: A gene targeting technology and its application in the study of plant genetic function

BAO Ai-Ke*, BAI Tian-Hui, ZHAO Tian-Xuan, SU Jia-Hao

StateKeyLaboratoryofGrasslandAgro-ecosystems,CollegeofPastoralAgricultureScienceandTechnology,LanzhouUniversity,Lanzhou730020,China

CRISPR/Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) was derived from the adaptive immune system of bacteria and archaea to resist attacks from invasive viruses and exogenous DNA. Comparing zinc finger nuclease (ZFN) and transcription activator-like effector nuclease (TALENs), the type II CRISPR/Cas9 system mediated by RNA breaks new ground for gene editing due to its efficiency, low cost and ease of operation for the study of genetic function. This review summarizes recent research and progress of the structure, mechanisms and application of CRISPR/Cas9 for the study of genetic function and crop breeding. We also investigate the potential future development of CRISPR/Cas9.

gene editing； CRISPR/Cas9 system； gene function； molecular breeding

10.11686/cyxb2016430

2016-11-14；改回日期：2017-02-14

國家自然科學基金(31670405，31372360)， 甘肅省科技支撐計劃項目(144FKCA058)和蘭州大學中央高校基本科研業務費專項資金(lzujbky-2016-4)資助。

包愛科(1980-)，男，甘肅岷縣人，副教授。E-mail: baoaik@lzu.edu.cn

*通信作者Corresponding author. E-mail: baoaik@lzu.edu.cn

http://cyxb.lzu.edu.cn

包愛科, 白天惠, 趙天璇, 蘇家豪. CRISPR/Cas9系統：基因組定點編輯技術及其在植物基因功能研究中的應用. 草業學報, 2017, 26(7): 190-200.

BAO Ai-Ke, BAI Tian-Hui, ZHAO Tian-Xuan, SU Jia-Hao. CRISPR/Cas9: A gene targeting technology and its application in the study of plant genetic function. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(7): 190-200.