脂質體在嬰兒體外胃腸道消化的膜結構穩定性

馮炎雯，李 娜，徐紀璇，鄔琰澤，韓劍眾，劉瑋琳*（浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江 杭州 310018）

脂質體在嬰兒體外胃腸道消化的膜結構穩定性

馮炎雯，李 娜，徐紀璇，鄔琰澤，韓劍眾，劉瑋琳*
（浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江 杭州 310018）

建立體外模擬嬰兒胃腸道消化體系（成人為對照），研究脂質體在胃部的氧化應激效應和在小腸環境的脂解動力學。結果表明：脂質體消化后平均粒徑明顯減小、Zeta電位負電性增加；脂質體經胃部消化磷脂膜氧化程度（硫代巴比妥酸值）明顯提高；在小腸消化過程中不斷釋放游離脂肪酸，且嬰兒胃腸道環境水解率（38%）明顯低于成人（80%），釋放過程符合偽一級方程；傅里葉變換紅外光譜研究發現，磷脂特征官能團（C＝O、P＝O、—CH2）峰值發生改變，脂質體在嬰兒胃腸道環境膜結構破壞程度低于成人。研究結果為脂質體運載營養素應用于嬰兒配方食品提供了理論指導。

脂質體；體外消化；嬰兒；膜結構；穩定性

脂質體是一種人工合成的、兼溶于水相和油相的脂質雙分子層囊泡，因具有良好的包封、運載、靶向及控釋等特性，被廣泛應用于基因遺傳、癌癥治療和化妝品等領域[1]。近年，通過包裹營養物質和功能因子從而達到克服異味、提高溶解性和吸收利用率等目的，脂質體技術已逐漸在食品行業嶄露頭角。Wechtersbach等[2]發現脂質體的包裹可大大降低VC的氧化速率；Toniazzo等[3]應用脂質體包埋技術使β-胡蘿卜素的保存期達到95 d，其可代替部分人造色素添加到酸奶中；Tan Chen等[4]研究了用殼聚糖脂質體包埋類胡蘿卜素，并將其應用到功能性食品中的可能性。Gibis等[5-6]用脂質體對木槿花精華、葡萄籽等物質進行包埋，其被認為是一種高效的負載系統。Cui Haiying[7]等用脂質體包埋丁香油，并將其應用于豆腐中，該體系對金黃色葡萄球菌具有高效抑菌作用。

然而，脂質體的易氧化、水解等因素影響其穩定性，嚴重制約脂質體的廣泛應用。脂質的氧化降解產物是某些心血管疾病如動脈粥樣硬化的關鍵誘因，而且脂質體在小腸中的水解作用易使被包埋的營養素釋放，降低了其生物利用率。胃腸道是脂質體攝入體內后發生氧化、降解最明顯的部位。胃內低酸環境和溶解氧是促進脂質體氧化的主要因素[8]；另外，前期研究亦表明小腸中的胰酶易導致脂質體水解，膽酸鹽亦可用作乳化劑增加脂質的分散性，增加酶與脂質的接觸面積，從而加快脂質體降解[9]。然而，當前對食品級脂質體在模擬胃腸道消化的研究較少，更鮮有針對特殊人群如嬰兒環境的報道。

嬰兒食品的營養均衡調配一直是人們的關注焦點，而通過建立嬰兒體外胃腸道模型探討各類營養素的消化利用率是近幾年的研究熱點，如Moscovici等[10]比較了成人和嬰兒體外消化中的美拉德反應，發現該反應可改變蛋白的消化行為和生物活性；Shani-Levi[11]研發了一種體外模型，監控pH值在成人和嬰兒胃部環境中的動態變化，以此反映營養物質（β-胡蘿卜素、乳鐵蛋白和乳狀液）的消化行為。前期研究了脂質體包裹營養素（乳鐵蛋白、血清蛋白）在體外消化過程中的結構變化[12]，但關注點是成人環境而未涉及嬰兒體系。嬰兒和成人消化環境有較大區別，主要是胃液pH值的差異以及消化酶及其質量濃度不同，嬰兒體系pH值（pH 3.0）較成人體系（pH 1.5）偏高，且其胃蛋白酶量（0.8 mg/mL）僅為成人體系（3.2 mg/mL）的1/4[13]。因此，針對脂質體在嬰兒消化環境中行為的研究具有非常重要的意義。

綜上所述，本實驗采用經典薄膜分散法制備脂質體并表征其物化性質（微觀形貌、粒徑、電位）；以成人為對照，建立嬰兒體外消化模型，以消化前后脂質體粒徑電位的變化、硫代巴比妥酸值（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）和過氧化值（peroxide value，POV）研究脂質體在胃部消化過程中脂質的氧化程度；通過游離脂肪酸的釋放和傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR）的表征探討脂質體在小腸消化的脂解特性和官能團結構變化，獲得脂質體在嬰兒體外消化的膜結構穩定性信息，為研究和開發脂質體相關運載體系應用于嬰兒食品提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆卵磷脂、膽固醇、吐溫-80、VE、胃蛋白酶、胰酶、膽酸鹽（均為分析純） 美國Sigma公司；三氯乙酸、碳酸氫銨、硫氰酸銨、TBARS、四水合氯化亞鐵、三氯化鐵（均為分析純） 上海阿拉丁試劑公司；二叔丁基對甲酚（分析純） 國藥（上海）集團化學試劑公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Titrando 907恒pH電位滴定儀 瑞士Metrohm公司；UV3600紫外分光光度儀 日本島津公司；納米級粒徑電位儀 英國Malvern公司；JEM-2100透射電子顯微鏡 日本JEOL公司；ALPHA 2-4 LD Plus冷凍干燥機德國Christ公司；AntarisⅡ FT-IR儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；RE52-98旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；FE20K臺式酸度計 上海Mettler-Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 脂質體的制備

參照Liu Weilin等[14]的研究，采用薄膜分散法制備脂質體：分別稱取大豆磷脂、膽固醇、吐溫-80、VE （6∶1∶1.8∶1.125∶0.12，m/m）溶于無水乙醇，在40 ℃恒溫水浴鍋中避光溶解。待完全溶解后，用旋轉蒸發儀在避光、真空條件下除去乙醇，加入適量0.05 mol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖液，在常壓條件下將脂質體膜水化，形成淡黃色均勻懸濁液即為脂質體。

1.3.2 模擬胃腸液的制備

模擬胃液和腸液的配制方法參照Liu Weilin[9]、Dupont[15]等的報道。

模擬胃液（simulated gastric fluid，SGF）：稱取2 g氫氧化鈉溶于約800 mL的去離子水中，通過滴加濃鹽酸調節pH值，成人模擬胃液pH 1.5，嬰兒模擬胃液pH 3.0，將溶液定容至1 L。成人和嬰兒環境中胃蛋白酶質量濃度分別為3.2 mg/mL和0.8 mg/mL。

模擬腸液（simulated intestinal fluid，SIF）：準確稱取6.8 g磷酸氫二鉀，用800 mL去離子水溶解，將pH值調節至7.4后定容至1 L。其中，成人組中胰酶和膽鹽質量濃度分別為3.2、5.0 mg/mL；嬰兒組則為0.32、1.20 mg/mL。胃酶和胰酶均在反應開始時加入。

1.3.3 脂質體物化性質的測定

新鮮制備的脂質體通過透射電子顯微鏡表征其微觀形貌、粒徑電位儀測量平均粒徑和表面電位。透射電子顯微鏡表征：用蒸餾水將脂質體稀釋至1 mg/mL，將樣品滴加到銅網，而后用醋酸雙氧鈾溶液（2%）染色4 min，吸去多余的液體后，在室溫條件下晾干，用透射電子顯微鏡表征其微觀結構。粒徑、電位測定：取1 mL脂質體用純水稀釋至10 mL，混勻后取樣放入樣品池中進行測定，測定條件為20 ℃，磷脂和分散介質的折射率的比值為1.120。每個樣品至少平行測定3 次。

1.3.4 脂質體在體外模擬胃部消化的氧化應激

將脂質體和模擬胃液以1∶3的體積比混合，加入胃蛋白酶瞬間開始計時。根據Kristinova等[16]的方法，將混合液移入注射器內，在其中預留5 mL空氣，注射器避光放置于37 ℃恒溫搖床中，轉速為95 r/min。每隔30 min取1 mL反應樣品于試管中，滴加碳酸氫銨調節pH值至中性，進行滅酶處理，消化總時間為2.5 h。

1.3.4.1 TBARS值的測定

TBARS值的測定參照Kristinova等[16]的方法并適當修改。取205 μL上述反應物，加入0.3 mL 2%二叔丁基對甲酚乙醇溶液和10 mL TBARS/三氯乙酸儲備液（15 g/100 mL三氯乙酸和0.375 g/100 mL TBARS，用0.25 mol/L HCl溶解），用紫外分光光度法測定其與脂質體的反應產物在532 nm波長處的吸光度，由公式（1）計算得到TBARS值，從而反映氧化應激指數。

式中：A為反應物吸光度；f為樣品的稀釋倍數（200）；V為脂質體體積/mL；ε為吸光系數（156 000 L/（mol·cm））；L為光路寬（1 cm）；m為脂質總質量/kg。

1.3.4.2 POV的測定

POV的測定參照Waraho等[17]的方法并適當修改。取160 μL上述反應物，依次加入8 mL 96%乙醇、320 μL 4%二叔丁基對甲酚乙醇溶液、160 μL 0.4 mol/L乙醇化硫氰酸銨和160 μL 4.5 mmol/L FeSO4·7 H2O溶液（以2 mol/L鹽酸為溶劑），靜置10 min后于500 nm波長處測定吸光度。由公式（2）計算得到POV。

式中：At是反應物吸光度；A0為空白的吸光度；V為脂質體的體積/mL；S是標準曲線的斜率/μg；m是160 μL中磷脂的質量/g；55.845是鐵離子的摩爾質量/（g/mol）；1 000用于單位轉換，2為校正因子。

1.3.5 脂質體在體外模擬小腸消化的膜結構變化

1.3.5.1 脂質體脂解動力學

將脂質體分別與模擬成人和嬰兒小腸液按體積比1∶3混合，調節pH值為7.4，置于水浴鍋中恒溫至37 ℃。然后將混合液轉移至恒pH值酸堿滴定儀，在加入胰酶的瞬間開始計時，通過滴加NaOH（0.05 mol/L）控制混合液在反應過程始終保持pH 7.4，消化反應時間為60 min，記錄混合體系最終所消耗NaOH溶液的體積，表征脂質體的水解動力學。

其中，脂解標準曲線通過測量不同濃度梯度油酸標準品消耗NaOH的體積獲得。具體操作為：分別稱取油酸品溶于異丙醇-甲苯混合液（1∶1，V/V），得到濃度分別為1、2、4、8、16 μmol/L的油酸溶液35 mL，通過滴加0.05 mol/L的NaOH溶液至pH值為7.4，記錄油酸各濃度條件下所消耗的堿液體積，再根據濃度和體積繪制標準曲線。

1.3.5.2 FT-IR法表征官能團結構變化

分別取消化前后脂質體樣品于－80 ℃超低溫冰箱預凍4 h，轉移至冷凍干燥機冷凍干燥48 h，得到脂質體的粉末狀樣品，然后與1%溴化鉀粉末混合、壓片，用FT-IR儀掃描32 次，脂質體樣品的光譜采集范圍是400～4 000 cm－1。

2 結果與分析

2.1 脂質體消化前后的物化性質表征

2.1.1 消化前脂質體的透射電子顯微鏡圖

圖1 脂質體的透射電子顯微鏡圖片Fig. 1 Transmission electron microscopic photos of liposomes

由圖1透射電子顯微鏡結果可知，脂質體形狀規整，呈明顯囊泡狀，具有球形或橢球形結構，分布較均勻，顆粒間彼此分散、獨立，且具有明顯的中空結構，粒徑約200～1 200 nm。通過納米粒徑電位儀測得制備的粗脂質體平均粒徑為（901.5±53.3）nm，表面電位為－（13.3±1.2）mV，粒徑大小與透射電子顯微鏡圖結果基本相符。

2.1.2 脂質體在胃腸道消化后平均粒徑和表面電位變化

圖2 脂質體經胃腸道消化后的平均粒徑和表面電位Fig. 2 Average diameter and zeta potential of liposomes after in vitro digestion

測定脂質體在體外胃腸道消化過程中的粒徑和表面電位，發現經模擬成人和嬰兒環境胃部消化后SGF-A、SGF-I脂質體平均粒徑分別減小至（466.4±5.3）nm 和（541.4±14.8）nm，這與已報道的研究結果一致[9]。在低酸條件下，環境滲透壓大于脂質體內部壓力，壓差使脂質體雙層膜收縮，從而導致粒徑減小。經胃部消化后脂質體表面負電荷量為：成人組（－28.3±1.0）mV、嬰兒組（－22.2±1.5） mV。經模擬小腸消化后，成人組和嬰兒組SIF-A、SIF-I的平均粒徑分別降至（155.3±32.5）nm和（302.1±43.9）nm；表面負電荷分別為（－28.0±2.5）mV和（－39.0±4.3）mV。與胃部環境相比，脂質體在小腸環境中粒徑降低，但不顯著（P＞0.05），其遭到的結構破壞程度略高。在小腸環境中脂質體粒徑的急劇下降可能是由于膽酸鹽的存在：膽酸鹽具有表面活性劑的性質，會破壞脂質體的磷脂雙分子層[18]；此外，經過一段時間的消化，游離脂肪酸、膽酸鹽和磷脂組成膠體結構也可能引起脂質體的平均粒徑減小。在模擬小腸液中，經膽鹽的作用磷脂的疏水基團移向水溶液表面，這可能導致小腸消化后脂質體表面負電荷升高，同時，脂質體壁材磷脂的水解也可能引起負電荷的增加[19]。

2.2 脂質體在胃部消化的氧化應激

圖3 消化過程中脂質體的TBARS值（A）和POV（B）Fig. 3 TBARS (A) and POV (B) of liposomes during in vitro digestion

TBARS法廣泛應用于脂肪氧化酸敗程度的表征，其反應原理是脂肪氧化產物丙二醛（malondialdehyde，MDA）與TBA反應生成的MDA-TBA紅色復合物，在532 nm波長處有紫外吸收[20]，吸收度與復合物生成量成正比。脂肪在氧化過程中會產生一系列的化合物，而氫過氧化物是其最初的氧化產物。可由分光光度法測定氫過氧化物的產量：在酸性條件下，氫過氧化物可將Fe（Ⅱ）氧化成Fe（Ⅲ），通過測定Fe（Ⅲ）與硫氰酸鹽反應生成的紅色硫氰酸鐵絡合物在500 nm波長處的吸光度[21]，可反映脂肪的氧化程度。由圖3A可知，無論是成人對照組還是嬰兒環境，隨著消化時間的延長，TBARS值逐漸增加：嬰兒組由最初的15.06（0 h）mmol/kg上升至反應終點的23.70 mmol/kg（2.5 h），成人組則從20.51 mmol/kg上升到32.02 mmol/kg，脂質體的TBARS值在成人環境整個消化過程中始終高于嬰兒環境，且差異顯著（P＜0.01）。胃內的低酸環境和溶解氧以及金屬離子等復雜的成分，易促進脂類發生氧化應激[15,22]。酸性條件下，Fe2＋能夠催化脂質產生自由基以促進氧化[23-24]。若環境中的pH值高，則TBARS值越低，說明高pH值能抑制脂質氧化，可能是較高的pH值環境抑制了金屬離子的催化活性[25]。由于模擬嬰兒胃液（pH3.0）的pH值比成人（pH1.5）高，因此模擬嬰兒胃部消化過程中脂質體的氧化程度比成人環境低。由圖3B可知，脂質體在嬰兒和成人的模擬胃液中有不同程度的氧化，但產生氫過氧化物并不明顯，其氧化程度甚至有下降趨勢，且在成人和嬰兒環境中反應物產量的差異并不顯著（P＞0.05）。在成人胃部消化過程中，POV在開始消化后的1.0 h達到最大，而后又緩慢下降，在嬰兒體系中，脂質體的氧化趨勢先升后降，可能是在消化后期注射器中氧氣已被利用完全，或者是氧化產物在消化或測定過程中由于溫度變化或遇光分解所致[26]，氫過氧化物易受環境因素影響，分解生成小分子碳水化合物及其他物質，其生成速度低于分解速度，使POV降低[27]。

2.3 脂質體在小腸的脂解動力學

圖4 在模擬小腸液中隨著時間延長脂質體水解率（A）和脂質體脂解的一級動力學曲線（B）Fig. 4 Percentage of lipid digested against time during incubation of liposomes in simulated intestinal fluid (A) and pseudo-first order kinetic plots for liposomes (B)

脂質體在胰蛋白酶和膽酸鹽的作用下易發生水解，釋放游離脂肪酸，降低環境總體pH值；采用恒pH值電位滴定儀滴加已知濃度的NaOH溶液以保持模擬腸液的中性pH值，通過記錄消耗的NaOH溶液的量，間接反映脂質體在小腸環境中的脂解程度。由圖4A可知，隨著消化時間的延長，嬰兒和成人環境中游離脂肪酸的釋放量都逐漸增加，并且嬰兒環境中脂質體的水解程度遠遠低于成人環境。在0～15 min，成人環境中游離脂肪酸的釋放率明顯高于15～45 min時間段的釋放率，但在45 min后游離脂肪酸幾乎停止釋放，脂質體水解率達到最大，約80%。而嬰兒模擬腸液中的游離脂肪酸釋放量始終緩緩上升，1 h后總體水解率約為38%，到達消化終點時脂質體在成人與嬰兒環境中的水解率差異顯著（P＜0.01）。小腸中的胰酶主要成分為脂肪酶、磷脂酶A2和膽固醇酶，均能水解脂質。其中，胰脂肪酶能夠催化磷脂中脂肪酸的水解反應，釋放出脂肪酸和一酰基溶血磷脂[28]；磷脂酶A2能夠催化磷脂的sn-2酯鍵的水解，產生甘油磷酸和溶血磷脂；膽固醇酯酶，又稱膽鹽刺激性脂酶，也能水解磷脂[29]。此外，小腸液中的膽酸鹽成分也對脂解有一定的催化作用。因此，在小腸胰酶和膽鹽的作用下，脂質體的膜結構嚴重遭到破壞，穩定性顯著下降。由于嬰兒環境中胰酶和膽鹽的濃度均低于成人環境，使得游離脂肪酸的釋放量亦小于成人。可用偽一級動力學模型描述脂質體的水解[30]，如公式（3）所示：

式中：Lt為脂質隨時間變化的水解量/%；Lo為脂質的初始量/%；k為偽第一階模型的降解速率常數/s－1；R為通用氣體常數（8.314 J/（mol·K））；T為絕對溫度/K。

根據公式（3）獲得脂質體游離脂肪酸的釋放動力學曲線，如圖4B所示。嬰兒組和成人組的曲線在0～55 min內均比較吻合偽一級動力學方程，相關系數（R2）可達到0.96。此外，嬰兒體系中的k的絕對值（0.007 9 s－1）比成人環境值（0.024 2 s－1）小，即嬰兒體系中脂解速率較成人低（表1）。

表1 脂質體脂解的一級動力學方程參數Table 1 Pseudo-first order kinetic parameters for liposomes

2.4 脂質體在小腸部位消化前后官能團變化

由圖5可知，脂質體磷脂膜官能團特征峰的波數和峰形在消化前后均有變化。其中，脂質體消化后亞甲基（—CH2）的吸收峰變弱，但嬰兒組的峰形變化弱于成人組。經成人小腸消化后亞甲基的吸收波數發生位移，從2 925.5 cm－1移至2 927.4 cm－1，嬰兒組的波數仍為2 925.5 cm－1。原樣（消化前脂質體）磷脂酯鍵（C＝O）的吸收波數為1 737.5 cm－1，消化后嬰兒環境脂質體峰形改變較小，而成人環境峰形明顯減弱。磷氧鍵（P＝O）的吸收波數為1 241.9 cm－1，與消化樣品對比，嬰兒環境的變化微小，而經成人環境消化后峰形變寬，說明磷氧官能團受到較明顯的破壞。綜上，成人較嬰兒條件下磷脂膜結構被破壞的程度更嚴重，這與上述脂解動力學結果一致。引起消化后脂質體官能團變化的原因除了提到的小腸胰酶外，還包括膽酸鹽的作用。膽酸鹽有乳化效果，能夠降低脂質體的表面張力，使其乳化成小液滴，增強分散性，增加胰酶的作用面積，從而促進胰酶的水解作用[9]。

圖5 脂質體在消化后的FT-IR紅外光譜圖Fig. 5 FT-IR spectra of liposomes before and after digestion

3 結 論

本實驗通過研究脂質體在胃腸道消化后粒徑和電位的改變，及其壁材磷脂在胃部的氧化應激和在小腸的脂解動力學和官能團變化，發現到達消化終點時，脂質體的結構均遭到一定程度的破壞，在成人小腸環境中遭到的破壞程度大；隨著消化時間的延長脂質體在胃部的氧化程度升高，且嬰兒環境中的氧化程度小于成人；磷脂被小腸中的胰酶水解釋放出游離脂肪酸的量隨著消化時間的延長而增加，同時，FT-IR圖結果表明磷脂的特征官能團亞甲基（—CH2）、磷脂酯鍵（C＝O）、磷氧鍵（P＝O）的吸收峰值和峰形均發生一定程度的改變，且嬰兒中磷脂膜結構破壞程度明顯低于成人環境。該研究可為脂質體應用于嬰兒必須的功能因子靶向供應提供理論參考，也可為開發營養強化型嬰兒配方食品提供技術參考。

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Membrane Stability of Liposomes during in Vitro Simulated Infant Gastrointestinal Digestion

FENG Yanwen, LI Na, XU Jixuan, WU Yanze, HAN Jianzhong, LIU Weilin*
(School of Food Science and Biotechnology, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310018, China)

In order to study the effect of liposomes on gastric oxidative stress and the lipolysis kinetics of liposomes during gastric and small intestinal digestion, an in vitro infant gastrointestinal system was established, with its adult counterpart as control. Results showed that the average diameter of liposomes was significantly decreased and the negative zeta potential was increased after digestion. The oxidation degree of liposomal membrane, which was characterized by thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), significantly increased after gastric digestion. Free fatty acids were released continuously during stimulated intestinal digestion, and the rate of lipolysis in the infant gastrointestinal system (38%) was obviously higher than that in the adult one (80%). The release profiles fitted first-order kinetics. Moreover, Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR) showed that the peaks of characteristic groups in phospholipids (C=O, P=O and -CH2) changed after digestion, and the liposomal membrane in the infant gastrointestinal system was damaged less seriously than in the adult one. This study can provide a theoretical guidance for liposomes as a nutrient carrier in infant formula.

liposome; in vitro digestion; infant; membrane structure; stability

10.7506/spkx1002-6630-201713010

TS201.4

A

1002-6630（2017）13-0060-06

馮炎雯, 李娜, 徐紀璇, 等. 脂質體在嬰兒體外胃腸道消化的膜結構穩定性[J]. 食品科學, 2017, 38(13): 60-65. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201713010. http://www.spkx.net.cn

FENG Yanwen, LI Na, XU Jixuan, et al. Membrane stability of liposomes during in vitro simulated infant gastrointestinal digestion[J]. Food Science, 2017, 38(13): 60-65. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201713010. http://www.spkx.net.cn

2016-06-11

國家自然科學基金青年科學基金項目（31401482）；浙江省食品科學與工程重中之重一級學科開放基金項目（JYTSP20142011）；浙江省公益技術應用研究計劃項目（2016C32060）；浙江省現代食品安全與營養協同創新中心項目（2017SICR103）

馮炎雯（1994—），女，碩士研究生，研究方向為食品營養與安全。E-mail：530345371@qq.com

*通信作者：劉瑋琳（1984—），女，講師，博士，研究方向為營養物及其運載體系的生物利用。E-mail：lwl512@zjgsu.edu.cn