高壓脈沖電場結合糖基化對β-乳球蛋白過敏原性與功能性質的影響

田 明，涂宗財,2,*，王 輝，楊文華，李 雪，宋啟東（.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.江西師范大學生命科學學院，江西 南昌 330022）

高壓脈沖電場結合糖基化對β-乳球蛋白過敏原性與功能性質的影響

田 明1，涂宗財1,2,*，王 輝1，楊文華1，李 雪1，宋啟東1
（1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.江西師范大學生命科學學院，江西 南昌 330022）

采用高壓脈沖電場（pulsed electric field，PEF）結合糖基化處理β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-Lg），在β-Lg與半乳糖質量比1∶2、反應溫度60 ℃、反應時間3 h、pH 7.4和不同PEF強度反應條件下，研究改性前后β-Lg的過敏原性和功能性質的變化。結果表明，經過PEF結合糖基化處理后，β-Lg自由氨基含量顯著降低，β-Lg過敏原性有一定程度下降，15 kV/cm PEF處理90 μs后進行糖基化，過敏原性降低程度最大；在此條件下，β-Lg的溶解性、乳化性、乳化穩定性及抗氧化活性顯著提高（P＜0.05）。這為制備低致敏性且功能性質好的β-Lg提供了一種新的方法。

脈沖電場；糖基化；β-乳球蛋白；過敏原性；功能性質

β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-Lg）是牛乳清蛋白的主要成分，營養豐富、能與脂肪酸和脂溶性維生素結合[1]。盡管如此，由于其高度的致敏性，使得β-Lg在食品工業中的應用受到限制。近年來，國內外對降低β-Lg的過敏原性進行了大量研究[2-4]。其中，利用化學改性如糖基化[5]、磷酸化[6]等較為普遍。如Li Zheng等[7]利用麥芽糖對α-乳白蛋白和β-乳球蛋白進行糖基化修飾，兩種蛋白的過敏原性顯著降低；Zhong Junzhen等[8]采用低聚果糖與β-Lg結合，β-Lg的過敏原性降低的同時其溶解性、乳化性和乳化穩定性等功能性質都得到改善；Taheri-Kafrani等[9]研究發現糖基化能夠降低β-Lg的過敏原性，且反應程度越高對過敏原性影響越大。然而，目前鮮見脈沖電場結合糖基化對β-Lg的過敏原性進行研究。高壓脈沖電場（pulsed electric fields，PEF）是一種新型非熱食品殺菌技術，與傳統的殺菌技術相比，不僅能夠殺死致病菌、鈍化酶類，還對食品原有的營養、風味、色澤等損害較少。當前，有關PEF對食品蛋白質的研究主要集中在蛋白質的理化性質，而鮮少見關于PEF對蛋白過敏原性的報道。

目前，國內外采用復合改性技術降低蛋白質過敏原性的報道較少。Zhong Junzhen等[10]通過動態高壓微射流協同糖基化改性β-Lg，β-Lg的過敏原性得到顯著降低；López-Expósito等[11]研究發現超高壓結合酶解法改性卵清蛋白，發現卵清蛋白的過敏原性明顯降低；Sun Weiwei等[12]利用PEF結合糖基化處理乳清分離蛋白，發現乳清分離蛋白的溶解性和乳化性得到改善，而且高強度的PEF處理能夠促進糖基化反應；Guan Yongguang等[13]研究發現PEF處理可以促進牛血清白蛋白-葡聚糖溶液體系的糖基化反應。因此，本實驗通過PEF結合糖基化復合改性β-Lg，探究其過敏原性的變化，并且測定改性后蛋白的功能性質是否得到改善，這對PEF加工控制過敏原蛋白致敏性的關鍵技術研究具有理論指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

β-乳球蛋白、半乳糖、魚皮明膠 美國Sigma公司；患者血清 美國PlasmaLab International公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）等其他所需試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

PEF設備由中國農業大學與清華大學自主研發；F-7000熒光光譜儀 日本日立公司；HF2000酶標分析儀北京華安麥科公司；TU-1810紫外-可見分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 PEF處理

用10 mmol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer，PBS）將β-Lg配制成1 mg/mL的溶液，處理時間為90 μs，電場強度為0、5、15、25、35 kV/cm。電場強度（E）和總處理時間（t）計算見公式（1）、（2）[5]。

式（1）、（2）中：U為實際電壓/kV；d為電極板間距/cm，取0.4 cm；n為處理室個數；V為處理腔體積/mL，0.05 mL；f為頻率/Hz；W為脈寬/μs；v為流速/（mL/s）。

1.3.2 糖基化處理

參照Zhang Qiuting等[6]的方法稍作修改，向PEF處理后的樣品溶液中按糖與蛋白質量比2∶1加入半乳糖，混勻，凍干。將凍干后的粉末置于培養箱中在60 ℃、74%相對濕度（飽和氯化鈉溶液）條件下反應3 h，糖基化反應結束后，加入預先冷卻的超純水復溶到質量濃度為2 mg/mL，并置于4 ℃待用。

1.3.3 自由氨基含量的測定

采用鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）法[7]測定自由氨基含量：稱200 mg OPA溶于5 mL的甲醇溶液，再分別加入2.5 g十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS），4.75 g硼砂及0.5 mL β-巰基乙醇，蒸餾水定容至250 mL。此試劑現配現用，避光保存。取4 mL上述OPA試劑于試管中，加入200 μL樣品溶液，空白為200 μL蒸餾水代替樣品，混勻后于室溫條件下反應2 min，340 nm波長處測吸光度。以不同質量濃度（0.0～0.4 mg/mL）的賴氨酸作標準曲線，根據標準曲線計算樣品中自由氨基的含量。

1.3.4 過敏原性的測定

1.3.4.1 過敏患者血清庫

本實驗所用的血清為4 個已被確診為牛乳過敏患者的血清。4 個人（P1、P2、 P3、P4）過敏癥狀如表1所示。

表1 牛乳過敏患者病史Table 1 Clinical history of patients with milk allergy

1.3.4.2 過敏原性的測定

采用間接酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測β-Lg的過敏原性（用IgE結合能力表示），以正常人血清作為陰性對照。酶標板中每孔加入100 μL 10 μg/mL處理后的β-Lg溶液，37 ℃、1 h；每孔加入250 μL 質量分數為1%的魚皮明膠進行封閉，37 ℃、1 h ；加入100 μL一定稀釋比的患者血清，37 ℃、1 h；加抗人IgE酶標二抗，每孔100 μL，37 ℃、1 h，每步操作之后均用PBST溶液洗滌3 次并拍干；加顯色液四甲基聯苯胺顯色，37 ℃避光反應15 min，最后加100 μL 2 mol/L H2SO4溶液終止反應，酶標儀450 nm波長處測吸光度[17]。

1.3.5 溶解性的測定

采用福林-酚法[18]測定可溶性氮的含量，取100 μL 1 mg/mL的樣品溶液至10 mL離心管中，加900 μL蒸餾水，加入5 mL試劑A，混勻，于20～25 ℃放置 10 min，再分別加0.5 mL試劑B，立即混勻，在室溫反應10 min，然后于500 nm波長處測吸光度。空白以1 mL蒸餾水代替樣品作為對照，以不同牛血清蛋白質量濃度（0～250 μg/mL）為橫坐標，對應的吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.6 乳化活性及乳化穩定性的測定

取9 mL 1 mg/mL的樣品溶液和3 mL大豆油在50 mL的離心管中，混勻，在T18分散機中7 200 r/min分散2 min。隨后立即從離心管底部取50 μL乳濁液加入5 mL質量分數為0.1%的SDS溶液中，混勻，500 nm波長處測吸光度（A0）。10 min時再從離心管底部取50 μL乳濁液加到5 mL 0.1% SDS溶液中，500 nm波長處測吸光度（A10）[19]，乳化活性指數 （emulsifying activity index，EAI）和乳化穩定性指數（emulsifying stability index，ESI）的計算見公式（3）、（4）。

式中：DF為稀釋倍數；ρ為蛋白質質量濃度/（g/mL）；θ為乳狀液中油體積分數（0.25）；t為10 min。

1.3.7 DPPH自由基清除率的測定

采用Stanic-Vucinic等[20]的方法加以改動后測定。取1 mL 2 mg/mL樣品溶液與4 mL DPPH溶液（0.1 mmol/L溶于甲醇）混合后，避光反應30 min，517 nm波長處測定其吸光度。對照采用蒸餾水代替樣品溶液，DPPH自由基清除率用公式（5）計算。

式中：As為樣品的吸光度；Ac為對照品的吸光度。

1.3.8 Trolox當量抗氧化能力的測定

采用2,2’氨基-（3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6）二銨鹽（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate，ABTS）試劑盒檢測樣品的Trolox當量抗氧化能力（Trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC）。在酶標板中，每孔加入200 μL ABTS工作液；樣品孔內加入10 μL 2 mg/mL的樣品溶液；空白對照加入10 μL PBS溶液，標準曲線孔內加入10 μL一定濃度的Trolox標準溶液（0.15～0.90 mmol/L），混勻；室溫反應2～6 min后用酶標儀在734 nm波長處測定其吸光度，根據標準曲線算出樣品的TEAC。

1.4 數據統計與分析

實驗數據采用Origin 8.6軟件作圖，SPSS 17.0軟件進行顯著性分析（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 PEF結合糖基化反應對β-Lg自由氨基含量的影響糖基化反應是單糖、還原糖中的羰基或羰基化合物與蛋白質中的氨基共價結合的化學反應。因此可以通過蛋白質的自由氨基含量來反映糖基化反應程度。從圖1可以看出，β-Lg經PEF結合糖基化處理后，自由氨基含量顯著降低，說明糖基化后β-Lg與糖分子發生了共價結合，而且隨著脈沖場強的增大有下降趨勢，可能的原因是經高強度脈沖強度處理，β-Lg的空間結構展開程度更大，β-Lg分子中的氨基暴露在蛋白分子表面，糖基更易與氨基發生共價結合，使得β-Lg的自由氨基含量顯著降低[21]。

圖1 PEF結合糖基化反應對β-Lg自由氨基含量的影響Fig. 1 Effect of PEF combined with glycation on the free amino group content of β-Lg

2.2 PEF結合糖基化反應對β-Lg過敏原性的影響

圖2 PEF結合糖基化反應對β-Lg過敏原性的影響Fig. 2 Effect of PEF combined with glycation on the allergenicity of β-Lg

脈沖電場結合糖基化反應對β-Lg過敏原性（用IgE結合能力表示）的影響如圖2所示。當處理時間為90 μs時，隨著PEF場強的增加，β-Lg的IgE結合能力呈先降低后升高的趨勢。在場強為15 kV/cm時，其IgE結合能力達到最小，隨著場強的進一步增大，IgE結合能力增加且此后呈穩定趨勢。可能的原因是，在場強小于15 kV/cm時，β-Lg分子發生去折疊，使糖基化位點暴露，導致更多的過敏位點被修飾，因此IgE結合能力隨場強的增加而降低，且在15 kV/cm時降低至最小值。然而，隨著場強的進一步增加，β-Lg分子發生聚集，使糖基化位點被掩蓋，導致過敏位點修飾減少，因此，IgE結合能力逐漸增加且呈穩定趨勢。

蛋白的過敏原性與蛋白的空間構象有關。據報道，90%的患者血清的過敏表位為Val41-Trp60、Tyr102-Arg124 和Leu149-Ile162，是β-Lg的主要過敏表位[22]。經過糖基化反應后，過敏表位與糖基發生共價結合，導致IgE結合能力下降[9]。而脈沖電場處理會引起β-Lg的空間結構發生改變，可能破壞或隱藏了過敏表位，從而導致IgE結合能力降低。由圖2可知，4 個患者（P1、P2、P3、P4）對β-Lg的IgE結合能力是不同的（而陰性血清IgE結合力低于0.1，未在圖中標示），如P2患者血清所得復合改性對β-Lg的IgE結合能力影響的結果不是很明顯，顯然患者之間存在個體差異。經過復合改性后的β-Lg的IgE結合能力均有不同程度的降低，而且在電場強度15 kV/cm條件下處理的β-Lg的IgE結合能力下降程度最大。

2.3 PEF結合糖基化反應對β-Lg溶解性的影響

圖3 PEF結合糖基化反應對β-Lg溶解性的影響Fig. 3 Effect of PEF combined with glycation on the solubility of β-Lg

溶解性是蛋白質主要的功能特性之一，是其他功能特性的基礎。從圖3可以看出，熱處理后的β-Lg溶解性有一定程度降低，可能是由于加熱過程導致蛋白發生聚集，因此溶解性降低[10]。此外，經過糖基化處理的樣品溶解性明顯升高（P＜0.05），且PEF結合糖基化復合改性后的溶解性比單一糖基化處理的樣品溶解性要高（P＜0.05）。這是由于糖基化反應，引入了親水性糖基，使得蛋白質的親水基團數量增多，溶解性升高[23]。而PEF處理會促進糖基化反應，使得β-Lg與更多的糖基進行結合，溶解性進一步提高[6]。

2.4 PEF結合糖基化反應對β-Lg乳化性能的影響

蛋白質是一種天然的兩性物質，具有良好的乳化性能。由圖4、5可知，加熱后的β-Lg的乳化活性略有降低。原因是加熱會誘導蛋白發生聚集，分子柔性降低，乳化活性降低，這與Chevalier等[16]研究結論一致；而經過糖基化反應處理后，乳化活性略有提高，且經過PEF結合糖基化復合改性后樣品的乳化活性和乳化穩定性達到最大（P＜0.05）。一方面，因為糖與蛋白發生共價交聯，親水性的糖基增加了復合物的表面活性，從而乳化活性提高；另一方面，PEF處理使蛋白結構展開，分子柔性提高，產生和暴露了更多的疏水性區域，表面疏水性增大，從而乳化活性進一步提高[24]。糖基的引入可增加油/水乳化系統中水相的黏度，同時油/水界面張力也會降低，而且共價結合的糖分子鏈在吸附膜的周圍形成立體網狀結構增加膜的厚度和機械強度，從而增加了乳化液的乳化穩定性[25-26]。根據Sun Weiwei等[12]的研究，PEF處理能夠促進糖基化反應的進行，而且能夠改善蛋白質的乳化活性和乳化穩定性等功能性質。

圖4 PEF結合糖基化反應對β-Lg乳化活性的影響Fig. 4 Effect of PEF combined with glycation on the emulsifying activity of β-Lg

圖5 PEF結合糖基化反應對β-Lg乳化穩定性的影響Fig. 5 Effect of PEF combined with glycation on the emulsion stability of β-Lg

2.5 PEF結合糖基化反應對β-Lg的DPPH自由基清除能力的影響

圖6 PEF結合糖基化反應對β-Lg DPPH自由基清除能力的影響Fig. 6 Effect of PEF combined with glycation on the DPPH scavenging activity of β-Lg

DPPH自由基的清除是糖基化產物提供氫自由基，形成穩定的DPPH-H化合物，其紫色變淺或變黃，形成穩定的反磁化分子。由圖6可知，經糖基化反應處理后的DPPH自由基清除能力顯著提高（P＜0.05），而且經

PEF結合糖基化復合處理后的樣品其DPPH自由基清除能力達到最大（P＜0.05）。原因是糖基化處理后，生成的糖基化產物能夠提供氫鍵，DPPH自由基與氫鍵結合形成DPPH—H分子，從而DPPH自由基清除能力提高。有研究發現，自由基清除能力與糖基化產物的褐變程度有關，而PEF能夠促進糖基化反應，因此PEF結合糖基化后樣品的DPPH自由基清除能力進一步提高[7,27]。

2.6 PEF結合糖基化反應對β-Lg TEAC的影響

圖7 PEF結合糖基化反應對β-Lg TEAC的影響Fig. 7 Effect of PEF combined with glycation on the Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC) of β-Lg

ABTS法廣泛應用于評價食品和酚類等物質的抗氧化能力，該方法快速簡便。由圖7可知，經糖基化處理后的β-Lg的TEAC要高于原蛋白和加熱后的蛋白質（P＜0.05），表明糖基化處理可以提高β-Lg的抗氧化能力。原因是ABTS可被氧化生成藍綠色的ABTS＋·，在有供氫能力的抗氧化劑存在下，ABTS＋·可與之反應，變成無色或淺色的ABTS。糖基化產物可以作為供氫體，從而使得糖基化改性后的β-Lg的自由基清除能力提高[28]。分析DPPH自由基清除能力和TEAC的數據可以看出，β-Lg在兩種評價體系中的自由基清除力有所不同，說明同一種物質在不同抗氧化評價體系表現出的自由基清除能力可能不同，這與Maillard等[29]的研究相似。可見，PEF結合糖基化復合改性β-Lg能夠改善其抗氧化活性。

3 結 論

綜上所述，β-Lg經PEF結合糖基化改性后，過敏表位被修飾和覆蓋，從而導致過敏原性降低。用不同電場強度（5～35 kV/cm）PEF結合糖基化處理后，β-Lg過敏原性呈先降低后升高再趨于穩定的趨勢，且在15 kV/cm PEF處理后進行糖基化，過敏原性降低程度最大，在此條件下過敏原性降低的同時其溶解性、乳化性、乳化穩定性和抗氧化活性均顯著提高。這為制備一種致敏性低且功能性質良好的β-Lg提供了一種新的方法。

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Effect of Glycation Combined with Pulsed Electric Field Pretreatment on Allergenicity and Functional Properties of β-Lactoglobulin

TIAN Ming1, TU Zongcai1,2,*, WANG Hui1, YANG Wenhua1, LI Xue1, SONG Qidong1
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China; 2. College of Life Science, Jiangxi Normal University, Nanchang 330022, China)

This research aimed to investigate the effect of pulsed electric field (PEF) pretreatment combined with glycation on the allergenicity and functional properties of β-lactoglobulin (β-Lg). After being subjected to PEF treatment at different electric intensities, β-Lg solution was added with galactose at a ratio of 1:2 and then they were allowed to react at pH 7.4 and 60 ℃ for 3 h. The results showed that glycation after PEF pretreatment significantly reduced the free amino group content of β-Lg and decreased the allergenicity. The lowest allergenicity of β-LG was observed by PEF pretreatment at 15 kV/cm for 90 μs, accompanied by a significant improvement in the solubility, emulsifying property, emulsion stability and antioxidant activity (P ＜ 0.05). Therefore, glycation combined with PEF pretreatment will have potential application for producing β-Lg with low allergenicity and favorable functional properties.

pulsed electric field; glycation; β-lactoglobulin; allergenicity; functional properties

10.7506/spkx1002-6630-201713015

TS252.1

A

1002-6630（2017）13-0090-06

田明, 涂宗財, 王輝, 等. 高壓脈沖電場結合糖基化對β-乳球蛋白過敏原性與功能性質的影響[J]. 食品科學, 2017, 38(13): 90-95. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201713015. http://www.spkx.net.cn

TIAN Ming, TU Zongcai, WANG Hui, et al. Effect of glycation combined with pulsed electric field pretreatment on allergenicity and functional properties of β-lactoglobulin[J]. Food Science, 2017, 38(13): 90-95. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201713015. http://www.spkx.net.cn

2016-05-11

國家高技術研究發展計劃（863計劃）項目（2013AA102205）

田明（1993—），男，碩士研究生，研究方向為食物資源的開發與高效利用。E-mail：13576935021@163.com

*通信作者：涂宗財（1965—），男，教授，博士，研究方向為食物資源的開發與高效利用。E-mail：tuzc_mail@aliyun.com