酶法水解乳清分離蛋白制備納米纖維

李 璇，單 杰，馮志彪*，劉春紅，李冬梅（東北農業大學理學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

酶法水解乳清分離蛋白制備納米纖維

李 璇，單 杰，馮志彪*，劉春紅，李冬梅
（東北農業大學理學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

采用天冬氨酸內切酶（Asp endoproteinase，AspN）在37 ℃誘導乳清分離蛋白（whey protein isolate，WPI）制備蛋白質納米纖維（protein nanofibrils，PNFs），考察WPI不同水解時間對產物PNFs形貌的影響。利用透射電子顯微鏡、原子力顯微鏡、小分子蛋白質十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、硫磺素T熒光、紅外光譜以及激光散射法對PNFs及形成過程進行表征。結果顯示，該方法制備的產物PNFs呈乳白色，AspN水解得到的5 kD左右的多肽為構筑單元，β-折疊為PNFs穩定存在的主要二級結構，PNFs平均粒徑隨水解時間延長而增大。酶法制備PNFs解決了酸法中的褐變問題，有望拓展其在食品領域的應用。

乳清分離蛋白；天冬氨酸內切酶；蛋白質納米纖維；多肽

蛋白質在一定條件下可自發或觸發地自組裝成具有特定形狀的有序性結構，例如，研究發現人類淀粉樣纖維疾病與其體內蛋白結構的變化有關[1-3]。不僅少數的病原性蛋白能夠構建蛋白質納米纖維（protein nanofibrills，PNFs），食源性蛋白在特定條件下亦可自組裝成納米纖維[4-8]。在食品科學領域，因PNFs具有良好的流變性，主要用作增稠劑[9]和凝膠填充物[10]，降低凝膠成本[11]；另一方面，PNFs可以作為保鮮的涂膜劑[12]，還能夠有效穩定油水/汽水界面[13]。

構建PNFs主要分為酸解高溫誘導和酶解誘導兩種方法。酸解高溫誘導是食源性蛋白構建纖維的主要方法[14-16]，其中乳清分離蛋白（whey protein isolate，WPI）能夠在pH 2.0、353 K條件下自組裝形成纖維狀聚集[17]。通過蛋白質自組裝制備的納米纖維可作為增稠劑和膠凝劑用于食品工業，但酸解高溫誘導得到的乳清分離蛋白納米纖維呈現褐色凝膠狀，極大地限制了其在食品領域的應用。針對以上問題，研究者嘗試采用酶解誘導構建蛋白質納米纖維來減輕褐變。早在1973年，Linke等[18]報道Bence Jones蛋白胃酶水解后在體外可以構建出類似于人類淀粉樣纖維的結構，并指出不同酶處理得到的淀粉樣結構在形態上有所差異。Gao Yuzhe等[19]利用胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶A以及蛋白酶M熱處理改性乳清濃縮蛋白后發現了不同程度聚集的纖維體。Akkermans等[20]研究天冬氨酸蛋白酶酶解β-乳球蛋白后溫育誘導可以得到長的纖維狀聚集物。但β-乳球蛋白的價格昂貴，缺乏實際應用價值。

天冬氨酸內切酶（Asp endoproteinase，AspN）是一種能夠限制性切割天冬氨酸殘基和谷氨酸殘基N端肽鍵的鋅金屬內切酶[21]。本研究以工業生產干酪以及干酪素的廉價副產品WPI為原料，采用AspN水解并在接近于常溫條件誘導制備PNFs。以透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察不同水解時間終產物PNFs的形貌，對WPI水解液和WPI-PNFs用原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）分析納米纖維的表面微現結構及剖面，利用小分子蛋白質十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（tricine-sodium dodecyl sulphatepolyacrylamide gel electrophoresis，Tricine-SDS-PAGE）對水解物進行分子質量分析，以硫磺素T熒光和紅外光譜對PNFs形成過程二級結構β-折疊進行定量考察，激光納米粒徑技術對PNFs粒徑分布進行表征。酶法誘導構建的PNFs呈現乳白色，相比于酸解高溫誘導的PNFs，條件溫和易于制備，而且解決了褐變問題，有望拓展在食品領域的應用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

WPI（蛋白質量分數為91.5%） 美國Hilmar公司；AspN（EC. 3.4.24.76） 美國NEB公司；超低分子質量標準蛋白質 美國Thermo Scientific公司；溴化鉀（光譜純）、硫磺素T 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

磁力加熱攪拌器 杭州儀表電機廠；Z36HK冷凍離心機 德國Hermle公司；SHB-36型循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿公司；FE-20型pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；數顯式電熱恒溫水浴鍋天津歐諾儀器儀表有限公司；H-7650型TEM 日本日立公司；ICON3100型掃描探針顯微鏡 德國Bruker公司；凝膠成像分析系統 上海山富科學儀器有限公司；FTIR-8400S傅里葉變換紅外光譜儀 日本島津株式會社；PE LS-55熒光分光光度計 美國PE公司；90Plus/BI-MAS激光納米粒徑分析儀 美國Brookhaven公司。

1.3 方法

1.3.1 WPI納米纖維的制備

將WPI溶解于50 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液（pH 8.0，含2 mmol/L醋酸鋅）中配制成質量分數為3%的蛋白溶液。室溫條件下磁力攪拌30 min使蛋白質充分溶解。9 000 r/min、4 ℃離心15 min后上層清液用尺寸Ф100 mm，孔徑0.45 μm的混合纖維素酯微孔濾膜真空抽濾去除不溶性蛋白。AspN按0.83 U/mg蛋白質加入到上述蛋白溶液中，于37 ℃進行反應一定時間后，加入體積分數18%鹽酸調節至pH 2.0終止酶解反應。

酶解反應后的WPI水解液在30 ℃條件下繼續攪拌24 h后，取出置于4 ℃冰箱中冷藏備用，以不加酶的WPI溶液作為空白對照。

1.3.2 TEM觀察

通過TEM觀察WPI納米纖維的微觀形貌，采用Bolder等[22]的方法并加以改進。取待測樣品100 μL，加入2 mL pH 2.0的鹽酸溶液，混勻后經100 kD的超濾離心管（離心管先用pH 2.0的鹽酸溶液沖洗）3 000 r/min離心15 min，去除濾液后再將2 mL pH 2.0鹽酸溶液加入到截留物中，再次3 000 r/min離心15 min，截留物用2 mL pH 2.0的鹽酸溶液注滿，重復3 次，最后將1 mL pH 2.0的鹽酸溶液加入到截留物中，翻轉倒置，轉移至1.5 mL的塑料管中，樣品最終稀釋倍數接近于10 倍。取適量的樣品滴加到專用銅網的碳膜上，靜置吸附15 min，用濾紙于邊緣緩慢移走多余液體之后滴加質量分數2%醋酸鈾進行負染色約8 min，于TEM進行纖維形貌的觀察，并捕捉拍照得到WPI納米纖維的形貌圖。

1.3.3 AFM掃描

AFM掃描通過ICON3100型掃描探針顯微鏡進行。本工作中AFM的測量條件如下：采用輕敲模式（Tapping Mode）成像，將新鮮干凈的載玻片浸入到樣品中，取出后于常溫條件進行干燥。將樣品的載玻片用雙面膠小心地粘貼到金屬片，放置于顯微鏡載物臺上，掃描探針為商用氮化硅針尖，力的常數為3.2 N/m，微懸臂常數為180 μm，觀察蛋白質的微觀形態特征。

1.3.4 硫磺素T熒光定量分析

將7.9 mg硫磺素T溶于8 mL 10 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.0，含150 mmol/L NaCl）制得硫磺素T儲備液。完全溶解后，過濾除去不溶性的雜質，儲備液在4 ℃的冰箱中避光保存。硫磺素T儲備液稀釋50 倍得到工作液，取48 μL樣品加入4 mL工作液，混合均勻反應約1 min后進行熒光分析[23]。檢測條件：激發波長設定為460 nm，掃發射光譜，掃描范圍為470～600 nm，激發光狹縫10 nm，發射光狹縫10 nm，掃描速率200 nm/min。每個樣品熒光值重復測定3 次，整個實驗過程注意避光。

1.3.5 紅外光譜分析

真空冷凍干燥WPI納米纖維樣品與干燥KBr按1∶200充分研磨混勻，用溴化鉀壓片模具壓片后掃描中紅外圖譜，樣品室N2吹掃，檢測器DTGS。參數設置：掃描次數64，分辨率4 cm－1，掃描范圍4 000～400 cm－1。圖譜分析處理采用Liu Chunhong等[24]的方法。

1.3.6 Tricine-SDS-PAGE分析

參照Sch?gger等[25]的方法，略有改動。分離膠（質量分數16.5%）、間隙膠（質量分數10%）、濃縮膠（質量分數4%）按體積比為4.0∶1.0∶1.5進行。配制10 mg/mL水解物樣品，取100 μL溶液于1.0 mL離心管中與Tricine-SDS-PAGE緩沖溶液1∶1混合均勻，點樣前將樣品在沸水浴中煮沸5 min，使蛋白質與SDS結合變性[26]，點樣量為10 μL。凝膠電泳于恒壓模式下進行，濃縮膠和間隙膠為60 V恒壓，到達分離膠后，電壓調至120 V。電泳結束后，將膠片放入乙醇和戊二醛水溶液（體積分數30%乙醇、0.5%戊二醛）中固定30 min，取出放入染色液中（含0.25%考馬斯亮藍R-250、50%甲醇、10%乙酸）染色1 h后用脫色液（甲醇-冰乙酸-水體積比2∶2∶9）脫色，更換脫色液直至條帶清晰、背景色完全褪去為止。采用凝膠成像系統中的LabWorks 4.5軟件進行數據采集。

1.3.7 水合半徑分析

將樣品稀釋至濃度為0.1%加入到比色皿中，PNFs水合半徑的變化采用90Plus/BI-MAS激光納米粒徑分析儀進行測定。參數設置如下：顆粒折光率為1.347；分散劑：水；常溫25 ℃測量。每個樣品測量3 次，結果取平均值。1.4 數據處理與統計

將所有數據用SAS 9.3統計分析軟件進行單因素方差分析，顯著性差異界值預設為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 酶法與酸法制備的PNFs對比

圖1 AspN法（a）與酸法（b）構建的PNFs顏色對比Fig. 1 Comparison of whey isolateprotein nanofibrils prepared with AspN (a) or acid (b)

如圖1所示，酶法誘導WPI制備出的納米纖維呈現乳白色，明顯改善了酸法高溫誘導制備納米纖維中的褐變問題。

2.2 PNFs形貌分析

采用AspN對分離分離蛋白進行不同時間的水解后，調節pH值至2.0培育24 h，對產物進行TEM觀察，所得結果如圖2所示。

圖2 WPI溶液在不同水解時間條件下培養24 h后TEM圖Fig. 2 Morphology of whey protein isolate solution incubated for 24 h after different hydrolysis times

從圖2可以看出，在2～24 h電子顯微鏡圖中均能觀察到纖維的存在，且呈不均勻分布，長短不一地共存于溶液中，WPI水解24 h后培養的纖維形貌最佳。隨水解時間的延長，WPI的水解度增大，顆粒性蛋白質斑塊明顯減少，聚集體逐漸展開形成短小的纖維，進而相互纏繞呈團簇狀。這說明WPI經AspN水解24 h后，得到的水解物經過培育能夠形成高度有序的納米纖維結構。

AFM圖片可以用來分析納米纖維的表面微現結構，并且能給出三維成像。分別在輕敲模式下觀察WPI未水解溶液（0 h）和加酶水解24 h后的微觀結構。

圖3 輕敲模式的掃描探針AFM圖Fig. 3 Scanning probe AFM images in the tapping mode

如圖3所示，0 h時蛋白還未進行水解，以顆粒狀聚集在一起；24 h后經過水解及培養過程，形成不均勻分布的細長纖維，其中還可以看出一些未形成纖維的單體，纖維的長度長短不一。同樣證實了PNFs形成過程中水解的重要性，間接證明PNFs的構筑單元為多肽。Oboroceanu等[27]利用AFM研究80 ℃體積下β-乳球蛋白加熱85 min后，形成的纖維伸直長度大于10 μm。

圖4 剖面線圖Fig. 4 Profile chart

圖4 分別為WPI水解液和WPI-PNFs的剖面線圖。未水解溶液樣品顆粒具有不同大小，高度為3～8 nm左右；水解后PNFs高度可以達到9～15 nm，可能是由于WPI纖維的疊加引起纖維堆積。

2.3 水解物的分子質量

通過Tricine-SDS-PAGE技術分析WPI及其水解物的分子質量分布，結果見圖5。可以看出，WPI的分子質量主要在10～20 kD之間，其中在14～20 kD的條帶顏色最深且最寬，說明在此分子質量范圍內的蛋白含量最高，推測是β-乳球蛋白；其次14 kD左右的條帶顏色較深，推測是WPI中含量的α-乳白蛋白；其他條帶分子質量高于30 kD的蛋白可能是牛血清白蛋白等蛋白質。隨著處理時間的延長，分子質量14 kD以下出現新條帶，分子質量為5 kD左右的多肽變多，且條帶的顏色逐漸變深。水解24 h時，大多數蛋白被水解后分子質量降低，僅有少量蛋白未被水解。結合TEM圖證實，形成纖維聚集物的結構單元是肽而不是蛋白分子[28]。

圖5 不同水解時間WPI水解物的分子質量Fig. 5 Tricine-SDS-PAGE profiles of whey protein hydrolysates at different hydrolysis times

2.4 纖維生長動力學分析

硫磺素T是一種外源熒光染料，屬陽離子苯并噻唑，與淀粉樣纖維結合后可極大提高纖維物質的熒光強度，從而判斷纖維的聚集情況，因此經常用來檢測淀粉樣纖維變化并以此判斷淀粉樣纖維的成熟情況[19]。利用AspN對WPI水解0、1、2、3、4、6、8、10 h及24 h，然后在30 ℃、pH 2.0條件下培育24 h，對產物進行硫磺素T熒光分析。

圖6 水解不同時間硫磺素T熒光強度增加的纖維生長動力學Fig. 6 Kinetics of fibrils formation as observed by increase in ThT fluorescence intensity with hydrolysis time

從圖6可以看出，0～1 h之間熒光強度變化與1～4 h相比較小，推測可能是纖維形成的“遲滯期”；隨著水解時間的延長，在1～10 h之間熒光強度迅速增大，推測此階段為纖維的快速“生長期”；水解10 h后，熒光強度增大的幅度趨于平穩，新的纖維生成量減少，纖維的含量逐漸進入“穩定階段”。這表明纖維化聚集的過程在初始階段變化較快，這可能與蛋白質分子的亞基解離和水解速度有關[29]。

2.5 二級結構含量的變化

對WPI pH 8.0條件下水解24 h的凍干樣以及對水解物在最佳條件下培育24 h的樣品進行紅外光譜測定，紅外光譜原始譜圖如圖7所示。

圖7 不同樣品傅里葉變換紅外光譜原始譜圖Fig. 7 Original FTIR spectra of different samples

對原始圖譜進行求導、去卷積、曲線擬合如圖8所示，對各子峰進行指認和計算后，得到對應的二級結構相對含量見表1。

圖8 紅外光譜的酰胺類Ⅰ帶曲線擬合的比較Fig. 8 Comparison of infrared spectra of the amide Ⅰ band with curvr fitting

表1 不同樣品二級結構相對含量Table 1 The contents of secondary structures in different samples %

由表1可以看出，在蛋白質水解過程中β-折疊相對含量降低而β-轉角相對含量升高，原因可能是水解過程蛋白質天然結構展開，次級鍵破壞，肽鍵發生斷裂后，β-轉角更能夠穩定存在于水解液中；多肽自組裝形成PNFs的過程中，α-螺旋和β-轉角相對含量明顯下降，而β-折疊相對含量顯著增加到53.67%，可能是由于呈堿性的水解液中，β-轉角的第1個氨基酸殘基的羰基與第4個氨基酸殘基的亞氨基之間氫鍵穩定存在，而酸性環境使其180°回折處的氫鍵遭到破壞，在同一條肽鏈或者相鄰肽鏈的羰基與酰胺基之間形成氫鍵存在于β-折疊中，β-折疊的氫鍵能夠促進肽鏈延展并聚集形成納米纖維[30]。Oboroceanu等[27]研究β-乳球蛋白熱誘導聚集時，也證實了在纖維化過程中蛋白質二級結構的α-螺旋含量與β-折疊含量成反比關系。這間接說明β-折疊是構成WPI納米纖維的主要二級結構。

2.6 粒徑分析

動態光散射法是一種可以對蛋白質聚集程度做定性分析的方法，是從整體角度表征溶液中蛋白質粒徑及平均分布等信息。利用AspN水解WPI，測定不同水解時間（0、1、2、3、4、6、8、10、24 h）的纖維聚集物的水合半徑，結果見圖9。

圖9 不同水解時間形成PNFs的粒徑分布圖Fig. 9 Size distribution of PNFs obtained at different hydrolysis times

圖10 平均粒徑-水解時間的關系Fig. 10 Average hydrodynamic radius vs. hydrolysis time

圖10 為隨水解時間PNFs的水合半徑的分布圖。綜合圖9、10結果表明，PNFs的平均粒徑分布主要在80～2 500 nm之間，隨著水解時間的延長，平均粒徑增加，水合半徑的分布范圍也逐漸變寬。這一結果與TEM圖比較接近，與Kroesnijboer等[31]的研究結果一致。平均粒徑的增加沒有經歷類似“S”型滯后生長的趨勢，推測原因可能是隨著酶水解時間的延長，形成的多肽分子質量逐漸降低，自組裝形成納米纖維需要小分子質量的多肽相互纏繞交聯，而相對大分子質量的多肽或者蛋白不是納米纖維的構筑單元。

3 結 論

以WPI為原料，采用AspN水解后于酸性條件下培育能夠制備出PNFs。酶法制備的PNFs于TEM下呈現有序的團簇狀。利用Tricine-SDS-PAGE、硫磺素T熒光、紅外光譜以及激光納米粒徑技術對PNFs形成過程進行表征，結果顯示PNFs的構筑單元為多肽，平均粒徑與水解時間成正比，且在形成過程中二級結構β-折疊相對含量增加。

本研究所選的原料蛋白為WPI，較β-Lg廉價易得，構建PNFs的條件溫和易控制，得到的溶液呈現乳白色的渾濁狀，無褐變現象。因此，此法制備的PNFs可望作為功能性食品添加物用于食品工業，具有較好的應用前景。

[1] DOI H, KOYANO S, SUZUKI Y, et al. The RNA-binding protein FUS/TLS is a common aggregate-interacting protein in polyglutamine diseases[J]. Neuroscience Research, 2010, 66(1): 131-133. DOI:10.1016/j.neures.2009.10.004.

[2] 劉鵬, 趙玉芬, 李艷梅. Tau蛋白介導阿爾茲海默病的機理及相關藥物[J]. 中國科學: 化學, 2010(7): 906-913.

[3] SELIVANOVA O M, GLYAKINA A V, GORBUNOVA E Y, et al. Structural model of amyloid fibrils for amyloidogenic peptide from Bgl2p-glucantransferase of S. cerevisiae, cell wall and its modifying analog. new morphology of amyloid fibrils[J]. Biochimica et Biophysica Acta, 2016, 1864(11): 1489-1499. DOI:10.1016/ j.bbapap.2016.08.002.

[4] LOVEDAY S M, WANG X L, RAO M A, et al. β-Lactoglobulin nanofibrils: effect of temperature on fibril formation kinetics, fibril morphology and the rheological properties of fibril dispersions[J]. Food Hydrocolloids, 2012, 27(1): 242-249. DOI:10.1016/ j.foodhyd.2011.07.001.

[5] OBOROCEANU D, WANG L, BRODKORB A. Characterization of β-lactoglobulin fibrillar assembly using atomic force microscopy, polyacrylamide gel electrophoresis, and in situ fourier transform infrared spectroscopy[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010, 58(6): 3667-3673. DOI:10.1021/jf9042908.

[6] HOLM N K, JESPERSEN S K, THOMASSEN L V, et al. Aggregation and fibrillation of bovine serum albumin[J]. Biochimica et Biophysica Acta, 2007, 1774(9): 1128-1138. DOI:10.1016/j.bbapap.2007.06.008.

[7] 張業輝. 蕓豆蛋白纖維狀聚集及凝膠機理研究[D]. 廣州: 華南理工大學, 2010: 58.

[8] 馮金鳳. 乳清分離蛋白自組裝纖維反應機制及其應用研究[D]. 哈爾濱: 東北農業大學, 2014: 37.

[9] HUMBLET-HUA K N P, SAGIS L M C, LINDEN. Encapsulation systems based on proteins, polysaccharides, and protein-polysaccharide complexes[J]. Lecture Notes in Computer Science, 2009(1): 501-506.

[10] van DIJKE K C, SCHROEN K C, BOOM R M. Microchannel emulsification: from computational fluid dynamics to predictive analytical model[J]. Langmuir, 2008, 24(18): 10107-10115. DOI:10.1021/la801411x.

[11] 劉剛. 燕麥蛋白結構、自組裝性質及其納米纖維形成研究[D]. 廣州: 華南理工大學, 2011: 99.

[12] 馮志彪, 劉春紅, 姜彬, 等. 一種雞蛋保鮮乳清蛋白自組裝纖維涂膜劑及其使用方法: CN103444839 A[P/OL]. [2016-04-16]. http:// d.wanfangdata.com.cn/Patent/CN201310397653.3/.

[13] JUNG J M, GUNES D Z, MEZZENGA R. Interfacial activity and interfacial shear rheology of native β-lactoglobulin monomers and their heat-induced fibers[J]. Langmuir, 2010, 26(19): 15366-15375. DOI:10.1021/la102721m.

[14] MUDGAL P. Kinetic study of β-lactoglobulin thermal aggregation at low pH[J]. Journal of Food Engineering, 2011, 106(2): 159-165. DOI:10.1016/j.jfoodeng.2011.04.025.

[15] TANG Chuanhe, WANG Changsheng. Formation and characterization of amyloid-like fibrils from soy β-conglycinin and glycinin[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010, 58(20): 11058-11066. DOI:10.1021/jf1021658.

[16] ROGERS S S, VENEMA P, PLOEG J P M V D, et al. Investigating the permanent electric dipole moment of β-lactoglobulin fibrils, using transient electric birefringence[J]. Biopolymers, 2006, 82(3): 241-252. DOI:10.1002/bip.20483.

[17] 劉春紅, 馮金鳳, 馮志彪, 等. 乳清蛋白自組裝纖維形成的臨界聚集質量濃度研究[J]. 中國食品學報, 2016, 16(1): 69-76. DOI:10.16429/ j.1009-7848.2016.01.010.

[18] LINKE R P, ZUCKERFRANKLIN D, FRANKLIN E D. Morphologic, chemical, and immunologic studies of amyloid-like fibrils formed from Bence Jones proteins by proteolysis[J]. Journal of Immunology, 1973, 111(1): 10-23.

[19] GAO Yuzhe, XU Honghua, JU Tingting, et al. The effect of limited proteolysis by different proteases on the formation of whey protein fibrils[J]. Journal of Dairy Science, 2013, 96(12): 7383-7392. DOI:10.3168/jds.2013-6843.

[20] AKKERMANS C, VENEMA P, van der GOOT A J, et al. Enzyme-induced formation of β-lactoglobulin fibrils by AspN endoproteinase[J]. Food Biophysics, 2008, 3(4): 390-394. DOI:10.1007/s11483-008-9094-3.

[21] GRIMWOOD B G, PLUMMER T H, TARENTINO A L. Purification and characterization of a neutral zinc endopeptidase secreted by Flavobacterium meningosepticum[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 1994, 311(1): 127-132. DOI:10.1006/abbi.1994.1217.

[22] BOLDER S G, VASBINDER A, SAGIS L M C, et al. Heat-induced whey protein isolate fibrils: conversion, hydrolysis, and disulphide bond formation[J]. International Dairy Journal, 2007, 17(7): 846-853. DOI:10.1016/j.idairyj.2006.10.002.

[23] 王昌盛. 大豆球蛋白自組裝纖維的形成及靜電屏蔽調控研究[D]. 廣州: 華南理工大學, 2011: 14.

[24] LIU Chunhong, LIU Wen, FENG Zhibiao, et al. Aggregation of whey protein hydrolysate using alcalase 2.4 L[J]. PLoS ONE, 2014, 9(10): e109439. DOI:10.1371/journal.pone.0109439.e.

[25] SCHAGGER H, JAGOW G V. Tricine-sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa[J]. Analytical Biochemistry, 1987, 166(2): 368-379.

[26] 曹佐武. 有效分離1kDa小肽的Tricine-SDS-PAGE方法[J]. 中國生物工程雜志, 2004, 24(1): 74-76.

[27] OBOROCEANU D, WANG L, BRODKORB A, et al. Characterization of beta-lactoglobulin fibrillar assembly using atomic force microscopy, polyacrylamide gel electrophoresis, and in situ fourier transform infrared spectroscopy[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010, 58(6): 3667-3673. DOI:10.1021/jf9042908.

[28] AKKERMANS C, VENEMA P, AJ V D G, et al. Peptides are building blocks of heat-induced fibrillar protein aggregates of betalactoglobulin formed at pH 2[J]. Biomacromolecules, 2008, 9(5): 1474-1479. DOI:10.1021/bm7014224.

[29] BIANCALANA M, KOIDE S. Molecular mechanism of thioflavin-T binding to amyloid fibrils[J]. Biochimica et Biophysica Acta, 2010, 1804(7): 1405-1412. DOI:10.1016/j.bbapap.2010.04.001.

[30] 呂明, 趙熹, 申興桂, 等. 肽β聚集的分子動力學模擬[J]. 高等學校化學學報, 2010, 31(8): 1626-1629.

[31] KROESNIJBOER A, VENEMA P, BOUMAN J, et al. Influence of protein hydrolysis on the growth kinetics of β-Lg fibrils[J]. Langmuir, 2011, 27(10): 5753-5761. DOI:10.1021/la104797u.

Preparation of Nanofibrils by Enzymatic Hydrolysis of Whey Protein Isolate

LI Xuan, SHAN Jie, FENG Zhibiao*, LIU Chunhong, LI Dongmei
(College of Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

In the present study, Asp endoproteinase (AspN) was used to induce whey protein isolate (WPI) for preparing protein nanofibrils (PNFs) at 37 ℃. Transmission electron microscopy (TEM), atomic force microscope (AFM), tricine-SDS-PAGE, thioflavin T fluorescence spectroscopy, infrared spectroscopy and laser scattering were used for the characterization of PNFs and its formation process. The results showed that the PNFs was milky white in color, and peptides with a molecular weight of 5 kD were the building blocks for PNFs. The major secondary structure in PNFs was β-fold, which played a role in its stability, and the average particle size of PNFs was positively proportional to hydrolysis time. The enzymatic preparation of PNFs, overcoming the problem of browning, is expected to expand its application in food industry.

whey protein isolate (WPI); Asp endoproteinase (AspN); protein nanofibrils (PNFs); peptides

10.7506/spkx1002-6630-201713020

Q518.4

A

1002-6630（2017）13-0118-07

李璇, 單杰, 馮志彪, 等. 酶法水解乳清分離蛋白制備納米纖維[J]. 食品科學, 2017, 38(13): 118-124. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201713020. http://www.spkx.net.cn

LI Xuan, SHAN Jie, FENG Zhibiao, et al. Preparation of nanofibrils by enzymatic hydrolysis of whey protein isolate[J]. Food Science, 2017, 38(13): 118-124. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201713020. http://www.spkx.net.cn

2016-05-24

黑龍江省教育廳面上項目（12531007）；黑龍江省青年科學基金項目（QC2010029）

李璇（1992—），女，碩士研究生，研究方向為應用化學。E-mail：1539182217@qq.com

*通信作者：馮志彪（1967—），男，教授，博士，研究方向為應用化學。E-mail：fengzhibiao@neau.edu.cn