黑靈芝多糖體內抗炎活性及對甘露糖受體表達的影響

張妍淞，李文娟，湯小芳，聶少平，謝明勇*（南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

黑靈芝多糖體內抗炎活性及對甘露糖受體表達的影響

張妍淞，李文娟，湯小芳，聶少平，謝明勇*
（南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

目的：研究水溶性黑靈芝多糖（a water-soluble polysaccharides from Ganoderma atrum，PSG）-1體內抗炎活性及對甘露糖受體（mannose receptor，MR）表達的影響。方法：腹腔注射脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）建立小鼠體內炎癥模型，隨機分為5 組：正常對照組、LPS組、PSG-1（高、中、低劑量，分別為100、50、25 mg/（kg·d））＋LPS組。流式細胞儀檢測巨噬細胞中MR表達、吞噬功能及活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成，用酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）分析血清中腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、白細胞介素（interleukin，IL）-1β和IL-6的含量。結果：與正常對照組相比，LPS組腹腔巨噬細胞表面MR表達量下降，與LPS組相比，PSG-1＋LPS組腹腔巨噬細胞表面MR表達量極顯著增加（P＜0.01）；與正常對照組相比，LPS組腹腔巨噬細胞吞噬能力和ROS生成增加，與LPS組相比，PSG-1＋LPS組腹腔巨噬細胞吞噬功能和ROS生成顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；與正常對照組相比，小鼠經LPS處理后，血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌水平極顯著升高（P＜0.01）；與LPS組相比，小鼠灌胃PSG-1后，PSG-1（高劑量）＋LPS組中TNF-α的含量顯著降低（P＜0.05），IL-1β和IL-6的分泌水平無顯著差異。結論： PSG-1具有抗炎作用，可部分抑制LPS誘導的體內炎癥，其機理與PSG-1促進小鼠腹腔巨噬細胞表面MR的表達、抑制巨噬細胞向M1型極化有關。

黑靈芝多糖；脂多糖；巨噬細胞；甘露糖受體；吞噬功能；炎癥因子；極化

Key words: Ganoderma atrum polysaccharide; lipopolysaccharide; macrophage; mannose receptor; phagocytosis; cytokine; polarization

黑靈芝為真菌界、擔子菌綱、多孔菌科、靈芝屬真菌，被奉為靈芝中的上等佳品。Chen Yi等[1]首次從黑靈芝子實體中提取一種水溶性多糖并且用凝膠過濾柱對其進行分離，得到的多糖命名為水溶性黑靈芝多糖（a watersoluble polysaccharide from Ganoderma atrum，PSG-1）。李文娟等[2]通過腹腔注射環磷酰胺建立免疫抑制模型，實驗證明PSG-1還能夠顯著提高免疫抑制小鼠的機體免疫力。張莘莘等[3]通過測定腹腔巨噬細胞培養上清中NO、血清中腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、白細胞介素（interleukin，IL）-1β的分泌水平，發現PSG能有效地增強小鼠腹腔巨噬細胞的免疫能力，可改善脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）對小鼠腹腔巨噬細胞的誘導作用。研究證實，巨噬細胞功能的發揮與其細胞表面受體密切相關，細胞表面受體可應答外源物或微生物病原體，并誘導隨后的細胞內信號級聯。目前已發現的細胞表面模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）包括Toll樣受體（Toll-like receptors，TLR）[4]、樹突狀細胞相關C型凝集素（dendritic cell-associated C-type lectin，Dectin）-1[5]、甘露糖受體（mannose receptor，MR）[6]、清道夫受體（scavenger receptor，SR）[7]等。其中，MR可特異性地識別以甘露糖、巖藻糖或N-乙酰葡糖胺為末端的配體并與之結合，在病原體的識別、吞噬與清除[8]等諸多炎癥反應過程中都發揮著重要的作用。張匯等[9]對PSG-1進行結構表征，表明該多糖主要由甘露糖、半乳糖與葡萄糖組成。帥小雪等[10]通過體外培養小鼠腹腔巨噬細胞探討PSG-1對MR的影響，證實MR能介導PSG-1對小鼠腹腔巨噬細胞的免疫調節作用。為了更好地探討PSG-1對巨噬細胞表面模式識別受體MR的影響，本實驗在前期研究的基礎上，通過一次性大劑量腹腔注射LPS建立小鼠炎癥模型，體內研究PSG-1對炎癥模型中巨噬細胞MR表達的影響及其抗炎作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

實驗動物：BALB/c清潔級小鼠（許可證號：SCXK（湘）2011-0003），雄性，6～8 周，體質量（20±2） g 湖南斯萊克公司。本實驗中使用的所有動物，遵循美國國立衛生研究院頒布的《實驗動物保護與使用準則》。

PSG-1（純度＞99.8%）由南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室自制。

LPS、胎牛血清、異硫氰酸熒光素標記的葡聚糖（fluorescein isothiocyanate-dextran，FITC-dextran）美國Sigma公司；DMEM培養基 美國Thermo公司；2’,7’-二氯熒光素二乙酸酯（2’,7’-dichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA） 美國Molecular Probes公司；FITC-大鼠抗小鼠CD206抗體 英國Abacm公司；TNF-α酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、IL-1β ELISA試劑盒、IL-6 ELISA試劑盒武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 儀器與設備

Varioskan Flash多功能酶標儀 美國Thermo公司；3K15-高速冷凍離心機 美國Sigma公司；FACSCaliburTM流式細胞儀 美國Becton Dickinson公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠體內炎癥模型的建立

小鼠分籠飼養于空調溫室內，溫度（22±2）℃，相對濕度50%～60%，自動調控晝夜各12 h，飼料喂養，自由飲水，實驗前靜養7 d。然后隨機分組，每組10 只，分別是正常對照組、LPS（15 mg/（kg?d），以體質量計，下同）組、LPS＋PSG-1低劑量（25 mg/（kg?d））組、LPS＋PSG-1中劑量（50 mg/（kg?d））組、LPS＋PSG-1高劑量（100 mg/（kg?d））組。PSG組的小鼠均通過灌胃方式給予前處理6 d。同時，空白對照組和LPS組的小鼠通過灌胃方式給予相同體積的生理鹽水。在處死之前1 h，腹腔注射LPS建立免疫篩選模型。

1.3.2 ELISA法測定血清中細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的含量

分離血清，按照小鼠ELISA試劑盒的操作說明測定血清細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌水平。根據標準曲線計算出相應的含量。

1.3.3 小鼠腹腔巨噬細胞的分離、純化及培養

末次處理后，小鼠頸椎脫臼處死，75%乙醇中浸泡3～5 min，取出小鼠，至于無菌培養皿中，腹腔注入5 mL預冷的DMEM培養基，用棉球輕揉腹部2～3 min后吸出腹腔液置于離心管中，重復3 次，收集以上培養基，1 500 r/min離心5 min，棄上清液，收集巨噬細胞，用含體積分數10%胎牛血清的DMEM培養基重懸巨噬細胞并接種于培養瓶中，置于CO2培養箱（5% CO2、37 ℃）培養24 h后，輕輕吸棄培養液，用DMEM培養基洗去未貼壁細胞，重復洗滌2 次，即得到純化的腹腔巨噬細胞。

1.3.4 流式細胞儀檢測巨噬細胞表面MR的表達

按上述方法制備純化的腹腔巨噬細胞，1 500 r/min離心5 min，棄去上清液，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌2 次，加100 μL PBS重懸細胞，加入FITC標記的大鼠抗小鼠CD206抗體10 μL，4 ℃避光孵育30 min。孵育結束后，用PBS洗2次，去除游離的抗體，重懸細胞成單個細胞懸液。流式細胞儀檢測巨噬細胞表面MR的表達，記錄各標本的陽性細胞百分率，陽性細胞百分率反映細胞群體中被FITC標記的MR抗體的陽性細胞數量所占總細胞數的百分比，陽性細胞百分率越大，表明被FITC標記的MR抗體的陽性細胞數量越多。

1.3.5 FITC-dextran測定巨噬細胞吞噬功能

按上述方法制備純化的腹腔巨噬細胞，1500 r/min離心5 min，棄去上清液，并以PBS洗滌2 次，加100 μL PBS重懸細胞，加入FITC-dextran（1 mg/mL）10 μL，37 ℃繼續孵育1 h。用預冷的含2%胎牛血清的PBS終止反應，洗滌細胞2 次，并重懸細胞。流式細胞儀分析細胞對FITC-dextran的吞噬作用。

1.3.6 流式細胞儀檢測巨噬細胞ROS生成

按上述方法制備純化的腹腔巨噬細胞，約2.0×105～5.0×105個，然后用PBS洗2 遍，1 500 r/min離心5 min。以1∶1000的比例用無血清培養基稀釋DCFH-DA，每個細胞樣品加入500 μL稀釋后的DCFH-DA溶液進行重懸細胞，置于37 ℃培養箱內孵育20～30 min，1 500 r/min離心5 min，棄上清液，并用PBS洗3 次以充分除去未進入細胞內的DCFH-DA，立即用流式細胞儀進行檢測，測定細胞內DCF的熒光強度，以DCF的熒光強度來反映細胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）的含量。

1.4 數據分析

2 結果與分析

2.1 PSG-1對炎癥模型小鼠體質量的影響

本實驗通過PSG-1預處理6 d，第7天一次性注射LPS建立體內炎癥模型，觀察PSG-1對小鼠炎癥的影響。在實驗進程中的第1～6天，小鼠每天給予PSG-1或生理鹽水處理，觀察顯示小鼠進食、活動、糞便等一般情況正常，毛發光亮。每天稱體質量結果如圖1所示，小鼠體質量呈逐漸上升趨勢，統計學分析結果顯示小鼠各組之間體質量無顯著性差異。第7天小鼠正常對照組給予等量的生理鹽水，其余各組腹腔注射LPS，1 h后給小鼠稱質量，并頸椎脫臼處死，取樣。處死小鼠前體表觀察結果顯示，正常對照組中和PSG組中小鼠毛發光亮，LPS組中小鼠均出現不同程度的脫毛狀況，并且在解剖小鼠時發現小鼠有腹瀉的情況。

圖1 PSG-1對炎癥模型小鼠體質量的影響Fig. 1 Effect of PSG-1 on body weight of mice

2.2 PSG-1對小鼠腹腔巨噬細胞表面MR表達的影響

使用FITC-大鼠抗小鼠CD206抗體對巨噬細胞表面MR進行標記，流式細胞儀檢測陽性細胞率以反映PSG-1對小鼠腹腔巨噬細胞表面MR表達的影響。如圖2所示，與正常對照組相比，LPS組的腹腔巨噬細胞表面MR的表達量由17.17%顯著減少到12.39%（P＜0.05），而小鼠灌胃PSG-1后，細胞表面MR表達呈劑量依賴性增加，與LPS模型組相比差異極顯著（P＜0.01）。表明PSG-1可上調LPS誘導的炎癥模型小鼠腹腔巨噬細胞表面MR的表達。

圖2 PSG-1對小鼠腹腔巨噬細胞表面MR表達的影響Fig. 2 Effect of PSG-1 on MR expression on the surface of mice peritoneal macrophages

2.3 PSG-1對炎癥模型小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響

處于炎癥環境中的巨噬細胞可以通過胞吞作用來清除死亡的細胞。巨噬細胞的吞噬能力是衡量機體非特異性免疫功能的一個重要指標。本研究采用流式細胞儀檢測PSG-1對炎癥模型小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響。如圖3所示，與正常對照組相比，小鼠經LPS刺激后腹腔巨噬細胞的吞噬能力顯著增加（P＜0.05）；而小鼠灌胃PSG-1后，腹腔巨噬細胞的吞噬功能較LPS組顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）。提示PSG-1抑制炎性環境中巨噬細胞的吞噬能力，減少炎癥刺激引起的機體損傷，調節機體的免疫力。

圖3 PSG-1對炎癥模型小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響Fig. 3 Effect of PSG-1 on the phagocytosis of FITC-dextran by mice peritoneal macrophages

2.4 PSG-1對巨噬細胞ROS生成的影響

圖4 PSG-1對巨噬細胞ROS生成的影響Fig. 4 Effect of PSG-1 on ROS generation in mice peritoneal macrophages

研究表明[11-12]，ROS在炎癥反應的發生、發展中起重要作用。在炎癥反應中，炎癥部位活化的炎性細胞發生呼吸爆發，產生O2－·等活性氧自由基。如果這些ROS自由基過度產生就會使組織細胞壞死、溶解、凋亡，導致嚴重的組織損害，加重炎性反應。因此阻斷ROS自由基的合成和釋放可起一定的抗炎作用。本研究對炎癥小鼠腹腔巨噬細胞的ROS進行了測定，通過檢測DCF熒光強度分析細胞中ROS的水平，如圖4所示，LPS組的ROS含量為62.62，與正常對照組相比極顯著升高（P＜0.01）；與LPS組相比，小鼠灌胃PSG-1后ROS含量均極顯著降低（P＜0.01）。表明PSG-1可能抑制LPS誘導的小鼠腹腔巨噬細胞ROS的生成。

2.5 PSG-1對炎癥模型小鼠血清分泌TNF-α、IL-1β、IL-6的影響

TNF-α是一種重要的炎癥因子，研究發現TNF-α直接參與炎癥的病理生理過程。TNF-α具有很強的炎癥損傷作用，在機體內是最強炎癥介質之一[13]，具有對其他參與炎癥反應過程中的炎性因子如IL-6和IL-1β等的誘生、協調和調節作用。因此，通過對TNF-α的抑制能夠有效抑制炎癥的發生和發展[14]。本實驗通過ELISA法檢測TNF-α的分泌水平，結果顯示（表1），與正常對照組相比，LPS組血清中TNF-α含量均極顯著增加（P＜0.01）；與LPS組相比，小鼠灌胃PSG-1后，高劑量組TNF-α的含量顯著降低（P＜0.05）。IL-6和IL-1β實驗結果顯示（表1），與正常對照組相比，LPS組血清中IL-1β和IL-6的含量均極顯著增加（P＜0.01）；與LPS組相比，小鼠灌胃PSG-1后，IL-1β和IL-6的含量并無顯著降低（P＞0.05）。表明PSG-1可部分抑制LPS介導的炎癥反應，降低小鼠分泌細胞因子TNF-α的水平，調控小鼠的機體免疫力。

表1 PSG-1對炎癥模型小鼠血清分泌TNF-α、IL-1β、IL-6的影響Table 1 Effect of PSG-1 on the secretion of TNF-α, IL-1βand IL-6 in serum of mice

3 討 論

炎癥是機體對于內在和外在刺激的一種防御反應，是一種十分常見而又重要的基本病理學過程，和許多疾病的發生和發展都有直接關聯[15]。巨噬細胞作為機體質量要的免疫細胞，具有可塑性和異質性，在炎癥反應中發揮重要的調控作用[16]。在體內外不同微環境的影響下，巨噬細胞可分化為不同表型并表現出功能上的差異，這種現象稱為巨噬細胞的極化[17]。在不同環境的刺激下，巨噬細胞可極化為M1型和M2型巨噬細胞。在炎癥環境中，巨噬細胞主要表現為M1型。LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁的組成成分，為免疫細胞的強烈激活物，可介導機體的炎癥反應[18-19]。已證實小鼠腹腔巨噬細胞可被LPS誘導生成M1型巨噬細胞[20]，介導急性促炎反應，且表現為分泌大量的促炎細胞因子如IL-12、TNF-α、IL-1β、IL-6和趨化因子，促進ROS大量釋放，增強巨噬細胞的吞噬功能，調節并促進1型輔助性T淋巴細胞（Th1型）免疫[21-22]。本實驗通過小鼠腹腔注射LPS建立小鼠體內炎癥模型，結果發現經LPS刺激小鼠腹腔，腹腔巨噬細胞的吞噬能力增強，ROS和細胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）水平升高。實驗結果與前人研究[20]一致，LPS刺激小鼠后，小鼠腹腔巨噬細胞呈現M1型。同時，灌胃PSG-1之后，PSG-1可降低小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬能力、ROS水平和細胞因子TNF-α的分泌，且具有統計學意義。表明PSG可抑制巨噬細胞向M1型極化，具有抗炎作用。

研究發現多糖主要通過與細胞表面PRR的相結合而介導免疫細胞發揮免疫調節作用[23]。MR屬于C型凝集素樣受體，主要表達在巨噬細胞、樹突狀細胞和腎間質細胞等多種細胞[24]，可識別以D-甘露糖、L-巖藻糖和N-乙酰葡萄糖胺等糖殘基為末端的糖類物質[6,25]。PSG-1主要是由甘露糖、半乳糖和葡萄糖組成的雜多糖。體外實驗發現MR參與了PSG-1對小鼠腹腔巨噬細胞的免疫調節作用[10]。林志輝[26]研究證實在LPS誘導的小鼠急性肺損傷的體內炎癥模型中，MR的表達水平顯著下調。林志輝[26]和Xu Xuanli[27]等研究發現，促進MR的上調可通過NF-κB信號通路抑制LPS介導的巨噬細胞炎癥反應。在此基礎上，本研究進一步檢測了小鼠腹腔巨噬細胞中MR的表達情況。與前人研究結果相似，本實驗結果顯示小鼠腹腔注射LPS刺激的炎性狀態下，巨噬細胞MR的表達下調，但是同時灌胃PSG-1可顯著增加MR的表達。

在炎癥狀態下，MR抑制炎性因子的釋放，調控Th1/Th2型細胞因子的極化分布抑制炎癥反應。在參與炎癥反應的眾多因子中，炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6與內毒素休克的發病與致死具有密切關聯[28]。本實驗通過ELISA法檢測TNF-α的分泌水平，結果顯示，與正常對照組相比，LPS組血清中TNF-α含量均極顯著增加（P＜0.01）；與LPS組相比，小鼠灌胃高劑量PSG-1后，TNF-α的含量顯著降低（P＜0.05）。與正常對照組相比，LPS組血清中IL-1β和IL-6的含量均極顯著增加（P＜0.01）；而小鼠灌胃PSG-1后IL-1β和IL-6的含量無顯著性差異（P＞0.05）。說明經LPS刺激后，促進小鼠腹腔巨噬細胞TNF-α、IL-1β和IL-6產生，加重機體的炎癥反應；而PSG-1部分抑制了LPS誘導的炎癥反應。MR被證實是在M2型巨噬細胞中高表達，促進2型輔助性T淋巴細胞（Th2）免疫[29]，經由信號轉導因子及轉錄活化因子（signal transducer and activators of transcription，STAT）6信號重塑巨噬細胞，促使炎癥因子的合成被抑制，在血管生成、抗炎因子分泌等方面起到重要作用[30]。綜合本實驗結果說明MR參與了PSG-1的抗炎作用，其機理與其抑制巨噬細胞向M1型極化，促進巨噬細胞向M2極化有關。

綜上所述，本實驗通過腹腔注射LPS建立體內炎癥模型，研究PSG體內抗炎活性及對甘露糖受體表達的影響，發現在體內炎癥狀態下PSG-1抑制MR表達下調，促進MR的進一步表達。PSG-1的抗炎機理與其抑制巨噬細胞向M1型極化，促進巨噬細胞向M2型極化有關。在以后的研究中，可以從巨噬細胞極化出發，進一步探討PSG對極化相關信號通路的調控及機制研究。

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In Vivo Anti-Inflammatory Activity of a Polysaccharide from Ganoderma atrum and Its Effect on Mannose Receptor Expression

ZHANG Yansong, LI Wenjuan, TANG Xiaofang, NIE Shaoping, XIE Mingyong*
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Objective: To explore the in vivo anti-inflammatory activity of a water-soluble polysaccharide purified from Ganoderma atrum, named PSG-1, and its effect on mannose receptor (MR) expression. Methods: In the present study, lipopolysaccharide (LPS) via intraperitoneal injection was applied to establish a mouse model of inflammation. Mice were randomly divided into five groups: control group, LPS group, high-dose PSG-1 (100 mg/(kg·d)) + LPS group, mediumdose PSG-1 (50 mg/(kg·d)) + LPS group and low-dose PSG-1 (25 mg/(kg·d)) + LPS group. MR expression, phagocytosis and the level of reactive oxygen species (ROS) in macrophages were analyzed by flow cytometry. The levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β) and interleukin-6 (IL-6) in serum were determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results: Compared with the control group, MR expression on the macrophage surface was decreased in the LPS group. In contrast, MR expression on the macrophage surface was significantly increased in the PSG-1 + LPS group in comparison with the LPS group (P ＜ 0.01). Macrophage phagocytosis and the level of ROS in the LPS group were higher than in the control group, which were significantly decreased after administration of PSG-1 (P＜0.05, P＜0.01). After mice were administrated with LPS, the levels of TNF-α, IL-1β and IL-6 were significantly increased in serum in comparison with the control group (P ＜ 0.01). Compared with the LPS group, the expression level of TNF-α was significantly decreased after administration of high-dose PSG-1 (P ＜ 0.05), but the expression levels of IL-1β and IL-6 did not significantly change. Conclusion: PSG-1 had an anti-inflammatory effect, being able to partly suppress inflammation induced by LPS in vivo, by promoting MR expression on the peritoneal macrophage surface in mice and suppressing macrophage polarization to M1 phenotype.

2016-05-27

國家自然科學基金地區科學基金項目（31560460）；江西省科技廳自然科學基金項目（20151512041185）；食品科學與技術國家重點實驗室項目（SKLF-QN-201509）

張妍淞（1992—），女，碩士研究生，研究方向為食品科學與工程。E-mail：1540136365@qq.com

*通信作者：謝明勇（1957—），男，教授，博士，研究方向為食品化學、食品營養與安全。E-mail：myxie@ncu.edu.cn

10.7506/spkx1002-6630-201713028

TS201.4

A

1002-6630（2017）13-0167-07

張妍淞, 李文娟, 湯小芳, 等. 黑靈芝多糖體內抗炎活性及對甘露糖受體表達的影響[J]. 食品科學, 2017, 38(13): 167-173. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201713028. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Yansong, LI Wenjuan, TANG Xiaofang, et al. In vivo anti-inflammatory activity of a polysaccharide from Ganoderma atrum and its effect on mannose receptor expression[J]. Food Science, 2017, 38(13): 167-173. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201713028. http://www.spkx.net.cn