Ang Ⅱ誘導人臍靜脈內皮細胞建立高血壓損傷模型

劉國艷，孫貝貝，張 潔，于蘇寧，蔣棟磊，方維明，徐 鑫*（揚州大學食品科學與工程學院，江蘇 揚州 225127）

Ang Ⅱ誘導人臍靜脈內皮細胞建立高血壓損傷模型

劉國艷，孫貝貝，張 潔，于蘇寧，蔣棟磊，方維明，徐 鑫*
（揚州大學食品科學與工程學院，江蘇 揚州 225127）

目的：采用高血壓發病因子血管緊張素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ）誘導人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）建立高血壓損傷模型。方法：使用不同濃度（0.01、0.10、1.00 μmol/L和10.00 μmol/L）Ang Ⅱ誘導HUVECs不同時間（3、6、9、12 h和24 h），通過考察HUVECs形態、活性、功能、微觀結構及凋亡程度來評價HUVECs損傷程度，同時采用交叉設計方差分析和多重比較方法得到Ang Ⅱ最適誘導濃度和最佳誘導時間。結果：Ang Ⅱ呈濃度依賴式誘導HUVECs損傷，最佳誘導條件為1.00 μmol/L Ang Ⅱ誘導12 h，此時HUVECs活性為44.85%、NO含量為43.57 μmol/L、總一氧化氮合酶活力為6.99 U/mg pro、內皮型一氧化氮合酶活力為1.89 U/mg pro、丙二醛含量為7.46 nmol/mL、超氧化物歧化酶活力為27.29 U/mg pro、細胞凋亡率為41.5%，微觀結構顯示核膜皺縮，核仁消失，胞漿內出現大量空泡狀結構，線粒體或細小或腫脹，粗面內質網擴張數目較少，部分核糖體丟失，平面內質網擴張，但細胞未解體，仍然保持細胞結構。結論：1.00 μmol/L Ang Ⅱ誘導12 h可以成功誘導HUVECs建立高血壓損傷模型。

血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ）；人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）；高血壓；細胞模型

血管內皮細胞受損是引起高血壓等心血管疾病的重要原因，其受損程度與高血壓的嚴重程度呈正相關[1]。細胞受損后會導致其分泌功能發生變化，如血管通透性增加、血管收縮因子增加舒張因子降低，導致血管壓力增加，形成高血壓。高血壓又進一步引起內皮細胞損傷，形成惡性循環[2]。目前治療高血壓的化學合成類藥物雖效果明顯，但存在諸多副作用，因此天然、安全、無副作用的食品功能因子用于干預血壓調節是未來發展趨勢。Jorge[3]、Jung[4]、Zhang Xiwen[5]和Mladěnka等[6]研究表明食品功能因子具有舒張血管、降低血壓的作用。現今食品功能因子干預血壓調節的研究手段主要有動物模型[7-9]和細胞模型[10-11]，細胞模型因具有操作簡便、周期短、體系相對單純等優點而成為研究各種疾病的首選。

人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）與血管內皮細胞有相似的生物學特征，接近人體生理狀態，無種屬差異、取材容易、來源豐富且符合倫理性[12]，被國內外研究者廣泛用于建立模擬高血壓損傷的細胞模型[13-15]。但有關HUVECs高血壓損傷模型尚鮮見系統性研究報道，在模型誘導劑的濃度、時間及模型評價指標的選取上缺乏量化標準和科學依據。本研究根據存在的問題完善現有的模型，針對腎素-血管緊張素-醛固酮系統（renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS）引起的高血壓，選用血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，Ang Ⅱ）作為誘導劑，篩選誘導劑濃度、誘導時間，從細胞數量、微觀結構、凋亡程度及與高血壓相關的功能因子等方面多角度、多指標的綜合評價HUVECs高血壓損傷模型，以期為食品功能因子干預血壓調節的評價及篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HUVECs 南京凱基生物科技發展有限公司；胎牛血清 美國Gibco公司；RPMI 1640基礎培養基 美國Sigma公司；胰蛋白酶 美國Amresco公司；Ang Ⅱ美國Anaspec Inc公司；NO、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malonaldehyde，MDA）、一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）試劑盒南京建成生物工程研究所；總蛋白提取試劑盒、增強型BCA蛋白定量試劑盒 南京諾唯贊生物科技有限公司；cell counting kit（CCK）-8試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

3111CO2培養箱、Multiskan FC酶標儀 美國Thermo Scientific公司；BM-37XBC倒置顯微鏡 上海波愛姆光學儀器制造有限公司；T6新世紀紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；CL-22M高速低溫離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；CM100透射電子顯微鏡 荷蘭Philips公司；FACSAria llu流式細胞儀 美國BD公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養

HUVECs用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養液培養，同時加入100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素，培養條件為37 ℃、5% CO2、飽和濕度。細胞傳代采用胰蛋白酶消化法。細胞融合達到80%左右，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌3 次，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶消化液，置于CO2培養箱中2 min后在倒置顯微鏡下觀察細胞收縮程度，當細胞變圓，細胞間間隙變大時加入完全培養基終止消化。用移液管輕輕吹打細胞瓶壁使細胞脫落，形成細胞懸液，收集細胞用于傳代。取前10 代細胞進行實驗。

1.3.2 細胞活力測定

將HUVECs懸液濃度調整至5×104個/mL，接種于96 孔板中，每孔200 μL。培養24 h后換無血清培養基饑餓處理12 h，使細胞同步化。將細胞分為空白組，只加完全培養基；損傷組，分別加入含0.01、0.10、1.00 μmol/L和10.00 μmol/L Ang Ⅱ的培養液組，培養時間為3、6、9、12 h和24 h。達到預定培養時間后，每孔加入10 μL CCK-8溶液， 37 ℃孵育1～4 h后，酶標儀450 nm波長處測量吸光度，每個條件下重復3 個平行，計算細胞活力。

1.3.3 細胞形態觀察

誘導相應的時間后在倒置顯微鏡下觀察各組細胞形態并拍照。

1.3.4 細胞內MDA含量、SOD活力、NOS活力測定

按細胞懸液濃度l×105個/mL接種于6 孔培養板，2 mL，按照1.3.2節的方法，將誘導后的細胞消化收集于離心管中，4 ℃、1 000 r/min離心5 min，棄上清液，PBS洗滌2 次。反復凍融法破碎細胞，提取細胞內容物。將細胞置于離心管中，加1 mL無菌水，放入液氮中3～5 s，立即轉移到冰上，放置30 s左右，室溫解凍，重復3 次。2 000～3 000 r/min離心10 min，收集上清液，即時根據試劑盒說明書分別測定532、450、530 nm波長處的吸光度，即分別代表細胞內MDA含量、SOD活力、NOS活力。1.3.5 培養液中NO含量測定

模型誘導完畢后，無菌離心管收集培養液。2 000～3 000 r/min離心10 min，分裝，即時根據測定試劑盒說明書操作，測定550 nm波長處吸光度。

1.3.6 細胞超微結構觀察

將消化后的細胞用2.5%的戊二醛先固定2 h以上，樣品以1×107個細胞數為宜。PBS清洗3～4 次（15 min/次）；1%鋨酸再固定2 h后，用PBS清洗3～4 次（15 min/次）；用體積分數30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇梯度脫水，每梯度15 min；100%丙酮浸透15 min后，用加入無水硫酸鈉呈飽和狀態的100%丙酮浸透15 min；再分別用丙酮-樹脂混合液（體積比為2∶1）浸透5 h，丙酮-樹脂混合液（體積比為1∶1）浸透過夜，丙酮-樹脂混合液（體積比為2∶1）浸透5 h，純樹脂浸透過夜；最后包埋、磨樣、切片、透射電子顯微鏡下觀察細胞超微結構后拍照。

1.3.7 細胞凋亡程度測定

誘導結束后，收集細胞，按照Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒步驟加入195 μL Annexin V-FITC結合液，輕輕重懸細胞；加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻；加入10 μL的碘化丙啶，混勻；室溫條件下避光放置10～20 min后進行流式細胞儀檢測。

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 Ang Ⅱ對HUVECs活力的影響

細胞活力反映了細胞的損傷程度，是細胞損傷模型的基本考察指標。通過檢測Ang Ⅱ對HUVECs的增殖抑制作用，確定Ang Ⅱ對HUVECs的損傷程度。從圖1可以看出，隨著Ang Ⅱ濃度的增加，細胞活力呈現降低趨勢。0.01 μmol/L Ang Ⅱ對細胞活力影響不顯著，而0.10 μmol/L Ang Ⅱ對細胞活力在誘導6 h時有顯著影響（P＜0.05）。1.00 μmol/L Ang Ⅱ誘導3 h后，相對細胞數量為（58.16±5.90）%，表明HUVECs已經發生極顯著損傷（P＜0.01）；作用6 h后，HUVECs活力極顯著下降（P＜0.01），相對細胞數量為（49.06±2.72）%；隨著誘導時間的延長，Ang Ⅱ對HUVECs的損傷進一步加劇，細胞活力逐漸下降；12 h時相對細胞數量為（44.85±0.98）%，之后下降速率減小。10.00 μmol/L Ang Ⅱ組與1.00 μmol/L Ang Ⅱ組在影響細胞活力上類似。這與Zhang Hong等[16]用1 μmol/L Ang Ⅱ誘導細胞12 h時所得的細胞活力相似。

圖1 不同濃度AngⅡ誘導不同時間對HUVECs活力的影響Fig. 1 Viability of HUVECs induced by different concentration of Ang Ⅱ for different times

2.2 Ang Ⅱ對HUVECs形態變化的影響

圖2 HUVECs倒置顯微鏡圖（10×10）Fig. 2 Inverted phase contrast microscopic images of HUVECs (10 × 10)

Ang Ⅱ對HUVECs作用12h的形態變化如圖2所示，空白組（圖2a）HUVECs貼壁生長，形態為短梭狀或三角形，較為飽滿，大小均一，細胞間緊密連接，界限清晰，呈現出單層“鵝卵石”狀，與報道的健康HUVECs狀態相符合[17]。0.01 μmol/L Ang Ⅱ誘導組（圖2b）與空白組相似；0.10 μmol/L Ang Ⅱ誘導組（圖2c）部分細胞發生收縮、變圓，但數量變化不夠明顯；1.00 μmol/L Ang Ⅱ誘導組（圖2d）細胞收縮、變圓的數量增多，有少量碎片，部分細胞出現拉絲現象；10.00 μmol/L Ang Ⅱ誘導組（圖2e）細胞數量明顯減少，細胞形態不一，部分細胞細胞膜降解，細胞死亡嚴重，可能是由于Ang Ⅱ與其受體結合激活了細胞內的Caspase通路導致細胞死亡，此時多數細胞已發生不可逆損傷[18-19]，不適合建立高血壓損傷模型，故1.00 μmol/L Ang Ⅱ為較為合適的建立模型濃度。

用倒置相差顯微鏡觀察到的細胞形態只是一個宏觀表現，若要進一步判斷細胞的損傷程度，還需觀察細胞的微觀結構，測定相關功能因子的分泌及凋亡程度。

2.3 Ang Ⅱ對HUVECs內MDA含量的影響

圖3 不同濃度AngⅡ誘導不同時間對MDA含量的影響Fig. 3 Effect of Ang Ⅱ concentration and induction time on MDA conte

Ang Ⅱ對HUVECs內MDA的影響如圖3所示。整體來看，隨著誘導劑濃度增加和誘導時間的延長，MDA含量呈增加趨勢。在6～9 h之間，細胞MDA含量逐漸增加，在12 h時，1.00 μmol/L和10.00 μmol/L的Ang Ⅱ誘導后所產生的MDA含量上升速率較快，與空白組有顯著差異（P＜0.05）。細胞內逐漸增加的MDA會破壞細胞膜及線粒體膜結構，誘導細胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量的增加，加劇氧化應激，導致細胞分泌功能紊亂，進一步引起細胞損傷[20]。結合前面所述，10.00 μmol/L Ang Ⅱ不適合建立高血壓損傷模型。根據交叉設計方差分析得出時間F值為99.726，Sig值為0.000；濃度F值為122.173，Sig值為0.000；時間×濃度F值為8.057，Sig值為0.000。主體間效應：濃度＞時間＞時間×濃度。根據多重比較結果為3、6、9、12、24 h之間MDA含量均有顯著性差異。1.00 μmol/L與10.00 μmol/L Ang Ⅱ之間MDA含量沒有顯著性差異，其余濃度組間均有顯著差異（P＜0.05），故選取1.00 μmol/L為最佳誘導濃度，最佳誘導時間為12 h。

2.4 Ang Ⅱ對HUVECs內SOD活力的影響

Ang Ⅱ對HUVECs內SOD活力的影響如圖4所示。隨著誘導劑濃度增加和誘導時間的延長，SOD活力呈下降趨勢。在12 h前的下降速率比12 h后要快，可能是由于后期誘導劑被細胞代謝且細胞本身發揮修復作用。SOD活力的下降導致了細胞內氧化和抗氧化反應失衡[21]，細胞無法及時清除產生的自由基和MDA，導致細胞內蛋白質、DNA及細胞膜損傷嚴重[22]。研究證明SOD活性與高血壓患者的血壓呈負相關[23]，SOD和MDA的聯合測定可以更好地評價細胞模型損傷程度。10.00 μmol/L Ang Ⅱ損傷組SOD活力下降最快，為了防止細胞過度損傷，造成不可逆修復，所以不可選擇10 μmol/L Ang Ⅱ進行誘導。由交叉設計方差分析得時間F值為2.741，Sig值為0.039；濃度F值為10.490，Sig值為0.000；時間×濃度F值為0.338，Sig值為0.990。由多重比較分析得出同一濃度誘導3、6、9、12 h之間細胞中SOD活力均有顯著差異，但同一濃度的12 h與24 h無顯著性差異，說明12 h是細胞內SOD變化減緩的轉折點。在9～12 h之間，從圖4可以看出，濃度為1.00 μmol/L時SOD活力下降速率最大，故1.00 μmol/L為最佳誘導濃度，最佳誘導時間為12 h。

Ⅱ誘導不同時間對HUVECs中SOD活力的影響Fig. 4 Effect of Ang Ⅱ concentrations and induction time on SOD activity圖4 不同濃度Ang

2.5 Ang Ⅱ對HUVECs內NO含量的影響

圖5 不同濃度Ang Ⅱ誘導不同時間對HUVECs中NO生成的影響Fig. 5 Effect of Ang Ⅱ concentration and induction time on NO production

Ang Ⅱ對HUVECs內NO含量的影響如圖5所示。Ang Ⅱ對NO的釋放具有抑制作用，隨著Ang Ⅱ濃度的增加和時間的延長，NO含量呈現下降趨勢。其中0.01 μmol/L和0.10 μmol/L損傷組NO含量下降較為緩慢，而1.00 μmol/L在6～12 h之間下降速率增大。細胞NO釋放量過少，會引起血管收縮，血壓增加，導致高血壓等心腦血管疾病的發生[24]。10.00 μmol/L與1.00 μmol/L損傷組之間NO含量無顯著差異（P＞0.05）。故選擇1.00 μmol/L Ang Ⅱ來建立高血壓損傷模型。NO是內皮損傷模型中最重要的指標，其釋放量還需結合NOS活性來闡明其釋放機理。進行交叉設計方差分析得出時間F值為14.598，Sig值為0.000；濃度F值為68.740，Sig值為0.000；時間×濃度F值為3.392，Sig值為0.000。主體間效應：濃度＞時間＞時間×濃度。進行多重比較分析得3 h與6 h、9 h與12 h、9 h與24 h、12 h與24 h之間均無顯著差異（P＞0.05）。濃度1.00 μmol/L與10.00 μmol/L Ang Ⅱ損傷組之間NO含量沒有顯著差異，其余濃度組間均有顯著性差異，所以選取1.00 μmol/L Ang Ⅱ誘導12 h為最佳誘導條件。

2.6 Ang Ⅱ對HUVECs內NOS活力的影響

圖6 不同濃度Ang Ⅱ誘導不同時間對HUVECs中TNOS（A）和eNOS（B）活力的影響Fig. 6 Effect of Ang Ⅱ concentration and induction time on TNOS (A) and eNOS(B) activity

Ang Ⅱ對HUVECs內NOS含量的影響如圖6所示。隨著Ang Ⅱ濃度增加和誘導時間延長，總一氧化氮合酶（total nitric oxide synthase ，TNOS）和內皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase ，eNOS）活力均呈下降趨勢，且eNOS活力下降較快，高濃度Ang Ⅱ時eNOS活性幾乎喪失。TNOS在6～12 h時下降最快，12 h后下降變緩，且1.00 μmol/L誘導12 h 的TNOS活力與10.00 μmol/L 12 h時沒有顯著性差異（P＞0.05）。而eNOS活力變化與TNOS有相似的趨勢，且下降速率更快，說明高濃度的Ang Ⅱ導致細胞損傷嚴重，對eNOS活力抑制更明顯，而eNOS活力下降直接影響到NO的生成[25]，這與前面NO的生成相互呼應。結合TNOS活力來看，在Ang Ⅱ濃度為1.00 μmol/L誘導時間6～9 h之間時，TNOS活力下降速率最大。同理，對于eNOS的活力，在Ang Ⅱ為1.00 μmol/L誘導時間為9 h時，eNOS的活力下降速率最大。

對于TNOS活力，根據交叉設計方差分析得出時間F值為10.158，Sig值為0.000；濃度F值為24.958，Sig值為0.000；時間×濃度F值為1.926，Sig值為0.040。主體間效應為濃度＞時間＞時間×濃度。進一步進行多重比較發現同一誘導濃度條件下，誘導3 h與6 h、9 h與12 h、9 h與24 h、12 h與24 h之間均無顯著差異，而6 h與9 h之間有顯著差異（P＜0.05）。

對于eNOS活力，交叉設計方差分析得時間F值為28.429，Sig值為0.000；濃度F值為60.934，Sig值為0.000；時間×濃度F值為2.308，Sig值為0.013。主體間效應為濃度＞時間＞時間×濃度。多重比較發現同一誘導濃度條件下，12 h與24 h之間無顯著性差異，其余各誘導時間之間均有顯著性差異。在同一時間條件下，濃度1.00 μmol/L與10.00 μmol/L之間沒有顯著性差異，1.00 μmol/L與0.10、0.01 μmol/L之間均有顯著性差異，所以選取1.00 μmol/L、12 h為最佳誘導條件。

2.7 HUVECs微觀結構的變化

圖7 HUVECs電子顯微鏡圖Fig. 7 Transmission electron microscopic images of HUVECs

空白組（圖7A1、B1）細胞核核膜清晰，核仁完整，細胞器豐富且分布均勻，胞漿內空泡含量較少且小，各細胞器形態正常。而1.00 μmol/L Ang Ⅱ損傷組（圖7A2、B2）核膜皺縮，核仁消失，細胞核變長，邊緣凹陷、不規則，胞漿內出現大量多篩孔樣空泡，線粒體或者細小或者腫脹，粗面內質網擴張數目較少，部分核糖體丟失，平面內質網擴張。當Ang Ⅱ濃度上升到10.00 μmol/L時，由圖7A3、B3可以看到細胞核縮為一小塊，核仁消失，胞漿內空泡嚴重，幾乎將細胞解體，線粒體或腫脹或細長，粗面內質網數量嚴重減少，核糖體嚴重損失，細胞骨架不完整。表明細胞在不同濃度Ang Ⅱ的誘導下出現了不同程度的損傷。

2.8 HUVECs凋亡程度

圖8 HUVECs凋亡圖Fig. 8 Early and late apoptotic cells

圖9 HUVECs流式細胞圖Fig. 9 Flow cytometry scatter plots of HUVECs

由圖8、9可以得出，HUVECs受到Ang Ⅱ刺激后，細胞總凋亡數量明顯增多，其中0.10 μmol/L損傷組凋亡早期細胞數量與空白組相比顯著增加（P＜0.05），1.00 μmol/L損傷組凋亡早期細胞數量與空白組相比極顯著增加（P＜0.01）。10.00 μmol/L損傷組凋亡晚期細胞數量與空白組相比極顯著性增加（P＜0.01）。空白組正常細胞占（81.3±2.0）%，經過0.10、1.00、10.00 μmol/L Ang Ⅱ誘導后，正常細胞數量下降到（72.4±1.1）%、（44.4±0.8）%、（26.9±0.5）%，與空白組均有顯著性差異（P＜0.05）。0.10、1.00、10.00 μmol/L Ang Ⅱ損傷組細胞總凋亡率分別為（14.7±1.2）%、（41.5±1.7）%、（68.6±3.5）%，顯著高于空白組（7.8±1.5）%（P＜0.05）。這直觀地說明Ang Ⅱ能誘導細胞凋亡。本實驗研究結果與楊慧宇等[2]的研究結果相似。

3 討 論

近年研究表明，血管內皮功能障礙是高血壓病的重要病理變化，也是高血壓血管損害的始發因素[26]。而高血壓也可引起內皮細胞功能損害，患高血壓時，由于血流切應力及血流搏動過強刺激血管內皮細胞，造成細胞形態結構的改變和功能的失調，生物活性物質合成、分泌異常，致使內皮依賴性舒張功能減弱和收縮功能增強[27]。該模型的損傷程度與高血壓的嚴重程度呈正相關[28]。內皮細胞損傷后，內皮細胞釋放的很多活性物質如凝血酶、ADP、ATP等舒血管作用變為縮血管作用，從而影響Endothelin-1（ET-1）/NO的協調狀態，破壞了自身調節體系的平衡，使得ET合成增多，影響NO的合成和釋放，導致血管張力調節的紊亂，內皮依賴性舒張功能下降、收縮功能增強，血管壁結構發生變化，導致血壓的升高[29]。而在進行血管內皮細胞實驗時，通常選用的細胞模型為HUVECs，而不是直接采用靜脈血管內皮細胞或動脈血管內皮細胞，原因是臍靜脈血管內皮細胞具有干細胞的功能，理論上可以傳代50～60 次。而且HUVECs與血管內皮細胞有相似的生物學特征，接近人體生理狀態，無種屬差異、取材容易、來源豐富且符合倫理性[30]，所以本實驗選用HUVECs建立高血壓損傷體外模型。

迄今為止，HUVECs高血壓損傷模型還沒有一個統一的評價標準。理想的HUVECs高血壓損傷模型應該可靠、容易定量、操作簡便、符合人體生理環境。但是由于疾病本身具有復雜性，如高血壓可分為輕度、中度及重度，加之高血壓患者容易引起并發癥，故反映在單獨一種細胞模型上，很難滿足所有的條件，導致細胞損傷模型的標準很難判定。體外細胞模型能較好控制實驗過程，且費用低，但條件難以標準化，實驗結果還需進一步的結合體內實驗來驗證。由此可見，許多實驗模型還有待于日后進一步研究和完善，只有借助趨于完善的模型，才能更好地篩選誘導劑的濃度和誘導時間，從而得到更真實、客觀、全面的信息。

綜合已有研究，HUVECs高血壓損傷模型以Ang Ⅱ作為誘導劑成功建立時，誘導劑濃度范圍在0.1～1.0 μmol/L之間，誘導時間在6～24 h之間。根據損傷組各濃度Ang Ⅱ對細胞的形態、活性、功能、微觀結構及凋亡的影響結果，選取Ang Ⅱ 1.00 μmol/L誘導12 h為最佳誘導條件。本實驗中 Ang Ⅱ對細胞的形態、活性及凋亡均有一定的影響，且隨著Ang Ⅱ濃度增加，誘導時間延長，HUVECs損傷程度增加，其中1.00 μmol/L Ang Ⅱ誘導HUVECs 12 h時各項指標與空白組相比均有顯著差異。本實驗選擇1 μmol/L Ang Ⅱ誘導12 h作為成功建立HUVECs高血壓損傷模型的合適誘導劑濃度及時間，建立的HUVECs高血壓損傷模型可以為食品功能因子及藥物干預血壓調節提供方法學參考。

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Establishment of Angiotensin Ⅱ-Induced Model in Human Umbilical Vein Endothelial Cells

LIU Guoyan, SUN Beibei, ZHANG Jie, YU Suning, JIANG Donglei, FANG Weiming, XU Xin*
(College of Food Science and Engineering, Yangzhou University, Yangzhou 225127, China)

Objective: This research was aimed to establish a hypertensive damage model in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) induced by angiotensin (Ang) Ⅱ. Methods: HUVECs were induced with different concentrations (0.01, 0.10, 1.00 and 10.00 μmol/L) of Ang Ⅱ for different times (3, 6, 9, 12 and 24 h), respectively. The injury degree of HUVECs was evaluated by cellular morphology, viability, function, microstructure, and apoptosis. The optimal concentration and time were obtained by using variance analysis and multiple comparison tests. Results: Ang Ⅱ induced injury in HUVECs in a dose- and time-dependent manner. The optimal Ang Ⅱ concentration and induction time were respectively 1.00 μmol/L, and 12 h. After 12 h induction by 1 μmol/L Ang Ⅱ induced, the cell viability was 44.85%, nitric monoxide (NO) content was 43.57 μmol/L, total nitric oxide synthase (TNOS) activity was 6.99 U/mg pro, endothelial nitric oxide synthase (eNOS) activity was 1.89 U/mg pro, malonaldehyde (MDA) content was 7.46 nmol/mL, superoxide dismutase (SOD) activity was 27.29 U/mg pro, and apoptosis percentage was 41.5%. The microstructure showed that the nuclear membrane shrivel and nucleolus disappeared, and a large number of air bubbles appeared inside the cytoplasm. Small and swollen mitochondria, only a small number of expanded rough endoplasmic reticula, partial loss of ribosome, and endoplasmic reticulum expansion were observed, but the cells did not collapse, and still maintained their normal structure. Conclusion: Induction with 1.00 μmol/L Ang Ⅱ for 12 h allows successful establishment of a hypertensive damage model in HUVECs.

angiotensin Ⅱ (Ang Ⅱ); human umbilical vein endothelial cells (HUVECs); hypertension; cell model

10.7506/spkx1002-6630-201713029

TS201.4

A

1002-6630（2017）13-0174-08

2016-05-23

國家自然科學基金面上項目（31471578）

劉國艷（1979—），女，副教授，博士研究生，研究方向為食品營養與安全。E-mail：liugy@yzu.edu.cn

*通信作者：徐鑫（1977—），男，教授，博士，研究方向為食品營養與安全。E-mail：xuxin@yzu.edu.cn

劉國艷, 孫貝貝, 張潔, 等. Ang Ⅱ誘導人臍靜脈內皮細胞建立高血壓損傷模型[J]. 食品科學, 2017, 38(13): 174-181.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201713029. http://www.spkx.net.cn

LIU Guoyan, SUN Beibei, ZANG Jie, et al. Establishment of angiotensin Ⅱ-induced model in human umbilical vein endothelial cells[J]. Food Science, 2017, 38(13): 174-181. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201713029. http://www.spkx.net.cn