文蛤寡肽對小鼠急性肝損傷的保護作用

王佳佳，趙莎莎，楊最素*，余方苗，丁國芳（浙江海洋大學食品與醫藥學院，浙江省海洋生物醫用制品工程技術研究中心，浙江 舟山 316022）

文蛤寡肽對小鼠急性肝損傷的保護作用

王佳佳，趙莎莎，楊最素*，余方苗，丁國芳
（浙江海洋大學食品與醫藥學院，浙江省海洋生物醫用制品工程技術研究中心，浙江 舟山 316022）

對文蛤寡肽（Meretrix meretrix oligopeptides，MMO）在小鼠急性肝損傷中的保護作用進行研究。首先通過酶解、超濾、Sephadex G-25柱分離技術從文蛤中分離純化出具有肝修復作用的文蛤寡肽，經檢測該目標肽的氨基酸序列為Gln-Leu-Asn-Trp-Asp。然后建立四氯化碳（CCl4）致小鼠急性肝損傷模型，測定小鼠肝臟指數；檢測小鼠血清谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、γ-谷氨酰轉移酶（γ-glutamyltransferase，γ-GT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力及甘油三酯（triglyceride，TG）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平；蘇木精-伊紅染色觀察肝臟病理學改變；免疫組化法測定肝組織TNF-α、NF-κB蛋白表達量。結果表明：MMO組與模型組比較，小鼠肝指數顯著降低（P＜0.05）；血清中ALT、AST、γ-GT活力顯著降低（P＜0.05），γ-GT活力最高降幅達到47.16%；SOD活力顯著升高（P＜0.05）；TG、MDA水平顯著降低（P＜0.05），最高降幅分別達到31.88%和28.83%。；蘇木精-伊紅染色觀察肝組織結構明顯好轉；TNF-α、NF-κB蛋白表達量顯著降低。因此，MMO對CCl4小鼠急性肝損傷有較為明顯的保護作用。

文蛤寡肽；四氯化碳；急性肝損傷

文蛤（Meretrix meretrix）俗稱蛤蜊，屬于軟體動物門、雙殼綱、真瓣鰓目、簾蛤科文蛤屬，是我國重要的海洋貝類之一，主要產區在遼寧、河北、山東、江蘇沿海[1]。文蛤肉鮮，營養豐富，含有人體必需的各種氨基酸、礦物質、維生素和其他重要物質[2]。近年來研究表明文蛤有重要的藥用價值，在抗腫瘤[3]、抗氧化[4-5]和提高免疫力[6]等方面表現出顯著的功效，是一種極具開發潛力的海洋藥物來源。如文蛤多肽Mere15具有較好的廣譜抗癌活性，但對正常細胞卻沒有明顯的抑制作用，對人肺癌移植瘤具有顯著的抑制作用[1]。本實驗室前期研究表明，文蛤內臟經酶解獲得的分子質量為674.6 D，氨基酸序列為Gln-Leu-Asn-Trp-Asp的文蛤寡肽（Meretrix meretrix oligopeptides，MMO），作用于經軟脂酸誘導正常肝Chang liver細胞建立的非酒精性脂肪性肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）細胞模型后，能使NAFLD細胞模型中的丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）和γ-谷氨酰轉移酶（γ-glutamyltransferase，γ-GT）活力下降，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽-S轉移酶的活力上升，對NAFLD細胞模型具有明顯的修復作用。而MMO是否能修復經四氯化碳（CCl4）誘導的小鼠急性肝損傷，改善肝的病理結構變化和肝功能相關檢測指標，目前鮮見報道。因此本實驗通過建立小鼠急性肝損傷模型，經灌胃給藥途徑，探討MMO對小鼠急性肝損傷模型的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料、實驗動物與試劑

文蛤，購于浙江省舟山市定海南珍菜場。

動物用清潔級雄性ICR小鼠30只，體質量（20±2）g，購于浙江省實驗動物中心（動物生產許可證號：SCXK（浙）2015-0001，飼養于浙江海洋大學動物房。

文蛤寡肽，本實驗室自制；CCl4、二甲苯、乙醇國藥集團化學試劑有限公司；植物油 西王集團；聯苯雙酯滴丸 浙江萬邦藥業公司；多聚賴氨酸、伊紅 美國Sigma公司；ALT、AST、甘油三酯（triglyceride，TG）、γ-GT、MDA、SOD試劑盒及蘇木精染液 南京建成生物工程公司；TNF-α、NF-κB抗體、山羊抗兔IgG/HRP聚合物（二抗）、DAB顯色試劑盒北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

CF16RXⅡ型高速低溫離心機 日本日立公司；Cogent mScale超濾系統 默克密理博公司；752FC紫外分光光度計 上海光譜儀器有限公司；RM2135切片機、HI1210攤片機、H1220烤片機 Leica（萊卡）公司；光學顯微鏡、CCD-NC6051顯微攝像 日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 文蛤寡肽的提取

新鮮文蛤經洗凈、去殼、取內臟，并用0.1 mol/L的NaOH溶液浸泡去脂，于蒸餾水中輕輕攪拌去雜質，調制中性，勻漿。選用堿性蛋白酶，以料液比1∶2于40 ℃，pH值為9.5的條件下酶解8 h。然后將得到的文蛤酶解液進行超濾，取分子質量小于5 kD的分子段產物。將小于5 kD酶解液過Sephadex G-25柱進行層析分離，收集各管洗脫液于280 nm波長處測定吸光度，收集峰Ⅰ，冷凍干燥。經檢測該目標肽序列為Gln-Leu-Asn-Trp-Asp，命名為MMO。冷凍干燥后于4 ℃冰箱保存備用。

1.3.2 CCl4誘導肝損傷小鼠分組

將30 只成年雄性小鼠隨機分組，每組6 只，分為正常組、模型組、聯苯雙酯滴丸陽性藥物組（200 mg/kg）、MMO低劑量組（50 mg/kg）、MMO高劑量組（100 mg/kg），均以體質量計。在造模前對小鼠進行預防灌胃給藥，連續7 d[7]（正常組與模型組給予等量蒸餾水），第7天末次灌胃2 h后，除正常組小鼠外其他小鼠按照0.1 mL/10 g的劑量腹腔注射含有0.5% CCl4的花生油，造成小鼠急性肝損傷。造模結束后小鼠禁食不禁水，16 h后對各組小鼠稱質量，摘眼球取血，4 ℃條件下4 000 r/min離心10 min，取血清，用于生化測定，采血后頸椎脫臼處死小鼠后取肝臟，用4 ℃預冷生理鹽水沖凈表面浮血，濾紙拭干，稱質量，觀察小鼠肝臟的形態后－80 ℃保存。

1.3.3 小鼠肝臟指數的計算及血清中各項生化指標的測定

血液離心后取上清液，按試劑盒說明書操作步驟進行ALT、AST、γ-GT、SOD活力、TG、MDA含量各項生化指標的測定。

1.3.4 組織病理學HE染色觀察

取小鼠肝臟1 cm3左右，立即放入4%多聚甲醛溶液，固定24 h后，常規石蠟包埋后，制備5 μm厚切片，按照蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色順序，中性樹膠封片且光鏡下觀察肝組織病理變化。

1.3.5 免疫組化法檢測TNF-α、NF-κB蛋白的表達

將小鼠肝臟切片常規脫蠟至水；內源性過氧化物酶阻斷劑室溫作用10 min；微波爐抗原修復，冷卻后磷酸鹽溶液洗滌2×5 min/次；滴加封閉用正常山羊血清工作液，室溫作用20 min，甩去多余液體；分別滴加適量稀釋的一抗（1∶300），4 ℃孵育過夜，磷酸鹽溶液洗3×5 min/次；滴加二抗，室溫孵育20 min；滴加適量HRP標記的鏈霉親和素, 室溫孵育20 min；DAB顯色，鏡下控制時間，自來水沖洗；蘇木素復染5 min，乙醇梯度脫水，二甲苯透明后中性樹膠封片。顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 數據處理

實驗數據使用SPSS 18.0統計軟件分析處理，實驗結果以±s表示，且以P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 小鼠肝臟形態觀察

圖1 小鼠肝臟Fig. 1 Liver tissues of mice

由圖1可以看出，正常組小鼠肝臟體積較小呈暗紅色，肝臟色澤鮮亮（圖中均未顯示顏色），紋理致密，質地中等有彈性；模型組肝臟顏色呈現不正常的乳白色，體積增大，且肝臟表面可見乳白色的顆粒狀物體，肝臟質地較硬彈性差；陽性藥物組小鼠肝臟形態正常組差別不大；MMO藥物處理組肝臟顏色比模型組深，色澤比較鮮亮，且高劑量組更加明顯。說明MMO對急性肝損傷具有一定的修復作用。

2.2 MMO對小鼠肝臟指數的影響

由表1可得出，MMO低、高劑量組與陽性藥物組均可使小鼠體質量增加，其中高劑量組體質量高于陽性藥物組，達到（33.46±1.31）g，與模型組差異顯著（P＜0.05）。CCl4模型組比正常組的肝臟指數顯著增加，說明CCl4造成小鼠肝臟腫大。與模型組比較，陽性藥物組與MMO高劑量組小鼠肝指數均顯著降低（P＜0.05）。

表1 MMO對小鼠肝臟指數的影響（±s，n=6）Table 1 Effect of MMO on liver index in mice with liver injury induced by CCl4(s,n= 6)

表1 MMO對小鼠肝臟指數的影響（±s，n=6）Table 1 Effect of MMO on liver index in mice with liver injury induced by CCl4(s,n= 6)

注：*.與模型組比較，差異顯著（P＜0.05）。下同。

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2.3 MMO對小鼠血清ALT、AST活力的影響

表2 MMO對小鼠血清ALT、AST活力的影響（s，n=6）Table 2 Effect of MMO on serum ALT and AST activities in mice with liver injury induced by CCl (s,n= 6) 4

表2 MMO對小鼠血清ALT、AST活力的影響（s，n=6）Table 2 Effect of MMO on serum ALT and AST activities in mice with liver injury induced by CCl (s,n= 6) 4

注：#.與正常組比較，差異顯著（P＜0.05）。下同。

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由表2可得出，與正常組比較，模型組小鼠ALT、AST活力均顯著升高，分別達到394.89 U/L和1 410.66 U/L。MMO各劑量組和陽性藥物組均可降低ALT、AST活力，且以AST高劑量組最為顯著，抑制率達到33.04%（P＜0.05）。MMO低劑量組ALT、AST活力低于模型組，但高于MMO高劑量組。說明隨著MMO水平的增加，小鼠血清中ALT、AST活力逐漸降低，呈現明顯的劑量相關性。

2.4 MMO對小鼠血清γ-GT、SOD活力及MDA、TG含量的影響

表3 MMO對小鼠血清γ-GT、SOD活力及MDA、TG含量的影響（，n=6）Table 3 Effect of MMO on serum γ-GT and SOD activities and MDA and TG contents in mice with liver injury induced by CCls,n= 6) 4

表3 MMO對小鼠血清γ-GT、SOD活力及MDA、TG含量的影響（，n=6）Table 3 Effect of MMO on serum γ-GT and SOD activities and MDA and TG contents in mice with liver injury induced by CCls,n= 6) 4

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由表3可得出，模型組與正常組比較，γ-GT水平達到正常組7 倍。MMO低、高劑量、陽性藥物組與模型組比較γ-GT活力顯著降低（P＜0.05），MMO高劑量組降幅達到47.16%。與正常組比較，模型組SOD活力顯著降低，降幅達到42.86%。MMO低、高劑量組與模型組比較，SOD活力顯著升高，但MMO高劑量組與陽性藥物組效果更為顯著（P＜0.05）。模型組MDA、TG含量升高到正常組的2 倍，MMO低、高劑量組與陽性藥物組均使MDA含量顯著降低（P＜0.05），其中MMO高劑量組與陽性藥物組呈現更加顯著性的差異（P＜0.05），相對低劑量組，MMO高劑量組MDA、TG含量降幅更加明顯，分別達到了28.83%和31.88%。

2.5 MMO對小鼠肝組織的病理學影響

圖2 小鼠肝組織HE染色（×200）Fig. 2 Observation of liver slices from mice by HE staining (× 200)

由圖2可看出，HE染色后光鏡下觀察，正常組小鼠肝小葉結構清晰，肝索排列整齊，呈放射狀，肝細胞形態規則，細胞質嗜酸性，核結構清晰。模型組肝小葉紊亂，肝索斷裂，細胞形態大小不一，肝細胞嗜酸性減弱，出現大量空泡，細胞核聚縮邊緣化，呈現中央型壞死并且肝血竇狹窄。陽性藥物組肝小葉結構完整，無變性壞死，幾乎沒有空泡細胞，細胞整體趨于正常。MMO低劑量組肝索比模型組較完整，細胞質內空泡減少，細胞核聚縮邊緣化有所減少，但組織受損仍較為嚴重。MMO高劑量組肝組織修復效果比較明顯，肝索放射狀排列清楚，空泡數量減少，細胞核形態正常。

2.6 免疫組化法檢測TNF-α、NF-κB蛋白的表達

圖3 小鼠肝組織TNF-α表達情況（×200）Fig. 3 Microscopic observation of the expression of TNF-α in liver tissue (× 200)

圖4 小鼠肝組織NF-κB表達情況（×200）Fig. 4 Microscopic observation of the expression of NF-κB in liver tissue (× 200)

免疫組化法在肝細胞質內顯示棕黃色顆粒（淡灰色部分）為TNF-α、NF-κB蛋白表達陽性部位。正常組小鼠肝組織中幾乎沒有TNF-α、NF-κB陽性表達（圖3A、圖4A）；而模型組中TNF-α、NF-κB陽性表達明顯，呈較深的棕黃色，呈現局灶性的彌漫性分布，主要分布在中央靜脈的周圍（圖3B、圖4B）；陽性藥物組中兩種蛋白的陽性表達部位較少，只存在于中央靜脈周圍的少量肝細胞中，并且顏色較淺（圖3C、圖4C）；MMO低劑量組陽性表達部位在中央靜脈周圍的肝細胞中，也呈現局灶性的彌漫性分布，但顏色比模型組淺（圖3D、圖4D）；高劑量組的陽性表達明顯減少，與陽性藥物組的表達部位無明顯差異（圖3E、圖4E）。說明MMO可降低TNF-α、NF-κB蛋白表達量，且呈劑量相關性。

3 討 論

隨著人們生活水平的提高以及膳食結構的改變，肝臟疾病成為影響人類健康嚴重問題之一，世界上每年約有100萬患者死于肝病，其中亞太地區肝病患者約占全球總數的一半，我國更是肝病高發地區[8]。從海洋生物中提取護肝保肝活性物質是開發藥源的重要途徑，其中海洋肽類藥物具有分子質量小、結構簡單、副作用小、無免疫原性、活性高等優點而成為學者們研究的熱點。CCl4是一種廣泛用于評估保肝作用的藥物和植物提取物的肝毒性劑，它能夠使小鼠肝臟腫大，肝指數升高[9-10]。當肝細胞損傷時，細胞膜通透性增加，存在于肝細胞質內的AST和ALT會滲入血液，因此血清中這兩種酶活性增高反映出肝細胞損害的程度[11-12]。本實驗模型組AST、ALT活力顯著高于正常組，AST水平高于ALT，說明肝細胞損傷、壞死的程度比較嚴重[13]，而MMO各劑量組AST、ALT活力下降，表明MMO對肝損傷有較好的修復作用。

活性氧自由基是生物體氧化還原反應的代謝產物，體內氧自由基的產生和清除在正常生理情況下一般保持平衡狀態，否則會給機體造成損害。SOD是體內重要的自由基清除劑，在肝細胞受到自由基攻擊時，作為機體的保護性機制，肝臟內SOD會因其耗竭而減少[14-16]。MDA是脂質過氧化的產物，可與生物大分子結合形成加醛復合物，進一步破壞細胞膜的結構和功能，其含量反映了組織過氧化的損傷程度[17-19]。有研究表明，肝細胞脂肪變性后肝功能酶活性、肝脂水平和血脂水平會呈現正相關性。人體內的TG主要在肝臟中合成，肝臟受到損傷，機體對游離脂肪酸的利用則會減少，導致血清中TG水平升高。所以血清中TG含量的高低間接反映了肝臟受損情況[20-21]。γ-GT在人體細胞的微粒體中合成，主要存在于肝內膽管上皮和肝細胞質中，從膽道排泄。肝病時，肝細胞受損同時膽道受壓，γ-GT排泄受阻，隨膽汁返流入血，可致血中γ-GT升高[22]。故本實驗采用SOD活力、MDA含量、TG含量、γ-GT活力指標來反映肝損傷的程度。實驗結果表明模型組肝損傷嚴重，抗氧化活性降低，脂質過氧化產物增加。MMO各劑量組均有明顯改善，尤其高劑量組對肝損傷修復作用顯著。

肝組織的損傷與修復不僅僅體現在肝功能生化指標的改變，同時會引起肝組織結構的變化。通過肝組織的HE染色，發現模型組肝組織損傷比較嚴重，而經過MMO各劑量和聯苯雙酯滴丸處理后，小鼠肝組織損傷程度減輕，肝小葉結構逐漸恢復，其中MMO高劑量組的效果與陽性藥物組效果相近，效果好于MMO低劑量組。

為了進一步探索MMO對小鼠急性肝損傷的修復，通過免疫組化法檢測TNF-α、NF-κB蛋白的表達。在CCl4誘導的肝損傷機制中，自由基的介導發揮著重要的作用，自由基具有雙重效應，一方面使機體發生脂質過氧化；另一方面促使腫瘤壞死因子（TNF-α）的生成[23]。TNF-α是一種多效的細胞因子，是由激活的巨噬細胞或單核細胞產生，在炎癥反應、細胞免疫和腫瘤免疫等方面發揮著關鍵作用[24-26]。并且，TNF-α可通過活化NF-κB信號通路，誘導cyclinD1表達，加快細胞周期進程[27-28]。而NF-κB轉錄因子在調節肝臟炎癥、細胞凋亡、自噬和氧化狀態方面則發揮著重要作用[29]。NF-κB活化后，可增強TNF-α的基因轉錄，相應的炎癥信號迅速放大，可釋放大量的氧自由基、細胞因子和炎癥介質[30]。在本實驗中，模型組TNF-α、NF-κB蛋白表達水平升高，表明小鼠肝細胞損傷嚴重，炎癥反應明顯。而MMO高劑量組TNF-α、NF-κB蛋白表達水平顯著降低，減少了炎癥因子釋放從而降低了炎癥反應，其與聯苯雙酯滴丸組效果相近。

綜上所述，MMO一方面能夠有效抑制血清AST、ALT、γ-GT活力的升高，阻止自由基清除劑SOD活力的降低，抑制脂質過氧化產物MDA的產生，降低血清TG含量；另一方面可降低TNF-α、NF-κB蛋白的表達量。因此MMO可能通過減輕脂質過氧化反應，減少活性氧及其自由基的產生，從而減輕線粒體氧化負荷，促使氧化-抗氧化機制恢復平衡，并且減少了炎癥因子的釋放，減輕炎癥反應從而達到保護肝臟的目的。

4 結 論

本實驗利用CCl4建立小鼠急性肝損傷模型，對文蛤寡肽的肝損傷保護作用進行了體內實驗的研究。實驗結果表明，無論從血清生化指標、病理學和組織學觀察，還是對炎癥因子TNF-α、NF-κB的檢測，都表明MMO對CCl4引起的肝損傷具有明顯的保護作用。

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Protective Effect of Meretrix meretrix Oligopeptides on Acute Liver Injury in Mice

WANG Jiajia, ZHAO Shasha, YANG Zuisu*, YU Fangmiao, DING Guofang
(Zhejiang Provincial Engineering Technology Research Center of Marine Biomedical Products, School of Food Science and Medical, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022, China)

The protective effect of Meretrix meretrix oligopeptide (MMO) on CCl4-induced acute liver injury in mice was examined. MMO, with the potential to repair damaged liver, was enzymatically extracted and purified by ultrafiltration and Sephadex G-25 column chromatography, and its amino acid sequence was determined to be Gln-Leu-Asn-Trp-Asp. Then, an acute liver injury model was established by intraperitoneal injection of CCl4into mice. The liver index of mice was measured, the activities of serum alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), γ-glutamyltransferase (γ-GT) and superoxide dismutase (SOD) were determined, and serum triglyceride (TG) and malondialdehyde (MDA) levels were measured. Liver tissue samples from mice were stained with hematoxylin-eosin (HE) to observe the effect of MMO on liver histopathology. Immunohistochemical staining was used to detect the protein expression of TNF-α and NF-κB in hepatic tissue. The results showed that the MMO group exhibited a decrease in liver index, a reduction in serum ALT, AST and γ-GT activities (by up to 47.16%), an elevation in serum SOD activity, and a decline in serum TG and MDA levels (by up to 31.88% and 28.83%) compared with the model group, all these changes being statistically significant. Mouse liver tissue stained with HE revealed a notable improvement in liver histology. The protein expression of TNF-α and NF-κB in hepatic tissue was significantly decreased by administration of MMO. Therefore, MMO can effectively protect against acute liver injury induced by CCl4in mice.

Meretrix meretrix oligopeptides; carbon tetrachloride; acute liver injury

10.7506/spkx1002-6630-201713031

TS201.6

A

1002-6630（2017）13-0190-06引文格式：

王佳佳, 趙莎莎, 楊最素, 等. 文蛤寡肽對小鼠急性肝損傷的保護作用[J]. 食品科學, 2017, 38(13): 190-195.

10.7506/ spkx1002-6630-201713031. http://www.spkx.net.cn

WANG Jiajia, ZHAO Shasha, YANG Zuisu, et al. Protective effect of Meretrix meretrix oligopeptides on acute liver injury in mice[J]. Food Science, 2017, 38(13): 190-195. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201713031.

2016-06-11

浙江省自然科學基金項目（LY15C200016；LQ16H300001）；舟山市級公益類科技計劃項目（2015C31012）

王佳佳（1991—），女，碩士研究生，研究方向為海洋藥物、海洋功能食品。E-mail：1354193287@qq.com

*通信作者：楊最素（1967—），女，教授，博士，研究方向為海洋藥物、海洋功能食品。E-mail：yangzs87@163.com