雙歧桿菌對潰瘍性結腸炎小鼠腸損傷及腸道菌群的影響

郭慧慧，宋慧，李婷，王淑媛，衛佳麗

（1.吉林農業大學生命科學學院；2.吉大白求恩醫科大學制藥廠，吉林長春130118）

雙歧桿菌對潰瘍性結腸炎小鼠腸損傷及腸道菌群的影響

郭慧慧1，宋慧2，李婷2，王淑媛1，衛佳麗1

（1.吉林農業大學生命科學學院；2.吉大白求恩醫科大學制藥廠，吉林長春130118）

本文探討雙歧桿菌M IMBb75對潰瘍性結腸炎小鼠腸損傷及腸道菌群的影響。試驗采用葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導小鼠潰瘍性結腸炎，隨機分成7組：正常對照組、模型組、MRS-L培養基陰性對照組、美沙拉嗪陽性對照組、M IMBb75高劑量組、M IMBb75中劑量組及M IMBb75低劑量組，給藥7天后處死小鼠，進行結腸長度、血中血紅蛋白濃度及腸道菌群檢測。結果顯示：雙歧桿菌能夠有效抑制潰瘍性結腸炎引起的小鼠血中血紅蛋白濃度的下降，可以抑制潰瘍性結腸炎引起的結腸長度的縮短；可以增加腸道菌群多樣性，提高擬桿菌屬及柔嫩梭菌的數量。說明雙歧桿菌通過調節腸道微生態失調，對潰瘍性結腸炎發揮治療作用。

雙歧桿菌M IMBb75；結腸炎；結腸損傷；DGGE；腸道菌群

潰瘍性結腸炎（ul c e r a t i v e c o l i t is，U C）是一種無地域差異、無種族差異的人群多發性腸道炎癥疾病，主要表現在結腸、直腸的粘膜和粘膜下層受損引發炎癥[1]。U C的臨床表現主要以腹痛、腹瀉、粘液膿血便以及不同程度的全身癥狀[2]，其病因尚不明確，目前認為，U C的發病可能與腸腔內部抗原誘導免疫反應過度激活相關[3]。隨著微生態學的發展，腸道微環境作為一個復雜的微生態系統與U C的發病有著緊密的聯系。研究發現，U C患者腸道菌群失調，致病菌和條件致病菌增多，導致腸道粘膜通透性增加，而細菌代謝產物向粘膜固有層移位，引起免疫細胞的激活，誘發炎癥反應[4]。一系列研究發現，潰瘍性結腸炎患者體內雙歧桿菌及乳酸菌等有益菌數量下降，大腸桿菌腸球菌等有害菌數量增多，提示腸道菌群可能參與潰瘍性結腸炎的發生與發展。雙歧桿菌是近年來被認可的益生菌，具有增強免疫力、抗衰老、抗腫瘤等生理功能，尤其是對腸道菌的平衡有很好的作用。本試驗旨在研究雙歧桿菌對U C小鼠結腸損傷及腸道菌群的影響。

1 材料

1.1 試驗動物

清潔級昆明小鼠64只，體重18～22克，雌雄對半。來源：吉林大學動物實驗室。昆明鼠在理科樓分子病學研究室進行為期7天的適應性喂養。

1.2 藥品

美沙拉嗪腸溶片購于葵花藥業有限公司；雙歧桿菌（M I M Bb75）由吉大藥廠饋贈，調節為108C FU/m L，107C FU/m L，106C FU/m L三個不同的濃度。

1.3 主要試劑

文-齊氏液（H i C N化高鐵血紅蛋白轉化液）購于上海榕柏生物技術有限公司；葡聚糖硫酸鈉（D SS，分子量36000～50000），購自美國M P B io m e d i c a l s公司。

1.4 主要儀器

低速離心機，購自上海安亭科學儀器廠；立式壓力蒸汽滅菌器，購自上海申安醫療器械有限公司；水浴鍋，購自上海貝凱生物化工設備有限公司；P C R儀，購自T he r m o S C I E N T IF I C；電泳儀，購自北京君意東方電泳設備有限公司；D GG E電泳儀，購自北京君意東方電泳設備有限公司；凝膠成像儀，購自上海器仁儀器儀表有限公司。

2 方法

2.1 試驗動物分組及給藥

63只清潔級昆明小鼠隨機分為7組，每組9只。分別為空白組、D SS模型組、M R S-L培養基陰性對照組、美沙拉嗪陽性對照組、雙歧桿菌高劑量組、雙歧桿菌中劑量組及雙歧桿菌低劑量組。各組小鼠適應性喂養7天，空腹處理4小時，除空白組外，其余各組自由飲用3%葡聚糖硫酸鈉（D SS）且分別灌胃0.4m L M R S-L培養基，美沙拉嗪以及不同濃度的M I M Bb75培養液。

2.2 結腸損傷相關指標檢測

結腸長度測定∶取整段結腸，量取長度并記錄；血紅蛋白測定：文-齊氏液檢測各小鼠血中血紅蛋白濃度，具體操作依照說明書進行。

2.3 腸道菌群檢測

樣品預處理：從-80℃冰箱中取出腸道菌群檢測樣品，將樣品置于-20℃冰箱中1小時，再在冰盒上解凍20分鐘。滅菌的2亳升離心管除皮稱重，挑取0.2克左右混合物于離心管中，采用酚／氯仿／異戊醇法提取進行腸道內容物腸道菌DN A提取。P C R-D GG E檢測腸道菌群多樣性，取D GG E圖譜的共性條帶及特異性條帶進行克隆測序，具體方法參照曾巧莉等人研究結果[5]。

2.4 統計學方法

采用s p ss23.0軟件對實驗數據進行統計分析，試驗數據以“平均值±標準差”表示，采用F檢驗對正交試驗結果進行差異性分析，用P＜0.05表示差異顯著。

3 結果與分析

3.1 各組小鼠結腸損傷相關指標測定

飲用D SS以后，與對照組相比，模型組與M R S-L陰性對照組小鼠血中血紅蛋白濃度及結腸長度發生明顯改變，血紅蛋白濃度下降，結腸長度縮短，與空白組相比具有統計學意義（P＜0.05），說明模型組小鼠結腸炎相關指標發生改變，并且M R S-L對D SS引起的結腸損傷無明顯的改善作用，見表1。與模型組相比，美沙拉嗪陽性對照組及雙歧桿菌（M I M Bb75）各處理組血紅蛋白濃度及結腸長度發生改變，血紅蛋白濃度升高，結腸長度增加，與模型組相比具有統計學意義（P＜0.05），說明雙歧桿菌（M I M Bb75）對D SS引起的結腸損傷具有一定的抑制作用，見表1。

3.2 MIMBb75對DSS誘導的結腸炎小鼠腸道菌群的影響

3.2.1 M IMBb75對DSS誘導的結腸炎小鼠腸道菌群多樣性的影響將P C R-D GG E圖譜（圖1）各組的條帶數進行分析（表2），與空白組相比，M I M Bb75高劑量組及中劑量組DN A條帶數均顯著升高（P＜0.05）；與D SS模型組相比M I M Bb75高劑量組、中劑量組、低劑量組及美沙拉嗪組DN A條帶數均顯著升高（P＜0.05）；而與D SS對照組相比，M R S處理組DN A條帶數無顯著差異。

表1 各組小鼠血紅蛋白濃度和結腸長度檢測結果

表2 M IMBb75對小鼠腸道菌群條帶數的影響

圖1 不同處理組腸道內容物DGGE圖譜1～3空白組1-3 Control group；4～6 MRS培養基對照組；4-6 MRS group；7～9M IMBb75∶1×108cfu/m l；10～12 M IMBb75∶1× 107cfu/m l；13～15M IMBb75∶1×106cfu/m l；16～18DSS；19～21Mesalazine

圖內數字為條帶編號，N u m b e r s in t he p r o f l ies is ge l b an d n u m b e r.

3.2.2 M IMBb75對DSS誘導的結腸炎小鼠腸道菌群相似性的影響

由圖2可看出，M I M Bb75中劑量組與M I M Bb75高劑量組相似性系數為49.8%，M I M Bb75低劑量組與M I M Bb75高劑量組相似性系數為45%，美沙拉嗪對照組與M I M Bb75高劑量組相似性系數為33.9%，M R S對照組與M I M Bb75高劑量組相似性系數為41%，D SS模型組與M I M Bb75高劑量組相似性系數為39%，空白組與M I M Bb75高劑量組相似性系數為39.4%，由結果可以看出，M I M Bb75不同劑量組間的相似性均高于與空白組、美沙拉嗪組及D SS模型組的相似性。

圖2 不同處理組小鼠PCR-DGGE圖譜條帶的聚類分析圖1～3空白組1-3 Control group；4～6 MRS培養基對照組；4-6 MRS group；7～9M IMBb75∶1×108cfu/m l；10～12 M IMBb75∶1× 107cfu/m l；13～15 M IMBb75∶1×106cfu/m l；16～18 DSS；19～21Mesalazine

3.2.3 M IMBb75對DSS誘導的結腸炎小鼠腸道微生物種類的影響

表3可見，由于擴增出細菌的16S rDN A的V3區片段大小為200b p，而克隆僅能測出170b p左右。本實驗并未檢測出乳酸桿菌、雙歧桿菌和大腸桿菌等優勢菌群，主要以擬桿菌屬、柔嫩梭菌屬、多形桿菌為主，對比結果顯示，1、6、12、14和16作為共性條帶，分別為擬桿菌屬B a r nesie ll a in t es t iniho m inis、多形桿菌B a ct e r oi d es、檸檬酸桿菌[C i tr o b a ct e r]，M I M Bb75處理組特異性條帶為4、5、7、8、9、10、11、13、15、16、17、19和20，主要為擬桿菌屬B a r nesie ll a in t es t iniho m inis、柔嫩梭菌[C l os tr i d u m]l e p t u m s tr ain及乳酸發酵梭菌[C l o tr i d i u m] p o l y sa cc ha r o l y t i c u m s tr ain，可以看出柔嫩梭菌及乳酸發酵梭菌在各組都存在，且在M I M Bb75處理組更具優勢。

表3 DGGE圖譜中條帶的基因片段序列對比

4 結論與討論

潰瘍性結腸炎（U C）的發病機制目前尚不清楚。近年來，隨著遺傳學、免疫學以及分子生物學等學科的發展，人們對U C的認識不斷深入[6]。已有研究證明，U C的發病與環境因素、遺傳因素、免疫因素以及腸道微生物密切相關。目前認為，腸道微生物屏障與機體的相互作用可能是U C發生的重要原因之一[7]。據報道顯示，益生菌通過抑制N F-k B信號通路發揮抗潰瘍性結腸炎的作用[8]。而本試驗結果顯示，M I M Bb75高劑量組、中劑量組與低劑量組DN A條帶數顯著升高且M I M Bb75高劑量組與M I M Bb75中劑量組、低劑量組的相似性均較與空白組、M R S培養基陰性對照組、美沙拉嗪組及D SS組相似性高，說明M I M Bb75各劑量組對小鼠腸道菌群結構有著相似的調節作用。分析可能的原因：雙歧桿菌是益生菌，能夠參與短鏈脂肪酸的合成，從而增強上皮細胞的屏障功能，阻止致病性的大腸桿菌入侵。張玲等研究發現，雙歧桿菌三聯活菌能有效抑制腸道內致病菌的生長[9]。徐俊燕等研究發現，美沙拉嗪聯合雙歧桿菌四聯活菌能明顯改善U C的臨床癥狀，促進腸粘膜的愈合[10]。根據本實驗結果初步推測，M I M Bb75可以與腸道內原有的宿主微生物競爭，抑制有害菌生長，促進有益菌生長，增加小鼠腸道微生物多樣性。

研究發現，益生菌能給上皮細胞（I E C s）提供重要的能源物質，同時共生菌的代謝產物也促進I E C s平衡。微生物能夠介導膳食纖維及糖類物質的加工產生短鏈脂肪酸，如乙酸、丙酸和丁酸，而丁酸信號通過G蛋白偶聯手提(G P R)109A誘導I E C I L-18的表達，從而抑制結腸炎相關性結腸癌（C A C）[11]。其他相關研究證明雙歧桿菌能有衍生乙酸增強腸道上皮細胞抗凋亡反應，對腸道損傷發揮保護作用[12]。本實驗的結果顯示，M I M Bb75處理組出現了特異性的柔嫩梭菌、乳酸發酵梭菌及檸檬酸桿菌等，降低腸道p H值，抑制病原微生物的入侵。由此可見，本試驗小鼠結腸阻止損傷結果顯示：M I M Bb75各劑量組小鼠血中血紅蛋白濃度升高，結腸長度增加，結腸損傷有所改善，這可能與M I M Bb75添加衍生乙酸，降低腸道p H值，營造腸道酸性環境，抑制有害菌的生長有關。徐敏等研究發現益生菌可能通過抑制N F-k B信號通路降低小鼠集體腸道炎癥，改善結腸炎小鼠的病理學損傷。根據本實驗結果初步推斷，M I M Bb75能夠通過營造有益的腸道微環境降低腸道p H值，從而有利于腸道有益菌的定制，減少腸道有害菌，改善腸道菌微生態分布，從而抑制結腸炎小鼠的結腸損傷。

[1]陳璐,C H E N L u.潰瘍性結腸炎發病機制的研究進展[J].疑難病雜志,2016,15(06)∶650-654.

[2]羅鳳燕,白愛平.潰瘍性結腸炎動物模型的研究進展[J].世界華人消化雜志,2013(07)∶607-613.

[3]C o m i t o D,R o m ano C.D y s b iosis in t he P a t hogenesis o f P e d ia tr i c I n f l a mm a t o r y B o w e l D iseases[J].I n t e r na t iona l J o u r na l o f I n f l a mm a t ion,2012,2012(14)∶687143.

[4]F a v a F,D anese S.I n t es t ina l m i cr o b io t a in in f l a mm a t o r y b o w e l d isease∶f r ien d o f f oe[J].W o r l d j o u r na l o f gas tr oen t e r o l og y, 2011,17(05)∶557.

[5]曾巧莉,宋慧,郭慧慧,等.金針菇菇腳對肉雞盲腸菌群及短鏈脂肪酸的影響[J].中國農業大學學報,2016,21(05)∶104-114.

[6]金博.腸道菌群移植與潰瘍性結腸炎[J].世界華人消化雜志,2017(01)∶23-30.

[7]B o r o d y T J,C a mp b e ll J.F e c a l m i cr o b io t a tr ans p l an t a t ion∶c u rr en t s t a t u s an d f u t u r e d i r e ct ions[J].E x p e rt R e v ie w o f G as tr oen t e r o l og y&H e p a t o l og y,2011,5(06)∶653.

[8]徐敏,趙莉,杜金城,等.益生菌混合物通過抑制N F-κB信號通路發揮抗潰瘍性結腸炎功效的研究[J].食品工業科技, 2016,37(17).

[9]張玲,李昌平,姜政,等.雙歧桿菌三聯活菌聯合英夫利昔單抗治療中重度潰瘍性結腸炎的臨床觀察[J].中國藥房, 2017,28(05)∶629-632.

[10]徐俊燕,吳建業.美沙拉嗪聯合雙歧桿菌四聯活菌片對潰瘍性結腸炎患者脂質過氧化損傷保護作用的觀察[J].藥物流行病學雜志,2015(12)∶712-714.

[11]S ingh N,G u r a v A,S i v a p r a k asa m S,e t a l.A ct i v a t ion o f Gp r109a,r e c e p t o r f o r nia c in an d t he c o mm ensa l m e t a b o l i t e b u t y r a t e,s u pp r esses c o l oni c in f l a mm a t ion an d c a rc inogenesis[J]. I mm u ni t y,2014,40(01)∶128-39.

[12]F u k u d a S,H i d ehi r o T oh,K o j i H ase,e t a l.B i f i d o b a ct e r ia c an p r o t e ct f r o m en t e r o p a t hogeni c in f e ct ion t h r o u gh p r o d u ct ion o f a c e t a t e[J].N a t u r e,2011.

R574.62

A

10.14025/j.cnki.jlny.2017.13.016

郭慧慧，在讀碩士研究生，研究方向：微生物資源開發與利用。

宋慧，博士，教授，研究方向：生物大分子結構與功能。

項目名稱：M IMBb75菌株動物學試驗研究；標注：橫向聯合項目，與吉林大學白求恩醫科大學制藥廠