鹿茸膠原蛋白對創傷愈合作用的試驗研究

車爽，程然，蔣薇，張健，薄士儒

（吉林農業科技學院，吉林吉林132001）

鹿茸膠原蛋白對創傷愈合作用的試驗研究

車爽，程然，蔣薇，張健，薄士儒*

（吉林農業科技學院，吉林吉林132001）

目的：研究鹿茸膠原蛋白對創傷愈合的影響，比較不同濃度膠原蛋白對創傷愈合的影響程度。方法：采用低溫酶解法提取鹿茸膠原蛋白，在正常小鼠皮部造成急性創傷模型，設1個對照組，1個京萬紅陽性對照組，3個實驗組分別涂不同濃度膠原蛋白。觀察創面愈合情況，用創傷愈合率體現。并測其皮膚強脯氨酸含量，進而對比膠原含量。結果：高濃度膠原蛋白涂抹的傷口愈合率較高，其皮部膠原較多。結論：鹿茸膠原蛋白對創傷愈合有促進作用，且愈合程度與膠原蛋白的濃度有關。

生藥學；膠原蛋白；創傷愈合；羥脯氨酸

鹿茸具有廣泛的藥理作用，但是深加工研究滯后，對其提取物有效活性成分的研究甚少。膠原蛋白由于結構獨特，理化性質及生物特性非常突出，在醫療上的應用具體表現在膠原蛋白具有低免疫源性、組織之間的協調作用強、物理機械性能好，可生物降解度高，具體體現在止血、治療燒傷和骨折等方面手術的應用。

目前，以鹿茸為主料，分離提取出對醫學，對機體具有調節作用的膠原蛋白活性物質成分，研究其對皮膚創傷愈合作用的研究未見報道。通過本研究為后續開發鹿茸膠原蛋白相應的藥品（如噴劑）奠定理論基礎，以達到科學利用現有的鹿茸資源，增加鹿茸產品附加值的目的，從而促進我國鹿業養殖實現可持續性發展。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設備

紫外可見分光光度計、高速離心機、真空冷凍干燥機。

1.2 實驗材料

新鮮鹿茸，清潔級胰蛋白酶，清潔級小白鼠50只，羥脯氨酸標準品等。

1.3 方法

1.3.1 提取在4℃條件下，利用鹽酸使梅花鹿茸灰分中的不溶物變成可溶性鹽類，選擇氯化鈉溶液作為除雜蛋白的主要試劑，達到將其脫除的目的[1]。采用徐云鳳的胰蛋白酶水解制備鹿茸膠原蛋白的方法，取新鮮的鹿茸50克，加入150毫升乳酸鹽的緩沖液，用組織絞碎機絞碎，加入胰蛋白酶0.5克，加入激活劑氯化錳0.05克，p H值調為8.0，將溶液的溫度調至52℃，放入反應罐3小時，離心去殘渣，收集透明澄清的液體，在10℃條件下進行酶解提取[2]。

1.3.2 純化在中性條件下鹽析全部膠原蛋白，方法如下：向梅花鹿茸膠原蛋白酶解液中緩慢加入，并攪拌經過研磨的氯化鈉，充分攪拌，靜止10～24小時,以便膠原蛋白充分析出，再以8000轉的速度離心，收集沉淀物后用0.5m o l/L乙酸進行溶解，并對0.5m o l/L乙酸進行透析，以便除去沉淀中的多余鹽分，最后將樣品進行真空凍干[3]。

1.3.3 動物造模分組及給藥購買清潔級小白鼠50只，分別用乙醚進行淺麻醉。局部備皮，常規消毒，將小鼠皮部取直徑為1厘米的圓形切口，切開皮膚全層,至深筋膜,制作出直徑相同的圓形創面,然后以無菌紗布覆蓋,造模完成。把小鼠隨機分成五組，根據人和小鼠的體重與表面積比計算得出小鼠給藥量=小鼠體表面積×小鼠體重/人的體表面積×人的體重×人體用量。設高、中、低3個實驗組，1個空白對照組，1個陽性對照組，將實驗組創面分別使用0.05m o l/L，0.25m o l/L，0.5m o l/L的梅花鹿茸膠原蛋白，每日兩次，空白組不進行藥物治療，陽性對照組用京萬紅以相同藥量做陽性對照。以無菌紗布覆蓋，防止感染，連續給藥觀察。

1.3.4 羥脯氨酸含量檢測膠原蛋白是構成結締組織中膠原纖維的主要成分，含羥脯氨酸的量最多，是愈合組織中最重要的成分，在一定時間內，創傷愈合部位組織中的膠原蛋白的含量會反映傷口的愈合程度[4]。羥脯氨酸是膠原蛋白中的特征性氨基酸，因此測定動物組織中羥脯氨酸的含量即可定量觀察創傷組織的愈合程度。取創面皮膚經脫水及脫脂處理后水解，根據羥脯氨酸的測定原理，使用氯化亞錫對梅花鹿茸膠原蛋白樣品進行水解使其釋放羥脯氨酸，加入氯氨T、二甲氨基苯甲醛，于558納米波長處比色，比較羥脯氨酸含量。若實驗組羥脯氨酸含量高于空白對照組，則說明創面膠原蛋白水平提高，即創面傷口愈合情況較好[5]。

1.3.5 創面愈合情況評價描記創面愈合面積，以創面完全上皮化（病理證實）作為判斷依據，記錄創面愈合時間。每天觀察傷口愈合情況，并將創面描記在半透明的紙上，再以半透明紙作為模板，將質地均勻的硬紙片剪成圖樣大小，以硬紙片重量間接表示創面及愈合部分面積大小，將數據統計起來，并以下式計算：創面愈合率（%）=（開始創傷面積-未愈合創面面積）/開始創傷面積[6]。再以實驗組和對照組的創面愈合率進行對比，來確定鹿茸膠原蛋白是否起到愈合傷口的作用[7]。

2 實驗結果

2.1 組織學觀察

5個分組創傷涂藥后均有不同程度的創面腫脹、滲出現象。傷口用藥組涂藥后創面出現腫脹、滲出程度較對照組輕。5個分組創傷2天后創面均有不同程度的干燥、結痂現象，其痂皮呈淡黃色，質地較軟，無異常分泌物出現及感染情況出現。

2.2 小鼠創面愈合率（見表1）

表1 分別在第2天、5天、8天、12天測得創面愈合率

2.3 羥脯氨酸標準樣品濃度與吸光度的測定結果（見表2）

表2 羥脯氨酸標準樣品濃度與吸光度的測定結果

2.4 以羥脯氨酸濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線（見圖1）

圖1 標準曲線

計算其回歸方程為：y=0.076x+0.0035，r＝0.9995（P＜0.001），因此，吸光度和羥脯氨酸濃度之間有很好的相關性。2.5小鼠組織中羥脯氨酸含量的測定（見表3）

表3 小鼠組織中羥脯氨酸含量的測定

由表3可知，小鼠創傷處組織中羥脯氨酸的含量逐漸遞增，由于羥脯氨酸濃度和膠原蛋白濃度成正相關，羥脯氨酸濃度的變化即可反映小鼠組織中膠原蛋白的變化，由此可知，鹿茸膠原蛋白對傷口愈合的對比情況。

3 討論與分析

經實驗初步證明，鹿茸膠原蛋白對傷口創傷愈合有促進作用，不同濃度膠原蛋白對傷口的愈合率不同，高濃度的愈合率大于不用藥的傷口愈合率，且傷口的愈合程度與鹿茸膠原蛋白的濃度有關。

[1]葉易春,但衛華.酶法提取牛鍵膠原的研究[J].中國皮革,2005,34(07)∶4-7.

[2]周文常,但衛華,廖隆理,等.豬皮膠原蛋白的提取及其結構表征[J].中國皮革,2004,33(13)∶36-38.

[3]王燕,付萬冬,鄭斌.酶法提取魷魚皮膠原蛋白[J].食品科技,2011,(06).

[4]付小兵,孫同柱.幾種用于創作修復研究的動物模型.中華實驗外科雜志,1999,16(05)∶479-480.

[5]陳玉華,廖仕成,李瑞園,等.乳及乳制品中羥脯氨酸測定方法的研究[J].職業與健康,2010,2(03)∶283-285.

[6]彭方毅,周歡,姜海蓉,袁兵占,崔玉花.一種新型優化的肺組織羥脯氨酸水平測定方法的建立[J].重慶醫學,2014,(11).

[7]楊晶,孫鳳,丁武.波爾山羊雜交代肌肉中羥脯氨酸含量的測定及其與肌肉品質的關系[J].農產品加工(學刊),2012,(01).

S865.42

A

10.14025/j.cnki.jlny.2017.13.017

車爽，在讀本科生，研究方向，制藥工程。

薄士儒，碩士，助教，研究方向：生藥學和藥理學。