宮頸上皮內瘤變組織中高危型HPV感染對凋亡、增殖基因表達的影響

陶旻楓++王小榕

[摘要] 目的 研究宮頸上皮內瘤變（CIN）組織中高危型HPV感染對凋亡、增殖基因表達的影響。 方法 選擇2013年5月～2016年10月在首都醫科大學附屬北京婦產醫院北京婦幼保健院進行活檢的CIN組織和炎性病變組織，分別作為CIN組和對照組。測定高危型HPV感染情況，根據HPV-DNA的RLU/CO將CIN組織分為<1 RLU/CO組、1～100 RLU/CO組、>100～1000 RLU/CO組、>1000 RLU/CO組。同時，測定宮頸組織中細胞周期蛋白及其激酶、凋亡抑制蛋白的表達量。 結果 CIN組宮頸組織中cyclinB1、cyclinD1、cyclinE、CDK4、CDK6、Apollon、c-IAP1、Survivin、Livin mRNA表達量顯著高于對照組，差異有統計學意義（P < 0.05）。1～100 RLU/CO組、>100～1000 RLU/CO組、>1000 RLU/CO組CIN組織中cyclinB1、cyclinD1、cyclinE、CDK4、CDK6、Apollon、c-IAP1、Survivin、Livin mRNA表達量顯著高于<1 RLU/CO組，且HPV-DNA的RLU/CO越高，cyclinB1、cyclinD1、cyclinE、CDK4、CDK6、Apollon、c-IAP1、Survivin、Livin mRNA表達量越高，差異有統計學意義（P < 0.05）。 結論 宮頸上皮內瘤變組織中高危型HPV感染能夠增加細胞周期蛋白及其激酶、凋亡抑制蛋白的基因表達量。

[關鍵詞] 宮頸上皮內瘤變；高危型人乳頭瘤病毒；細胞周期；凋亡抑制蛋白

[中圖分類號] R737.33 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）06（b）-0080-05

Effect of high risk HPV infection on the genes expression of apoptosis and proliferation in cervical intraepithelial neoplasia

TAO Minfeng1 WANG Xiaorong2

1.Health Department， Beijing Maternal and Child Health Care Hospital， Beijing Obstetrics and Gynecology Hospital， Capital Medical University， Beijing 100026， China； 2.Department of Perinatal Medicine， Beijing Maternal and Child Health Care Hospital， Beijing Obstetrics and Gynecology Hospital， Capital Medical University， Beijing 100026， China

[Abstract] Objective To study the effect of high risk HPV infection on the expression of apoptosis and proliferation genes in cervical intraepithelial neoplasia （CIN）. Methods CIN tissues and inflammatory lesions tissues received biopsy in Beijing Maternal and Child Health Care Hospital， Beijing Obstetrics and Gynecology Hospital， Capital Medical University from May 2013 to December 2016 were collected， respectively enrolled in CIN group and control group. CIN tissues were divided into <1 RLU/CO group， 1-100 RLU/CO group， >100-1000 RLU/CO group， >1000 RLU/CO group according to HPV-DNA RLU/CO. Meanwhile， cell cycle protein and its kinase， inhibitor of apoptosis proteins in cervical tissue were determined. Results Expression levels of cyclinB1， cyclinD1， cyclinE， CDK4， CDK6， Apollon， c-IAP1， Survivin， Livin mRNA in cervical tissue of CIN group were significantly higher than those of control group， with statistically significant differences （P < 0.05）. Expression levels of cyclinB1， cyclinD1， cyclinE， CDK4， CDK6， Apollon， c-IAP1， Survivin， Livin mRNA in CIN cervical tissue of 1-100 RLU/CO group， >100-1000 RLU/CO group， >1000 RLU/CO group were significantly higher than those of the <1 RLU/CO group， and the higher the HPV-DNA RLU/CO， the higher the expression of cyclinB1， cyclinD1， cyclinE， CDK4， CDK6， Apollon， c-IAP1， Survivin， Livin mRNA， with statistically significant differences （P < 0.05）. Conclusion High risk HPV infection in cervical intraepithelial neoplasia can increase the expression of cyclin and its kinase and inhibitor of apoptosis protein genes.

[Key words] Cervical intraepithelial neoplasia； High risk human papilloma virus； Cell cycle； Inhibitor of apoptosis protein

宮頸上皮內瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）是宮頸癌的癌前病變，人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染，尤其是高危型HPV感染是造成CIN的明確危險因素[1-2]。HPV是一類球形DNA病毒，感染局部組織后能夠整合進入宿主細胞的基因組DNA，進而引起宿主細胞增殖、凋亡等多種生物學行為的改變[3-5]。但是，目前關于高危型HPV感染引起宮頸上皮細胞增殖、凋亡等生物學過程異常的分子機制并未完全闡明。細胞的凋亡和增殖過程受到多種基因表達產物調控，細胞周期蛋白及相應的激酶通過加速細胞周期促進細胞增殖，凋亡抑制蛋白通過抑制細胞凋亡促進細胞增殖。本研究檢測了宮頸上皮內瘤變組織中凋亡、增殖基因的表達量以及高危型HPV感染對凋亡、增殖基因表達的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

實驗標本取自2013年5月～2016年10月在首都醫科大學附屬北京婦產醫院北京婦幼保健院進行活檢的子宮頸組織，均經病理學檢查明確診斷，CIN組織作為CIN組，炎性病變組織作為對照組。CIN組68例，年齡32～58歲，平均（39.5±6.2）歲；CIN Ⅰ期22例，CIN Ⅱ期29例，CIN Ⅲ期17例；體重指數（BMI）為（22.8±3.2）kg/m2。對照組50例，年齡29～60歲，平均（40.2±6.6）歲；BMI為（23.1±3.7）kg/m2。兩組患者年齡、BMI等一般資料比較，差異無統計學意義（P > 0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 試劑 HPV核酸檢測試劑盒（HC-2法）購買于深圳凱杰生物工程公司，Trizol裂解液購買于Invitrogen公司，RNA分離提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒以及熒光定量PCR試劑盒購買于北京天根生物公司。

1.2.2 高危型HPV檢測 取30～50 mg宮頸組織，采用HPV核酸檢測試劑盒（HC-2法）檢測樣本發光單位RLU，計算RLU與標準陽性對照臨界值CO的比值，將RLU/CO>1.0的樣本判斷為HPV-DNA陽性。所選用的試劑盒能檢測HPV-16、-18、-31、-33、-35、-39、-45、-51、-52、-56、-58、-59、-68共13種高危型HPV DNA。根據RLU/CO將CIN標本分為<1 RLU/CO組、1～100 RLU/CO組、>100～1000 RLU/CO組、>1000 RLU/CO組。

1.2.3 基因檢測 取30～50 mg宮頸組織，加入1 mL Trizol裂解液充分研磨組織，采用RNA分離提取試劑盒分離得到組織研磨液中的總RNA，采用cDNA第一鏈合成試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA。取cDNA樣本并進行熒光定量PCR擴增，所用試劑為熒光定量PCR試劑盒，擴增的基因包括cyclinB1、cyclinD1、cyclinE、CDK4、CDK6、Apollon、c-IAP1、Survivin、Livin以及GAPDH，引物序列及產物長度見表1，PCR條件見表2，均進行40個循環。得到擴增曲線后以GAPDH為內參計算cyclinB1、cyclinD1、cyclinE、CDK4、CDK6、Apollon、c-IAP1、Survivin、Livin mRNA表達量。

1.3 統計學方法

采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CIN組織和正常宮頸組織中細胞周期蛋白及其激酶mRNA表達量

CIN組中cyclinB1、cyclinD1、cyclinE、CDK4、CDK6 mRNA表達量顯著高于對照組，差異有統計學意義（P < 0.05）。

2.2 不同高危型HPV感染情況CIN組織中細胞周期蛋白及其激酶mRNA表達量

高危型HPV感染的RLU/CO比值越高，CIN組織中cyclinB1、cyclinD1、cyclinE、CDK4、CDK6 mRNA表達量越高，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表4。

2.3 CIN組織和正常宮頸組織中凋亡抑制蛋白mRNA表達量

CIN組中Apollon、c-IAP1、Survivin、Livin mRNA表達量顯著高于對照組，差異有統計學意義（P < 0.05）。

2.4 不同高危型HPV感染情況CIN組織中凋亡抑制蛋白mRNA表達量

高危型HPV感染的RLU/CO比值越高，CIN組織中Apollon、c-IAP1、Survivin、Livin mRNA表達量越高，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表6。

3 討論

CIN是宮頸癌的癌前病變類型，宮頸上皮細胞增殖和凋亡過程異常，細胞不斷增殖并向惡性表現轉化。細胞周期蛋白及其激酶是調節細胞周期進程以及細胞增殖的重要分子[6-7]。HPV的E1、E4、E7等蛋白能夠與pPb結合并使其激活，進而增加轉錄因子E2F的活性并啟動cyclinB1、cyclinD1、cyclinE多種細胞周期蛋白的表達[8-9]。上述細胞周期蛋白與其激酶CDK4、CDK6結合形成復合物后能夠促進細胞周期的運行以及細胞的增殖[10-12]。本研究對CIN組織中上述細胞周期蛋白及其激酶mRNA表達量的分析表明：CIN組宮頸組織中cyclinB1、cyclinD1、cyclinE、CDK4、CDK6 mRNA表達量顯著高于對照組（P < 0.05）。提示細胞周期蛋白cyclinB1、cyclinD1、cyclinE以及激酶CDK4、CDK6的高表達與CIN的發生有關，CIN組織中細胞周期蛋白及其激酶形成復合體后能夠加速細胞周期發展，促進細胞增殖。

在惡性腫瘤及癌前病變的發生和發展過程中，細胞惡性變的過程不僅與細胞周期進程的加速有關，還與多種凋亡抑制蛋白表達增加有關。Apollon、c-IAP1、Survivin、Livin是與宮頸病變密切相關的幾種凋亡抑制蛋白。Apollon是新發現的凋亡抑制蛋白，具有BIR結構域和泛素結合結構域，能夠抑制Smac所誘導的細胞凋亡以及caspase-9所介導的細胞凋亡[13-14]。c-IAP1能夠與TRAF結合并啟動泛素化過程，進而釋放活化的NF-κB因子并促進細胞存活[15]。Survivin和Livin均能夠與caspase家族中的caspase-3、caspase-7結合并抑制細胞凋亡[16-17]。本研究對CIN組織中上述凋亡抑制蛋白mRNA表達量的分析表明：CIN組宮頸組織中Apollon、c-IAP1、Survivin、Livin mRNA表達量顯著高于對照組（P < 0.05）。說明凋亡抑制蛋白Apollon、c-IAP1、Survivin、Livin的高表達與CIN的發生有關，CIN組織中多種凋亡抑制蛋白表達的增加會造成宮頸上皮組織中細胞凋亡過程受到抑制，進而造成細胞異常增殖。

高危型HPV感染與CIN及宮頸癌之間的密切相關已經得到了一致認可，宮頸組織中持續感染的高危型HPV能夠將病毒本身的DNA整合進入宿主細胞的基因組DNA，造成宿主細胞多種基因表達改變，進而導致宿主細胞生物學行為的改變[18-24]。但是，目前關于宮頸上皮內瘤變組織中受到高危型HPV影響的基因尚未明確。本研究中，為了明確高危型HPV感染對CIN組織中細胞周期蛋白及其激酶、凋亡抑制蛋白表達的影響，按照HPV-DNA的RLU/CO將CIN組織分為四組并分析了細胞周期蛋白及其激酶、凋亡抑制蛋白mRNA表達量。結果顯示：高危型HPV感染的RLU/CO比值越高，CIN組織中cyclinB1、cyclinD1、cyclinE、CDK4、CDK6、Apollon、c-IAP1、Survivin、Livinn mRNA表達量越多。說明高危型HPV感染與CIN組織中細胞周期蛋白及其激酶、凋亡抑制蛋白mRNA的高表達有關，HPV感染能夠增加CIN組織中上述基因的表達量。

綜上所述，本研究認為，CIN組織中高危型HPV感染能夠增加細胞周期蛋白及其激酶、凋亡抑制蛋白mRNA的表達量。但是由于臨床樣本量較少，仍需通過后續增加樣本量來進一步驗證和明確上述研究結論。

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（收稿日期：2017-03-01 本文編輯：程 銘）