人工養殖菲牛蛭性腺分化的組織學觀察

張濤+于翔+龔元+李軍+張健

菲牛蛭（Hirudinaria manillensis）屬于無吻蛭目，俗名金邊螞蟥，主要以吸食人和動物的血液為生，在我國華南地區分布較廣，福建、海南、香港等地均有發現[1]。近幾年，國內外學者通過大量研究發現其體內存在生物活性物質[2-8]，功能與水蛭素相似，具有抗凝活性，對降低血酸和血脂有一定藥理作用，在心血管疾病和血栓疾病方面療效明顯。因此，菲牛蛭的人工養殖開發具有廣大的市場前景。

目前，隨著我國野生菲牛蛭采捕量逐年減少，人工繁殖菲牛蛭技術至關重要，于翔[9]報道了菲牛蛭產卵繭孵化溫度24.0～30.0 ℃下，產卵繭周期一般從幾天到幾十天；張彬[10]報道了溫度對菲牛蛭卵繭孵化影響顯著，26 ℃和28 ℃下菲牛蛭卵繭孵化率較高；筆者通過越冬實驗發現，菲牛蛭冬季也有產繭孵化現象。因此，能否通過一定物理刺激或強化飼料等因素作用，縮短菲牛蛭繁殖周期，并在發育成熟階段集中繁殖產卵繭，是人工繁殖菲牛蛭最重要的一環。而本文則通過生物組織學角度來剖析菲牛蛭在飼喂強化飼料條件下的性腺發育成熟度，為人工繁殖菲牛蛭技術的發展提供了一定的科學依據。

1 材料和方法

1.1 材料

菲牛蛭由湖北省荊州市民康生物技術公司提供，挑選健康無病，平均每條體重為1.24±0.13 g亞成體菲牛蛭。

1.2 方法

實驗在室內進行，將實驗小水蛭暫養到土壤厚度為20～30 mm 的380 mm×275 mm×140 mm的60目網箱中，再將網箱置于同等大小的聚乙烯塑料箱中，用水調節干濕度至70%～80%。每箱實驗組投放100尾小水蛭，并設三個平行組，暫養周期為7 d。

在養殖室溫為21～28 ℃，土層溫度為19～24 ℃條件下，試驗飼料采用人工配合飼料（NP90血球粉30 g，NP2002血漿粉5 g，基礎液，雞蛋100 mL）灌腸后飼喂，每次飼喂前挑取全部試驗小水蛭放到380 mm×275 mm×140 mm的60 目空網箱中，再將網箱置于同等大小的聚乙烯塑料箱中，塑料箱中放入少量的37 ℃左右的溫水，最后將配好的飼料放入網箱中，每5～10 d飼喂一次。每次飼喂前后要稱量全部水蛭個體體重，并在飼喂前隨機采取3～5條體質健壯、體色正常、無傷病的小水蛭，用吸水濾紙擦拭干凈后稱其體重，經麻醉劑麻醉，解剖截取精巢和卵巢后用波恩氏液固定24 h、梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟（56～60 ℃）包埋；通過DQP-9010電腦切片機連續切片，厚度7～8 μm，再進行蘇木精—曙紅（H.E）染色、中性樹膠封片，最后用ECLIPSE E600光學顯微鏡觀察、拍照[11-12]。

1.3 數據統計與分析

試驗數據用平均值±標準差（Mean±SD）表示， 每次飼料實驗前與實驗后代謝5～10 d的體重增重率（W，%）。

W（%）=（W2-W1）/W1×100%

2 結果與分析

2.1 人工飼料飼喂菲牛蛭前后體重與形態變化

2014年6月14日至2014年9月19日期間，用人工飼料飼喂菲牛蛭14次。每次飼料實驗前與實驗后代謝5～10 d的平均體重增重率（%）達到14.1±1.32%。飼喂后菲牛蛭全身腫脹，行動遲緩，經過5～10 d的代謝過程，身體基本恢復到飼喂前狀態，體表顏色無顯著變化，身體健康。當水蛭體重達到6 g左右時，發現部分菲牛蛭前端有黃色生殖環帶出現。

2.2 人工飼料飼喂菲牛蛭的精巢發育及組織學特征

菲牛蛭精巢位于身體兩側，為球形，共11對。每個精巢有輸精小管通到輸精管，各自膨大成貯精囊，再通到射精管，兩側的射精管在中部匯合到一個精管膨腔。不同發育時期的精巢，其特征不同。

本實驗中，菲牛蛭通過人工飼料強化喂養，精巢才逐步成熟，其集中的高峰成熟期是在8月24日—9月19日的6次喂養過程中。本文為便于描述，將精巢發育過程分為5個時期。

2.2.1 精巢發展適應期Ⅰ（6月14日—6月24日）

解剖后肉眼觀察精巢為圓形，白色透明，精巢最大直徑為110 μm。由圖1-1可知，組織切片觀察：精巢由結締組織分割成許多不規則的小室，小室內生殖細胞大量增值成精原細胞，聚集成團，精原細胞大小不一，不規則的排列于精巢之中，組織學為第Ⅰ時期。該結構為初生期精囊。

2.2.2 精巢發展適應期Ⅱ（6月24日—7月9日）

解剖后肉眼觀察精巢為圓形，白色透明，精巢最大直徑150 μm。由圖1-2可知，組織切片觀察：生精囊之間較為寬松，精小葉之間可見精原細胞和初級精母細胞，精原細胞大量增殖聚集成初級精母細胞，核染色較深，結締組織有明顯的血管分布，精小葉無腔隙或腔隙較小，精小囊內初級精母細胞同步發育，細胞體積與精原細胞相差不多，組織學為第Ⅱ時期。

2.2.3 精巢發展啟動期（7月9日—7月29日）

解剖后肉眼觀察精巢為圓形，白色半透明，精巢最大直徑為190 μm。由圖1-3，1-4可知，組織切片觀察：生精囊有豐富的微血管分布，精母細胞發育不同步性，除少數精原細胞外，大多數為初級精母細胞和次級精母細胞，細胞嗜堿性很強，被蘇木精染成藍色，細胞核明顯，生精囊中空存在，生精囊壁較薄，組織學為第Ⅲ時期。

2.2.4 精巢發展生長期（7月29日—8月24日）

解剖后肉眼觀察精巢為圓形，白色，精巢最大直徑為240 μm。由圖1-5可知，組織切片觀察：精小葉生精囊破裂，中空消失，腔隙增大，精小葉主要以次級精母細胞為主，同時伴有少量的精原細胞，初級精母細胞和精子細胞，這些不同發育階段的各類精母細胞在一個精小葉內是以同型的細胞群排列，組織學為第Ⅳ時期。

2.2.5 精巢發展成熟期（8月24日—9月19日）

解剖后肉眼觀察精巢為圓形，白色，精巢最大直徑為270 μm。由圖1-6，1-7可知，組織切片觀察：精小葉生精囊破裂，中空消失，次級精母細胞很少，幾乎看不到精原細胞和初級精母細胞，成熟的精子細胞進入腔隙擠滿整個空間，精小葉中腔隙縮小，精小葉的小葉腔隙充滿大量的成熟精子，組織學為第Ⅴ時期。

2.3 人工飼料飼喂菲牛蛭的卵巢發育及組織學特征

菲牛蛭卵巢被上皮結締和脂肪組織包裹明顯，位于雌性生殖孔第36，37環節中間的環溝上，蛋白腺兩側，為圓形或橢圓形，與輸卵管相連，共1對。不同發育時期的卵巢，其特征不同。

本實驗中，菲牛蛭通過人工飼料強化喂養，卵巢才逐步成熟，其集中的高峰成熟期也是在8月24日—9月19日的6次喂養過程中。本文為便于描述，將卵巢發育過程分為5個時期。

2.3.1 卵巢發育適應期（6月14日—7月9日）

卵巢發育到第Ⅰ期時，肉眼觀察卵巢為淺灰色半透明，橢圓形，最大直徑為100 μm。由圖2-1可知，組織切片觀察：生殖細胞成團，不規則的排列在卵巢中，主要以卵原細胞為主，細胞質分布均勻，并表現為明顯的嗜堿性，細胞核圓形，較大，位于細胞中央，占據整個細胞體積的1/3-1/2左右，卵母細胞直徑0.8～1.2 μm。

2.3.2 卵巢發育啟動期（7月9日—8月8日）

卵巢發育到第Ⅱ期時，肉眼觀察卵巢為白色半透明，橢圓形或圓形，最大直徑為120 μm。由圖2-2， 2-3可知，組織切片觀察：生殖細胞由卵原細胞向初級卵母細胞過渡，細胞質嗜堿性減弱，細胞核多位于細胞中央，細胞為卵圓形或圓形，部分細胞核仁增多，核區嗜酸性增強，卵母細胞質膜外層出現皮質液泡層并向內延伸，細胞直徑1.5～2.1 μm。

2.3.3 卵巢發育小生長期（8月8日—8月24日）

卵巢發育到第Ⅲ期時，肉眼觀察卵巢體積增大不明顯，為白色透明，橢圓形或圓形，最大直徑為145 μm。由圖2-4，2-5可知，組織切片觀察：初級卵母細胞進入卵黃積累時期，細胞質嗜堿性繼續減弱，細胞膜和細胞核界限模糊不清，細胞核向細胞一側移動，核仁已經排出，皮質液泡層液泡減小，并出現嗜酸性卵黃顆粒，呈放射狀和淺紫色，卵母細胞直徑1.8～2.4 μm。

2.3.4 卵巢發育大生長期（8月24日—9月9日）

卵巢發育到第Ⅳ期時，肉眼觀察卵巢體積明顯增大，為淡黃色 ，橢圓形或圓形，最大直徑為210 μm。由圖2-6可知，組織切片觀察：細胞質減少，核膜開始消失，核仁溶解，皮質液泡層消失，卵黃顆粒由外向內延伸，充滿卵母細胞，卵母細胞直徑2.7～3.2 μm。

2.3.5 卵巢發育成熟期（9月9日—9月19日）

卵巢發育到第Ⅴ期時，肉眼觀察卵巢體積，形狀與Ⅳ期變化不明顯，顏色為黃色，最大直徑為215 μm。由圖2-7可知，組織切片觀察：卵母細胞已經達到成熟標準，卵黃顆粒在卵母細胞聚集成卵黃，并充滿整個卵母細胞， 卵母細胞直徑2.8～3.4 μm。

3 討論

3.1 菲牛蛭繁殖生物學特性

菲牛蛭是雌雄同體，雄性先成熟[1]的環節動物，這與本實驗組織切片觀察結果相似。菲牛蛭行異體受精，由身體前端產繭后繭繁殖后代。其有一可以翻出的陰莖，交配時兩個體身體相反的腹部貼緊，一個個體陰莖插入另一個體陰道內，一般是單方面輸送精子到另一方。當一方個體的卵巢成熟后，卵巢囊中的卵與來自另一方個體的精子結合形成受精卵，最后被輸卵管的蛋白包上，此時受精卵就通過雌孔迅速地產到水蛭前端生殖體節的腺體中，這是為什么我們在觀察水蛭在產繭結束前，身體前部有黃色的生殖環帶的主要原因。

3.2 人工飼料飼喂次數、體重對菲牛蛭繁殖性能的影響

菲牛蛭在經過三個月時間，14次人工飼料飼喂后，每次飼料實驗前與實驗后代謝5～10 d的平均體重增重率W（%）達到14.1±1.32%。 隨著人工飼料飼喂次數增多，當菲牛蛭體重為6 g左右時，發現部分水蛭前端出現黃色的生殖環帶，表明水蛭性腺已經達到成熟標準。這與張斌[10]報道的當菲牛蛭體重在5～15 g范圍內，性腺系數隨體重的增加而增大的內容一致。但是，水蛭成熟時軀體大小與飼喂次數并非固定，而是具有一定的可塑性[13]。生長情況良好的菲牛蛭個體可能提前性成熟。同一種群中菲牛蛭性腺成熟的時間與個體大小有可能來自遺傳的差異[14]，也有可能來自對同一環境的適應性不同的影響[15]。

3.3 人工飼料飼喂菲牛蛭性腺成熟時間與周期

精小葉的小葉腔隙中是否充滿大量的成熟精子是判斷精母細胞成熟的標志，而卵黃的發生是卵子發育過程中極為重要的代謝活動，是卵母細胞能否發育成熟的關鍵。本實驗切片觀察可知，7月29日飼喂人工飼料前的菲牛蛭生精囊中出現少量精子，此為組織學雄性生殖器官第Ⅳ時期；8月24日飼喂人工飼料前的菲牛蛭生精囊破裂，精小葉的小葉腔隙中充滿大量精子，精母細胞成熟，此為組織學雄性生殖器官第Ⅴ時期。8月8日飼喂人工飼料前的菲牛蛭卵母細胞出現放射狀的卵黃顆粒，此為組織學雌性生殖器官第Ⅲ時期；9月9日飼喂人工飼料前的菲牛蛭卵黃顆粒在卵母細胞聚集呈卵黃，并充滿整個卵母細胞，此為組織學雌性生殖器官第Ⅴ時期。因此，由以上結論推出菲牛蛭是雄性先成熟個體，這與張斌[10]報道一致。

4 小結

通過本實驗可得知，平均質量為1.24±0.13 g的亞成體菲牛蛭在夏季自然變溫和光照條件下，經過三個多月14次人工飼料的飼喂，部分菲牛蛭性腺出現生殖環帶，性腺成熟。其成熟時間遠低于譚恩光[16]報道的廣東菲牛蛭在自然變溫和光照在60 W燈泡，早上8：00 亮燈， 17：30 熄燈， 下雨天不亮燈條件下，菲牛蛭從亞成體通過3次飼喂飼料，10個月才發現菲牛蛭有生殖環帶，完成一個生命周期所用的時間，因而適當的增強飼料的飼喂頻率，可以有助于菲牛蛭性腺早日成熟。

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（收稿日期：2017-02-03）