抗菌肽基因工程化研究進展

李忠強　鄭偉　閆春梅　韓葉

摘 要 作為最具潛力的抗生素替代藥物，抗菌肽業已成為業界研究重點。為了解決抗菌肽因產量低，生產成本高而無法大規模生產及應用的難題，研究人員適時引入了基因工程技術，人工構建抗菌肽基因，進而研發基因工程抗菌肽藥物。本文分析了抗菌肽基因工程化的研究歷程，為抗菌肽的深入研究及廣泛應用添磚加瓦。

關鍵詞 抗菌肽；基因工程

中圖分類號 Q7 文獻標識碼 A 文章編號 2095-6363（2017）11-0027-02

基因工程技術在傳統生產中的應用，生產高效低毒的新型抗生素是中國今后發展生物醫藥的重點之一。抗菌肽是生物體天然免疫的重要組成部分，是應對病原物質侵染而產生的免疫應答產物[1]，在生物體的整個防御體系中有著顯著的作用。抗菌肽也是一種新型的多肽藥物——一類膜活性多肽，同時具備抗霉菌、廣譜殺菌、抑病毒、抑殺腫瘤細胞等多重功效。作為一種最具潛力的新型抗生素，降低成本、提高產量是對抗菌肽研究及廣泛應用的基本要求。目前廣大科研工作者致力于研究運用基因工程技術構建新型抗菌肽基因，再經微生物培養得到相應抗菌肽，希望最終能得到新型基因工程抗菌肽型抗生素。另外，對抗菌肽基因工程改良動物或植物的研究早已展開，目前已獲得具有轉抗菌肽基因動植物，均具有較高抗病性。近期研究中，由于大腸桿菌表達系統表達效率高、成本低，也成為抗菌肽基因工程表達的良好方式。

1 抗菌肽基因表達

對于基因表達，較常用的方法包括原核表達和真核表達。目前原核表達多采用大腸桿菌工程菌（E.coli）；真核表達包括酵母表達、桿狀病毒表達等。針對抗菌肽基因表達研究，目前在原核表達和真核表達方面均有

開展。

1.1 原核表達

抗菌肽，因其對宿主菌E.coli有很強的殺傷力而不能直接表達[2]。目前為止，對抗菌肽的原核表達多采用先融合表達再裂解純化的方法。早在1994年，在E.coli中將鏈霉素枯草桿菌蛋白酶抑制物（SSI）與蜜蜂抗菌肽apidaecin 1b（AP1）融合表達，得出了SSI-AP1融合蛋白[3]。之后，以硫氧還蛋白作為載體，融合人源抗菌肽LL-37[4]、抗菌肽ranalexin[5]在E.coli中表達，均得到高表達量蛋白。除此之外，谷胱甘肽轉移酶GST和泛素相關小蛋白修飾SUMO，均可作為載體，促進抗菌肽在E.coli中進行可溶性表達[6]。另外，類固醇異構酶、PaP3.30、TAF12組蛋白折疊結構域和Purf片段等可促進抗菌肽在E.coli中進行包涵體

表達[7]。

1.2 在酵母中真核表達

采用酵母系統表達抗菌肽基因是當前應用最廣泛的方法，1999年就有在釀酒酵母中表達出sarcotoxin 1A的報道，并成功檢測到與成熟sarcotoxin 1A分子量相近的肽[8]。2003年，劉忠淵等利用酵母表達系統成功表達了對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有抑制性的新疆家蠶抗菌肽cecropin基因，抑菌圈達1.5cm[9]。2004年，張素芳等[10]成功構建了分泌型重組酵母表達載體p PICZA-A-mag和p PICZA-A-CM，獲得了類似天然抗菌肽大小的magainin及cec A-mil蛋白。兩者對金黃色葡萄球菌及E.coli均有較好的抑殺性。2016年，陳騫等通過Infusion技術成功構建了pPIC9K-CAMPs和pPICZαA-CAMPs重組質粒。通過電轉化將線性化pPIC9K-CAMPs轉入畢赤酵母GS115基因組中，篩選高拷貝菌株GS-PK-CAMPs。再將線性化pPICZαA-CAMPs轉入重組酵母GS-PK-CAMPs中，篩選出高拷貝菌株GS-PKZ-CAMPs。最終成功獲得了GS-PKZ-CAMPs可誘導表達菌株[11]。

1.3 在桿狀病毒中表達

利用桿狀病毒表達系統表達抗菌肽也是當前抗菌肽基因工程表達研究中應用較廣泛的方法。2001年，趙東紅利用Bac to Bac桿狀病毒表達系統在甜菜夜蛾蟲體中成功表達出了中國家蠶抗菌肽人工合成類CMIV基因[12]。2008年，趙昆等在昆蟲桿狀病毒系統中成功表達了牛抗菌肽Bac7-Bac5-β defense串聯基因，構建了重組轉座載體，轉化DH10 Bac大腸桿菌感受態細胞，獲得重組桿狀病毒穿梭載體，最終獲得了具有抑菌活性的重組蛋白[13]。2013年，劉暉等也采用Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統，成功構建了含家蠅抗菌肽attacin重組桿狀病毒表達載體[14]。

2 轉抗菌肽基因動物

2.1 昆蟲

現階段下，在我國國內關于轉基因動物的研究已經如火如荼，如何將具有抗病性的抗菌肽基因轉化到動物體內，用以提高動物體的抗病力成為國內外研究人員關注的焦點，經多年研究，業已取得了一些進展。早在1998年，Possani LD 等成功構建了一種轉抗菌肽基因蚊子，利用蚊子腸道合成并分泌shiva 3抗菌肽基因，用來控制瘧疾的傳播，取得了一定的成效[15]。

2001年，趙東紅等構建了轉抗菌肽基因甜菜夜蛾幼蟲，在蟲體內檢測到有類CMIV mRNA的存在，并在蟲體血淋巴中檢測到抗菌活性[12]。

2.2 鼠

在國內外，鼠類是研究轉基因動物最常實驗的動物模型。為了提高整合效率，在外源基因的兩端加上具有隔離作用的MAR序列和微衛星序列，與染色體上的微衛星序列同源重組，已達到預期效果。可以把編碼抗菌肽的基因轉入到指定的細胞內表達。

董銳選用豬源抗菌肽PR39構建了表達載體pCMS-EGFP-PR39，經原核顯微注射法，制備了8只F0代轉PR39基因小鼠，通過人工感染豬胸膜肺炎放線桿菌，比較了轉PR39基因小鼠與其同窩的野生型小鼠之間的抑菌能力差異。證明了轉基因表達PR39可顯著增強轉基因小鼠對細菌的抵抗力[16]。

3 轉抗菌肽基因植物

植物轉基因的研究方法日趨成熟。抗菌肽被應用于培育抗病新品種，如抗菌煙草、水稻抗白葉枯病等。另外，抗菌肽轉入植物具有明顯的殺蟲作用。韋鵬飛以轉抗菌肽D基因的中華獼猴桃抗性芽為材料，通過誘導生根和移栽獲得獼猴桃盆栽苗。對盆栽苗進行PCR和RT-PCR鑒定表明，抗菌肽D基因已經整合到獼猴桃基因組中，并進行了轉錄。對盆栽苗葉片中的過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性分析結果表明，在噴施獼猴桃細菌性潰瘍病病原菌的條件下，轉基因植株的CAT和POD活性比未轉基因植株明顯降低，PAL活性比未轉基因植株明顯升高[17]。

4 抗菌肽基因改造前景

抗菌肽基因分子量小，其表達產物容易降解，檢測和純化都有一定困難，即使融合蛋白的表達量較高，目的蛋白的表達策略也很準確，但要獲取表達量較高的目的蛋白仍然非常困難。當高拷貝基因串聯時，基因之間必須首尾同向相連，否則會引起質粒的不穩定，同時導致反向基因表達的蛋白錯誤，這將會很大程度上提高串聯構建的難度性。目前，國內外學者逐步致力于從分子角度改造抗菌肽并優化抗菌肽的表達[18]。諸如氨基酸殘基設計[19]、肽片段拼接設計[20]、肽鏈環合設計[21]、靶向設計[22]、多基因共表達[23]等。均獲得了一定的科研成果，為抗菌肽基因工程化改造注入了新鮮活力。隨著科學研究手段和方法的日趨完善，抗菌肽基因改造也勢必迎來廣闊的發展空間，為提高動植物的抗病力提供強大的科技支撐。

參考文獻

[1]N. Fujitani， S. i. Kawabata， T. Osaki， Y. Kumaki， M. Demura， K. Nitta， and K. Kawano. Structure of the Antimicrobial Peptide Tachystatin A. J. Biol. Chem.， June 28，2002，277（26）：23651-23657.

[2]T. Suetake， T. Aizawa， N. Koganesawa， T. Osaki， Y. Kobashigawa， M. Demura， S. –i. Kawabata， K. Kawano， S. Tsuda and K. Nitta.Production and characterization of recombinant tachycitin， the Cys-rich chitin-binding protein.Protein Eng. Des.Sel， October 1，2002，15（9）：763-769.

[3]S. Taguchi， K. Nakagawa， M. Maeno and H. Momose.In vivo monitoring system for structure-function relationship analysis of the antibacterial peptide apidaecin.Appl Environ Microbiol. 1994，60（10）：3566-3572.

[4]Li Y F. A novel protocol for the production of recombinant LL-37 expressed as a thioredoxin fusion protein. Protein ExprPurif， 2012，81（2）：201-210

[5]Aleinein R A ， Hamoud R， Schafer H， et al. Molecular cloning and expression of ranalexin， a bioactive antimicrobial peptide from Ranacatesbeiana in Escherichia coli and assessments of its biological activities. ApplMicrobiolBiotechnol，2013，97（8）：3535-3543.

[6]祁麗，姜寧，張愛忠，等.抗菌肽研發現狀及其改造策略[J].中國畜牧獸醫，2016，43（2）：450-456.

[7]張學敏，金莉莉，王錚，等.抗菌肽在大腸桿菌中的融合表達[J].生物工程學報，2014，30（8）：1172-1181.

[8]Aly R et al. Saccharomyces cerevisiae cell harboring the gene encoding sarcotoxin IA secrete a peptide that is toxic to plant pathogenic bacteria. Protein ExprPurif， 1999（16）：1120-1124.

[9]劉忠淵，張富春，蔡倫，等.酵母菌中表達的新疆家蠶抗菌肽（Cecropin-XJ）的特性研究[J].微生物學報，2003，43（5）：635-641.

[10]張素芳，賈赟，蔡梅紅，等.Magainin和cecA-mil抗菌肽基因的密碼子優化及在畢赤酵母中的高效表達[J].中國生物工程雜志，2004，7（24）：93-97.

[11]陳騫，萬小平，肖永樂，等.豬融合抗菌肽基因雙質粒共轉化重組畢赤酵母菌的構建[J].四川畜牧獸醫，2016（12）：28-31.

[12]趙東紅，戴祝英，周開亞，等.中國家蠶抗菌肽人工合成類CMIV基因在甜菜夜蛾蟲體中的表達[J].微生物學報，2001，41（6）：680-685.

[13]趙昆，劉思國，王春來，等.牛抗菌肽Bac7-Bac5-βdefense串聯基因在昆蟲桿狀病毒系統中的表達及其產物的活性分析[J].農業生物技術學報，2008（3）：

380-384.

[14]劉暉，王鑫，蔡輝霞，等.抗菌肽attacin重組桿狀病毒表達載體構建[J].中國公共衛生，2013，12（29）：1871-1872.

[15]Possani L D et al. From noxiustoxin to Shiva-3， a peptide toxic to the sporogonic development of Plasmodium berghei.Toxicon， 1998， 36（11）：1683-1692.

[16]董銳.轉抗菌肽PR39基因小鼠的制備及研究[D].廣州：華南農業大學，2016.

[17]韋鵬飛，申炎龍，葉霞，等.轉抗菌肽D基因中華獼猴桃的鑒定及抗病性相關酶活性研究[J].河南農業科學，2016， 5（26）：130-134.

[18]張慶華，王青，尚田田，等.抗菌肽的活性機制及其分子設計研究進展[J].中國畜牧獸醫，2014，41（5）：163-167.

[19]馬清泉，懂娜，曹艷萍，等.利用精氨酸和纈氨酸設計新型ɑ-螺旋抗菌肽[J].微生物學報，2011（3）：346-351.

[20]Xu X， Jin F， Yu X， et al. High-level exression of the recombinant hybrid peptide cecropinA（1-8）-magainin2（1-12） with an ubiquitin fusion partner in Escherichia coli[J]. Protein Expression and Purification， 2007， 55（1）：175-182.

[21]Chan L Y， Zhang V M， Huang Y H， et al. Cyclization of the antimicrobial peptide gomesin with native chemical ligation： Influences on stability and bioactivity[J]. Chem Bio Chem，2013，14（5）：617-624.

[22]文陽安.抗菌肽PR39靶向巨噬細胞表達抗胞內菌感染研究[D].重慶：重慶醫科大學，2008.

[23]Shin J R， Lim K J， Kim Da J， et al. Display of multimeric antimicrobial peptides on the Escherichia coli cell surface and its application as whole-well antibiotics[J]. PloS One，2013，8（3）：e58997.