白腐真菌預(yù)處理對柳枝稷降解的影響

李 敏， 林炎麗， 楊富裕,2*

(1. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院， 北京100193； 2. 國家能源非糧生物質(zhì)原料研發(fā)中心， 北京100193； 3. 北京助爾生物科學(xué)研究院， 北京100085)

柳枝稷(PanicumvirgatumL.)原產(chǎn)于北美地區(qū)，是禾本科黍?qū)僦参?，也是C4植物，對水分的利用率特別高，可用于放牧、造紙、水土保持以及生態(tài)建設(shè)等[1-3]。美國首先把柳枝稷作為一種模式能源作物進(jìn)行系統(tǒng)的研究，此后在國際上掀起了對柳枝稷的研究熱潮。有研究表明，用柳枝稷生產(chǎn)出來的乙醇產(chǎn)生的能量，是柳枝稷在生產(chǎn)、收割和運輸植物以及將其轉(zhuǎn)化為乙醇等相關(guān)過程所消耗能量的5倍[4]。柳枝稷作為一種重要的能源草，歐美各國很多年前就將其作為能源植物進(jìn)行研究，并大規(guī)模低成本地利用柳枝稷生產(chǎn)清潔能源[5]。近年來，我國對生物質(zhì)能源的發(fā)展也日益重視，利用木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化生產(chǎn)乙醇已經(jīng)成為全球的研究熱點[6-7]。而利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)乙醇，必須要解決的問題就是對原料進(jìn)行預(yù)處理，通過改變木質(zhì)纖維素原料的結(jié)構(gòu)，將木質(zhì)素減少，破壞木質(zhì)素和半纖維素對纖維素的包圍，暴露更多的纖維素并使其更易轉(zhuǎn)化為可利用的糖[8]。有研究表明，木質(zhì)素的降解程度與葡萄糖和乙醇的生產(chǎn)率均呈現(xiàn)顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.9328和0.9270，即木質(zhì)素的降解率越高，后期糖化及發(fā)酵得到的葡萄糖和乙醇就越多[9]。目前預(yù)處理方法很多(如物理法、化學(xué)法及物化結(jié)合法等)，但大多存在成本高，效率低和污染嚴(yán)重等問題。生物處理法因能耗低、成本低、無污染等優(yōu)勢成為目前研究的熱點[10-11]。

本試驗選取目前研究較多且對秸稈降解效果較好的3種白腐真菌即：黃孢原毛平革菌[12](Phanerochaetechrysosporium)、乳白耙菌[9](Irpexlacteus)、蟲擬蠟菌[13-14](Ceriporiopsissubvermispora)及其混合真菌對柳枝稷(PanicumvirgatumL.)進(jìn)行預(yù)處理，研究白腐真菌種類、預(yù)處理時間、溫度、含水量和菌液量這些因素對柳枝稷木質(zhì)素降解的影響，為白腐真菌對柳枝稷的生物預(yù)處理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)購買自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心，乳白耙菌(Irpexlacteus) 購買自中國普通微生物菌種保藏中心，蟲擬蠟菌(Ceriporiopsissubvermispora)購買自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心，將這3株白腐真菌保存于土豆培養(yǎng)基并放入4°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

柳枝稷來源于北京涿州，自然曬干，粉碎過40目篩，放于自封袋保存，使用之前65°C烘干。原料柳枝稷的纖維素、半纖維素、酸性洗滌木質(zhì)素的含量分別是36.22%, 33.74%, 8.08%。

綜合PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，KH2PO43 g，維生素B1微量，自然pH。滅菌鍋121°C滅菌15 min。

1.2 試驗方法

1.2.1菌液制備 選取單一菌種菌絲長勢旺盛的平板，取菌苔前端接種到液體培養(yǎng)基中，并在28°C恒溫?fù)u床(180 r·min-1)培養(yǎng)4 d，長出白色可見的菌絲球，即可作為菌液使用?；旌险婢木杭礊椴煌N的單一菌液同比例混合。

1.2.2白腐真菌拮抗試驗 將活化后的白腐真菌兩兩對點接種到同一PDA 培養(yǎng)基平板上，接種點之間的距離約為3 cm，28°C恒溫培養(yǎng)6天，每組兩個重復(fù)，觀察菌落的生長狀況及菌絲相容情況。

1.2.3白腐真菌種類及時間對柳枝稷降解的研究 本實驗總共分為7組，H表示黃孢原毛平革菌處理組；R表示乳白耙菌處理組；C表示蟲擬蠟菌處理組；HR表示黃孢原毛平革菌與乳白耙菌的混合處理組；HC表示黃孢原毛平革菌與蟲擬蠟菌的混合處理組；RC表示乳白耙菌與蟲擬蠟菌的混合處理組；HRC表示3種白腐真菌的混合處理組。具體試驗方案如下：

稱取2 g烘干的柳枝稷至100 mL三角瓶中，加入5 mL蒸餾水，8層紗布封口，121°C高壓滅菌15 min。冷卻至室溫后，在超凈臺工作，分別吸取7個組2 mL菌液至裝有柳枝稷的三角瓶中，總共分為6批，攪拌均勻后封口放入恒溫培養(yǎng)箱28°C下培養(yǎng)。分別在第5, 10, 15, 20, 25, 30 d取一批樣品，過濾取樣，測定中性洗滌纖維(neutral detergent fiber, NDF)、酸性洗滌纖維(acid detergent fiber, ADF)、酸性洗滌木質(zhì)素(acid detergent lignin, ADL)含量。所有樣品重復(fù)3次，取檢測值平均值。

中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、酸性洗滌木質(zhì)素含量的測定采用濾袋技術(shù)和范氏纖維測定法[15]。

纖維素降解率、半纖維素降解率、木質(zhì)素降解率計算公式如下：

1.2.4溫度、水分、菌液量對乳白耙菌降解柳枝稷的研究 采用正交試驗設(shè)計法，考察溫度、水分、菌液量3因子對乳白耙菌生物預(yù)處理柳枝稷的影響。稱取2 g烘干的柳枝稷至100 mL三角瓶中，加入的蒸餾水設(shè)置3個濃度梯度分別為3 mL, 5 mL, 7 mL，8層紗布封口，121°C高壓滅菌15 min。冷卻至室溫后，加入乳白耙菌菌液，且設(shè)置3個濃度梯度分別為1 mL, 2 mL, 3 mL，分別放在 20°C, 28°C, 37°C3個恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 d，每個恒溫箱有9個組，每組樣品有3個重復(fù)，本次試驗總共有81個三角瓶樣品。在第20 d時過濾取樣，測定NDF、ADF和ADL含量。所有樣品重復(fù)3次，取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Excel軟件進(jìn)行簡單的數(shù)據(jù)處理和圖表制作，并用SPSS 18.0中的ANOVA程序?qū)嶒灲Y(jié)果進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 白腐真菌拮抗試驗結(jié)果

每組兩個重復(fù)，黃孢原毛平革菌(H)、乳白耙菌(R)和蟲擬蠟菌(C)3個菌種在恒溫箱培養(yǎng)至第6天的生長拮抗關(guān)系如圖1所示：在第6天，黃孢原毛平革菌的粉孢子、乳白耙菌的菌絲生長迅速且濃密，蟲擬蠟菌的菌絲生長緩慢，只在一小片區(qū)域生長，與其他兩個菌種沒有競爭優(yōu)勢，但3種白腐真菌兩兩之間均無拮抗反應(yīng)，沒有產(chǎn)生相互抑制的現(xiàn)象。結(jié)果表明，黃孢原毛平革菌、乳白耙菌和蟲擬蠟菌兩兩之間可以共同培養(yǎng)，混合生長。

圖1 白腐真菌的拮抗試驗Fig.1 Antagonism test of three white rot fungi

2.2 白腐真菌種類及時間對柳枝稷降解的影響

在白腐真菌30 d的降解中，纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的相對含量發(fā)生了變化，從圖2可以看出，半纖維素降解率整體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，除了黃孢原毛平革菌處理組(H)在第10天降解率達(dá)到最高值為10.8%，其他處理組都在預(yù)處理第15天達(dá)到最高降解率。在第15天，乳白耙菌處理組(R)、蟲擬蠟菌處理組(C)、乳白耙菌與蟲擬蠟菌的混合處理組(RC)、黃孢原毛平革菌與乳白耙菌混合處理組(HR)、3種白腐真菌的混合處理組(HRC)、黃孢原毛平革菌與蟲擬蠟菌處理組(HC)的半纖維素降解率分別為18.09%, 15.04%, 14.30%, 13.76%, 12.44%, 12.08%。

圖2 半纖維素降解率的變化Fig.2 The change of hemicellulose degradation rate

從圖3可以看到，纖維素降解率變化上下浮動不大，變化都在±8%以內(nèi)。從第20天開始，乳白耙菌處理組(R)和黃孢原毛平革菌處理組(H)的纖維素降解率一直都比其他處理組低。乳白耙菌與蟲擬蠟菌的混合處理組(RC)的纖維素降解率在第30天時達(dá)到最高為5.81%，另外黃孢原毛平革菌與蟲擬蠟菌的混合處理組(HC)、黃孢原毛平革菌與乳白耙菌的混合處理組(HR)、蟲擬蠟菌處理組(C)、3種白腐真菌的混合處理組(HRC)在第30天的降解率分別為5.67%, 5.43%, 4.92%, 4.44%。

圖3 纖維素降解率的變化Fig.3 The change of cellulose degradation rate

從圖4中可以看到，乳白耙菌處理組(R)的木質(zhì)素降解率變化比較明顯，且在第20天時達(dá)到最高值為36.63%，黃孢原毛平革菌與乳白耙菌混合處理組(HR)木質(zhì)素降解率也在第20天時達(dá)到最高值為20.17%。黃孢原毛平革菌處理組(H)、黃孢原毛平革菌與蟲擬蠟菌的混合處理組(HC)、3種白腐真菌的混合處理組(HRC)在第10天的木質(zhì)素降解率最高分別為31.98%, 25.99%, 15.17%, 11.52%。蟲擬蠟菌處理組(C)在第5天的降解率最高為6.98%。乳白耙菌與蟲擬蠟菌的混合處理組(RC)在第15天的木質(zhì)素降解率最高為9.72%?？傮w來說，混合真菌處理組以及蟲擬蠟菌處理組(C)的木質(zhì)素降解率一直都不高，且在第30天時，木質(zhì)素降解率變成負(fù)值。

圖4 木質(zhì)素降解率的變化Fig.4 The change of lignin degradation rate

2.3 溫度、水分、菌液量對乳白耙菌降解柳枝稷的影響

從表5可知，當(dāng)溫度是28°C時，水分設(shè)置3個梯度為3 mL, 5 mL, 7 mL，乳白耙菌菌液量設(shè)置3個梯度1 mL, 2 mL, 3 mL，乳白耙菌對柳枝稷降解20 d的情況如表5：乳白耙菌對柳枝稷半纖維素、纖維素、木質(zhì)素的降解會受水分、菌液量的影響。第6, 7, 8, 9這4個組的半纖維素、木質(zhì)素、纖維素含量差異均不顯著，而且他們的木質(zhì)素含量比其他組低。第6組水分為5 mL，菌液量為3 mL時，木質(zhì)素含量最少，其降解率高達(dá)63.45%，與空白組(第0組)相比差異顯著(P<0.05)，半纖維素降解率為24.82%，纖維素含量和空白組差異不顯著。另外，第7, 8, 9這3個組的木質(zhì)素降解率分別為55.58%, 56.73%, 48.86%。

表5 溫度對柳枝稷降解效果的影響Table 5 Influence of temperature on the degradation effect of the switchgrass

注：同列標(biāo)有不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

Note: Different letters in the same column indicate significant differences at the 0.05 level, the same as below

從表6可知，當(dāng)水分為5 mL、菌液量為3 mL以及水分為7 mL、菌液量為2 mL時，乳白耙菌分別在溫度為20°C, 28°C, 37°C對柳枝稷降解的情況如表6所示：在同一溫度下，無論水分為5 mL、菌液量為3 mL還是水分為7 mL、菌液量為2 mL時，其半纖維素、木質(zhì)素含量差異不顯著，纖維素含量在20°C、28°C條件下差異也不顯著；當(dāng)水分、菌液量組合固定時，在20°C, 28°C, 37°C這3個溫度環(huán)境條件下，纖維素含量差異不顯著，但半纖維素、木質(zhì)素含量都是在28°C溫度條件下較低，且與其他溫度條件(20°C, 37°C)相比差異顯著(P<0.05)。

表6 水分、菌液量對柳枝稷降解效果的影響Table 6 Influence of water and inoculum on the degradation effect of the switchgrass

3 討論

3.1 白腐真菌種類及時間對柳枝稷降解的分析

柳枝稷是一種重要的木質(zhì)纖維作物，但其高木質(zhì)素含量嚴(yán)重制約其作為能源植物的開發(fā)和利用[16]。在本試驗，白腐真菌生物預(yù)處理柳枝稷30 d的過程中，木質(zhì)素降解程度比較大，而半纖維素含量變化相對較小，纖維素含量變化不大，表明這3種白腐真菌在生物預(yù)處理過程中可以選擇性地降解柳枝稷纖維組分中的木質(zhì)素和半纖維素，保留及暴露更多的纖維素。這與前人研究相似，宋麗麗[9]研究了乳白粑菌玉米秸稈的預(yù)處理對纖維組分的影響，發(fā)現(xiàn)乳白耙菌可以選擇性降解玉米秸稈中的半纖維素和木質(zhì)素，在生物預(yù)處理的第28天，半纖維素和木質(zhì)素分別降解了28.24%和25.46%，纖維素得到了較大程度的保留。在3種單一白腐真菌處理中，乳白耙菌(R)在第20天的木質(zhì)素降解率最高為36.63%，且半纖維素降解率為17.29%，此時，纖維素降解率為負(fù)值，這可能是因為乳白耙菌對柳枝稷生物預(yù)處理前期以半纖維素、木質(zhì)素為底物，因而半纖維素、木質(zhì)素的含量降低了，而纖維素的含量沒變化，所以纖維素的相對含量增加，從而使纖維素降解率為負(fù)值。研究表明，白腐真菌對秸稈等木質(zhì)纖維素的去木質(zhì)化作用是增強酶解的主要原因[17]。而本試驗中黃孢原毛平革菌處理組(H)第10天的木質(zhì)素降解率最高為31.98%，蟲擬蠟菌處理組(C)第5天木質(zhì)素降解率最高為6.98%，都低于乳白耙菌對木質(zhì)素的降解率，因此，乳白耙菌對柳枝稷的生物預(yù)處理效果最好。

白腐真菌混合處理組對柳枝稷木質(zhì)素的最高降解率低于乳白耙菌處理組(R)和黃孢原毛平革菌處理組(H)，但高于蟲擬蠟菌處理組(C)?；旌咸幚斫M對木質(zhì)素降解率較低，對纖維素的降解率反而稍微高些，如乳白耙菌與蟲擬蠟菌的混合處理組(RC)在第15天的木質(zhì)素降解率最高為9.72%，其纖維素降解率達(dá)到5.81%，且在生物預(yù)處理后期，白腐真菌混合處理組(如HC, RC, HRC)的木質(zhì)素降解率反而成為負(fù)值，即后期木質(zhì)素含量反而有所增加。這與前人研究相似，Liu等[18]研究密孔菌(Pycnoporussp.)處理柳枝稷時，發(fā)現(xiàn)隨著預(yù)處理時間延長，酸性洗滌木質(zhì)素的含量呈先降低后增加的趨勢，72 d后酸性洗滌木質(zhì)素的含量反而超過了對照組。原因可能是在生物預(yù)處理過程中，其他成分減少，如纖維素被降解生成糖供白腐真菌自身生長利用，或者是底物濃度降低，而導(dǎo)致木質(zhì)素相對含量增加，從而導(dǎo)致木質(zhì)素降解率變?yōu)樨?fù)值。

3.2 溫度、水分、菌液量對乳白耙菌降解柳枝稷的分析

在微生物降解秸稈過程中，菌種的接種量以及培養(yǎng)物的氣體交換是影響白腐真菌降解秸稈的重要因素[19]，培養(yǎng)物中的氣體交換量是由秸稈與水分的相對含量之比決定。菌種接種量過大，菌體會因生長過快而對有限營養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生競爭活動和過多代謝產(chǎn)物，從而影響酶的產(chǎn)生；菌種接種量過小，分泌的酶量較少，導(dǎo)致底物過剩，從而影響預(yù)處理的效果[20-21]。水分含量過高嚴(yán)重降低了乳白耙菌對氧氣的吸收和對二氧化碳的排出；水分含量過低時，乳白耙菌的菌絲不能很好的延長以及自身生長受到限制[22]。本試驗中，在28°C下，柳枝稷被乳白耙菌降解20 d后，第6, 7, 8, 9這四組的木質(zhì)素降解率較高，分別為：63.45%, 55.58%, 56.73%, 48.86%。但第6組即當(dāng)水分為5 mL，菌液量為3 mL時，木質(zhì)素含量最少，其降解率為63.45%，半纖維素降解率為24.82%，而且纖維素含量和空白組差異不顯著。

發(fā)酵過程中的溫度、時間、水分、pH及其交互作用等因素均會對發(fā)酵產(chǎn)生影響，對固態(tài)發(fā)酵而言，溫度是首要因素[23]。合適的溫度對于微生物預(yù)處理至關(guān)重要，王蕾等[24]研究溫度(在37℃～ 45°C范圍內(nèi))對多孔菌(Polyporusvarius)預(yù)處理蘆葦?shù)挠绊?，結(jié)果表明，隨著預(yù)處理溫度的升高，木質(zhì)素的降解率先升高后下降，最適預(yù)處理溫度為41°C。本試驗中無論水分為5 mL、菌液量為3 mL還是水分為7 mL、菌液量為2 mL，都是在28°C溫度下，柳枝稷的木質(zhì)素降解率最高，且與其他溫度(20°C, 37°C)相比差異顯著(P<0.05)。

因此，乳白耙菌對柳枝稷(2 g)進(jìn)行生物預(yù)處理20 d的最適條件為：水分5 mL、菌液量為3 mL、溫度為28°C，此時木質(zhì)素降解率為63.45%，半纖維素降解率為24.82%，而且纖維素含量與空白組差異不顯著，與優(yōu)化前相比，效率提高。

4 結(jié)論

黃孢原毛平革菌、乳白耙菌、蟲擬蠟菌相互之間沒有拮抗反應(yīng)，可以混合培養(yǎng)，為后續(xù)試驗的混合培養(yǎng)提供了基礎(chǔ)。在30 d的預(yù)處理過程中，混合真菌對柳枝稷的生物預(yù)處理與單一白腐真菌相比，并沒有優(yōu)勢，預(yù)處理效果并不好。在單一白腐真菌中，乳白耙菌對柳枝稷的木質(zhì)素降解率最高，預(yù)處理效果最好，其最佳預(yù)處理時間為20 d。